重组人干扰素α2b喷雾剂在治疗小儿手足口病的护理应用及体会

目的 探讨重组人干扰素α2b喷雾剂在治疗小儿手足口病的护理应用及体会.方法 对46例手足口病患儿采用α2b喷雾剂直接喷于患处.结果 46例患儿中有效率为67.39％和显效率32.61％.结论 重组人干扰素α2b喷雾剂是治疗手足口病的有效外用药.     

绿色荧光蛋白干扰素-α2b融合基因的构建与表达

干扰素-α2b（IFN-α2b）作为治疗慢性乙肝、丙肝的首选药物，已成为医药生物技术产业的重要产品。目前研究IFN与其受体的作用关系多采用酶联免疫吸附法，间接的分析IFN或测定其受体被封闭的情况，但在细胞水平直观实时的检测IFN与其受体相互作用关系的研究报道甚少。本研究利用来源于维多利亚水母的绿色荧光蛋白（GFP）作为分子标签，构建含有GFP与IFN-α2b融合基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达融合蛋白。     

重组人干扰素α2b阴道泡腾胶囊治疗 宫颈人乳头瘤病毒感染的临床研究

目的 研究重组人干扰素α2b阴道泡腾胶囊治疗宫颈人乳头瘤病毒感染的临床疗效。方法 选取我院2016年3月~2017年3月收治的96例HPV感染患者,采用随机数字表法将其分为实验组与参照组,各48例。实验组患者采用重组人干扰素α2b阴道泡腾胶囊治疗,参照组患者采用复方沙棘籽油栓治疗,对比两组患者的HPV转阴率、治疗有效率及HC2值,并观察不良反应。结果 实验组患者的HPV转阴率为87.23%,高于参照组的33.33%,差异具有统计学意义（P＜0.05）。实验组患者的宫颈糜烂面治疗总有效率为91.67%,高于参照组的75.00%,差异具有统计学意义（P＜0.05）。疗程结束1个月时,两组的HC2值比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;实验组患者在3个月、6个月后的HC2值低于参照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。两组患者的不良反应比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 应用重组人干扰素α2b阴道泡腾胶囊治疗HPV感染,对促使HPV转阴、缩小宫颈糜烂面均有积极作用,且不良反应少、安全性高。     

重组人α2b干扰素胶囊抗小鼠阴道HSV-2感染的研究

目的 研究新剂型重组人干扰素(interferon,IFN)α2b胶囊抗小鼠疱疹病毒性阴道炎的效果.方法 人工建造阴道感染HSV-2的小鼠模型,以不同剂量的IFNα2b对小鼠阴道局部用药,以阿昔洛韦(acyclovir,ACV)为阳性对照.观察药物干扰对模型小鼠发病率、死亡率及病程进展的影响.结果 试验药物能减少小鼠的病死数、发病数,减慢小鼠的病程进展,其中16000IU/天高剂量组效果最好,类似于ACV组的用药效果,4000IU/天的低剂量用药组效果最弱,8000IU/天中剂量组效果居中.结论 受试药物在小鼠体内具有良好的抗HSV-2感染所致阴道炎的作用.     

人干扰素α2b ELISA配体结合分析检测方法的建立

目的：建立金黄地鼠血浆和组织重组人干扰素α2b定量ELISA检测法,用于药物研发检测。方法：采用双抗夹心法建立金黄地鼠血浆和组织重组人干扰素α2b含量检测方法,确定其检测范围,验证其选择性、精密度与准确度和稀释线性,并对样本稳定性进行研究。结果：建立的方法检测范围为0.50～16.00 ng/ml。选择性结果显示不同个体来源空白金黄地鼠组血浆和组织匀浆无差异,血浆质控样本准确度为78.62%～104.69%,批内精密度为0.69%～18.21%,批间精密度为6.71%～15.81%,总误差均<30%,稀释线性良好。稳定性样本在3种不同保存条件（冰上放置2 h;-80～-75℃放置4 d;反复冻融3循环）下稳定性较好,回收率均在±20%内。结论：成功建立了基于配体结合的人干扰素α2b ELISA检测法,该方法灵敏度高,重复性好,检测效率高,为新药研发提供了可靠的检测方法。     

