大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨作用的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞在体外条件培养下的成骨能力，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法取大鼠骨髓基质干细胞进行体外培养，用倒置相差显微镜、钙染色、扫描电镜和X线能谱等手段观察细胞的生长情况和矿化能力。结果细胞呈贴壁型生长，形态为梭形或多角形，在条件培养液中这些细胞间不发生接触抑制，而是相互重叠成多层，形成钙化结节，与成骨细胞的特点相符合。碱性磷酸酶染色呈强阳性，结节钙染色阳性，X线能谱分析显示结节的主要组成元素为钙和磷。结论体外培养的大鼠骨髓基质干细胞具有与成骨细胞相似的形态特征，并能在体外形成钙化的新骨结节。     

小鼠骨髓基质细胞Kusa-Al体外成骨活性评价

目的：检测骨髓基质细胞系Kusa-Al体外成骨活性，分析其用于成骨细胞功能和分化机制研究的价值。方法：培养Kusa-Al细胞，在常规培养和成骨诱导培养条件下，分别检测细胞的体外成骨活性，包括碱性磷酸酶(ALP)活性、细胞钙沉积能力、体外矿化结节(CN)形成能力、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(0c)表达水平、NF-κB受体激活因子(RANKL)水平。结果：常规培养下，Kusa-Al细胞表现出较高碱性的ALP活性(约为0．75IU／mg)、一定的钙沉积能力，并可检测到OPN和OC表达，但无CN形成，RANKL蛋白低于可检测水平。诱导培养条件下，细胞ALP活性先升高后降低、钙沉积量持续升高、OPN和OC表达水平后期显著提高，汇片后3～7d检测到大量CN形成，汇片后24h可检测到RANKL蛋白。结论：Kusa-Al可能是一种成骨前体细胞，经诱导可以向成骨细胞分化，在体外表现出良好的成骨细胞活性。Kusa-Al细胞可作为成骨细胞功能及其分化机制研究的模型细胞。     

骨髓基质细胞体外培养成骨的研究进展

骨髓具有成骨潜能的现象在一百年前人们就观察到了。近年来,随着对成骨细胞来源和骨髓成骨潜能研究的深入,通过体内外培养骨髓基质细胞证实了骨髓成骨的细胞学基础是骨髓基质细胞中含有向成骨细胞系转化的骨祖细胞及基质干细胞,为临床研究及应用骨髓或骨髓基质细胞提供...     

成人正常骨髓基质细胞体外培养及生物学特性

目的：建立成人体外培养成骨细胞的生物学模型，研究其生物学特性，为用于骨组织工程的功能细胞提供实验基础。方法：将成人正常骨髓基质细胞在不同培养体系中培养，通过倒置显微镜观察、HE染色、四环素荧光标记等方法对细胞进行生物学特性研究。结果：培养细胞形态多样，有两个或两个以上的胞浆突起且相互连接，细胞呈叠加复层生长，形成细胞结节；胞浆碱性磷酸酶染色强阳性，在一定条件下可产生钙化结节，结节的四环素荧光标记呈阳性。结论：确认培养的骨髓基质细胞具有与成骨细胞相似的形态特征和生物学特征，并能在体外钙化形成钙化结节。     

骨髓基质细胞分化成骨的实验研究

将兔骨髓细胞悬液体外培养，造血细胞死亡或在换液时被清除，吸附于培养瓶壁上的基质细胞迅速增殖。ｌ周时有明显的集落形成，２周时汇合成层。把培养的成纤维样细胞移植到扩散中种植到兔腹腔。经过一段时问可以分化为骨、软骨和纤维结缔组织，从而证实骨髓基质中存在着可以分化成骨细胞和成软骨细胞的成骨前体细胞。     

小鼠骨髓基质细胞Kusa-A1体外成骨活性评价

目的:检测骨髓基质细胞系Kusa-A1体外成骨活性,分析其用于成骨细胞功能和分化机制研究的价值。方法:培养Kusa-A1细胞,在常规培养和成骨诱导培养条件下,分别检测细胞的体外成骨活性,包括碱性磷酸酶(ALP)活性、细胞钙沉积能力、体外矿化结节(CN)形成能力、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OC)表达水平、NF-κB受体激活因子(RANKL)水平。结果:常规培