重组人干扰素α1b治疗小儿手足口病的临床疗效观察

目的 观察重组人干扰素α1b治疗小儿手足口病的临床疗效。方法 选择我院2018年6月~8月儿科门诊收治的手足口病患儿60例,随机分为治疗组和对照组,各30例。对照组患儿给予一般抗病毒对症治疗,治疗组在此基础上加用重组人干扰素α1b注射液治疗。观察两组患儿治疗后热退时间、咽部充血程度改善时间、口腔溃疡愈合时间及皮疹消退时间,比较两组患儿的临床疗效。结果 治疗组总有效率为93.33%,高于对照组的70.00%,差异有统计学意义（P＜0.05）;治疗组的热退时间、咽峡部充血程度改善时间、口腔溃疡愈合时间及皮疹消退时间均短于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 重组人干扰素α1b注射液治疗小儿手足口病疗效确切,可有效加快患者临床症状改善,缩短患儿病程。     

人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光(IFA)和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光(IFA)鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体蛋白。     

注射用重组人干扰素α2b联合黄芪注射液治疗小儿病毒性心肌炎的疗效研究

目的 探讨注射用重组人干扰素α2b联合黄芪注射液治疗小儿病毒性心肌炎的临床疗效.方法 将我院收治的86例病毒性心肌炎患儿,随机分为对照组和观察组,每组各43例.对照组患儿给予常规治疗,观察组患儿在常规治疗的基础上使用注射用重组人干扰素α2b联合黄芪注射液治疗.结果 观察组总有效率为93.02％,对照组总有效率65.12％,其差异具有统计学意义(P＜0.01).观察组患儿症状、体征恢复时间均少于对照组患儿症状、体征恢复时间,其差异具有统计学意义(P＜0.01).治疗后,观察组患儿的LDH(57.48±10.37) U/L、CK(151.83±75.63) U/L、CK-MB(23.69±11.26) U/L都低于对照组患儿的LDH(70.53±14.51) U/L、CK(204.27±95.64) U/L、CK-MB(45.15±18.47) U/L,差异具有统计学意义(P＜0.01).观察组的心电图恢复率为95.35％,高于对照组心电图恢复率74.42％,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 注射用重组人干扰素α2b和黄芪注射液联合治疗小儿病毒性心肌炎疗效显著.     

突变型人PRKAG2基因的克隆及其表达载体构建

目的构建含有定点突变的人PRKAG2基因表达载体。方法首先应用Trizol法抽提健康人全血mRNA,通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)克隆得到野生型人PRKAG2 cDNA;继而通过聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法获得突变型人PRKAG2基因,命名为G100S,最后应用酶切连接的方法得到重组载体pEGFP-G100S。结果Trizol法提取人细胞mRNA,经RT-PCR合成cDNA第一条链,特异性引物PCR扩增得到PRKAG2基因片段,目的片段条带在1 761 bp左右。分段克隆得到的G100S片段分别为300 bp与1 500 bp左右。转化Top10感受态细菌,PCR筛选阳性菌落5个克隆有3个克隆可见1 800 bp左右的阳性片段,筛选得到pEGFP-G100S重组阳性克隆。测序证实重组载体pEGFP-G100S构建成功。结论构建的含定点突变人PRKAG2基因重组载体pEGFP-G100S为进一步研究基因PRKAG2 G100S突变的功能奠定了基础。     

人ArgBP2基因真核表达载体的构建及其在胃癌细胞的表达

目的人ArgBP2基因真核表达载体的构建及其在胃癌细胞系中的表达。方法从人胃癌细胞系SCG7901中提取RNA,反转录为cDNA,并以此为模板,扩增ArgBP2的全长编码基因,并构建到真核表达载体pcDNA3.1/HisC中,同时应用Western blot方法检测其表达,然后利用RT-PCR方法检测在各种胃癌细胞系内源性ArgBP2的表达。结果人ArgBP2编码序列已被克隆至pcDNA3.1/HisC表达载体,双酶切鉴定片段大小为1935bp,Western blot验证其表达成功,大小为70kDa,并在RNA水平上检测ArgBP2在胃癌细胞系中的表达。结论成功构建了人ArgBP2基因真核表达载体,在胃癌细胞系表达,为进一步研究ArgBP2的生物学特性及其信号转导通路奠定了基础。     

携带mIL-12基因逆转录病毒载体的构建与表达

目的：构建携带小鼠IL-12（ mouse IL-12, mIL-12）基因逆转录病毒表达载体pLXmIL-12SN并检测其在B16F10细胞中的表达。 方法： 应用限制性内切酶从载体pGCp35-IRES-p40SN中酶切p35-IRES-p40（mIL-12基因片段）及将逆转录病毒载体pLXSN切开，通过连接酶连接，通过序列测定确定p35-IRES-p40基因片段正向插入载体pLXSN中的重组子，将阳性重组子转染B16F10细胞并通过RT-PCR方法检测mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结果： 成功地构建表达载体pLXmIL-12SN并可在mRNA水平检测到mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结论： 载体pLXmIL-12SN的构建成功及可在B16F10细胞中表达，为mIL-12基因治疗眼部疾病的研究奠定了基础和提供了借鉴。     

携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,SalⅠ/NotⅠ双酶切质粒pIRES2-EGFP-syno,得到含EGFP和人Synoviolin的基因片段,将其亚克隆至入门载体pENTR1A的多克隆位点内得到入门质粒pENTR1A-syno-egfp。采用LR重组酶将pENTR1A-syno-egfp和目的载体pLenti4/TO/V5-DEST进行重组反应,形成慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp。将pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞,包装产生慢病毒,以293FT细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR,酶切及测序结果表明慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp构建成功,转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒原液滴度为1×10~8TU/ml。结论成功构建了EGFP和Synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体,为Synoviolin基因的功能研究提供了高效稳定的转基因技术平台。     

人PSCA基因真核载体的构建与表达

目的 克隆人PSCA(prosaae stem cell antigen)分子的cDNA,构建PSCA基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 从PSCA阳性细胞系LNCaP中提取总RNA,逆转录为cDNA.根据编码人PSCA的基因序列设计引物,以cDNA为模板,采用PCR技术扩增PSCA基因,将该基因插入到pcDNA3.1(+)真核载体,构建pcDNA3.1(+)-PSCA表达质粒.经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pcDNA3.1(+)-PSCA转染Hela细胞,检测其体外瞬时表达.结果 测序证实得到人PSCA基因序列,序列分析显示没有发生无义突变.RT-PCR和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞有目的 基因和分子的表达.结论成功克隆人PSCA基因,并在真核细胞中获得表达,为进一步构建基于PSCA的肿瘤疫苗奠定了基础.     

人T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的构建人T细胞活化衔接因子（LAT）基因的真核表达载体。方法以人外周血单个核细胞的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆人真核细胞表达载体pCMV—Myc中,测序鉴定目的基因并运用核转染的方法转染人外周血T淋巴细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为729bp,以此构建重组质粒pCMV—Myc—LAT,测序结果与Genbank中的人LAT基因cDNA序列一致。转染人外周血T淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达。结论成功构建了pCMV—Myc—LAT重组真核表达载体。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

骨形成蛋白-7基因逆转录病毒载体的构建及其表达

目的：实现骨形成蛋白—7(BMP—7)基因在骨髓基质干细胞中的稳定、长久表达。方法：构建重组BMP—7逆转录病毒表达载体。通过PT67包装细胞克隆，嘌呤霉素筛选、扩增，获得含BMF—7基因的逆转录病毒液，直接感染骨髓基质干细胞，用免疫组化方法检测BMP—7的表达。结果：成功地构建了重组BMP—7逆转录病毒表达载体，并可在骨髓基质干细胞中表达BMP—7。结论：重组逆转录病毒表达载体转染的靶细胞可表达BMP—7，为组织工程中骨和软骨种子细胞的研究奠定了基础。     

鼠源轮状病毒vp7基因的表达载体构建及转基因植物的研究

目的：构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp7的植物表达载体及植物转化研究。方法：抗原基因vp7经PCR扩增后直接克隆到PUC－T载体，双酶切目的片断和植物表达载体，以T4连接酶将目的片断与载体相连接，电转化方式将重组质粒转入农杆菌。结果：以重组农杆菌为介导将靶基因转入到马铃薯外植体。成功地将目的基因定向克隆到表达载体，并转入到农杆菌中；以农杆菌为介导获得抗性转基因马铃薯植株。结论：通过PCR检测，初步确定轮状病毒外壳蛋白基因vp7已成功地整合到马铃薯植株中。     

携带增强绿色荧光蛋白基因的Id2真核表达载体构建

目的：构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体，为骨骼肌的组织工程研究提供有效的分子工具。方法：利用RT-PCR的方法扩增出Id2全长cDNA，利用T4 DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2 cDNA进行连接，构建克隆载体，经限制性内切酶EcoR1酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGF-C2真核表达载体，构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2，经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性；并通过细胞转染技术将Id2基因导入L6成肌细胞中。结果：经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向Id2 cDNA片段，获取了转染外源性Id2基因的L6细胞。结论：我们成功构建了同时携带有G418筛选位点和增强绿色荧光蛋白的Id2真核表达载体？     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a( )中,构建重组质粒pET28a( )-CIDE-3。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长为516bp的人CIDE-3基因片段。以构建的重组质粒pET28a( )-CIDE-3转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为23000的重组CIDE-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,表达量约占全菌蛋白的32%。结论:成功地构建了原核表达载体pET28a( )-CIDE-3,并表达出重组CIDE-3蛋白,为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。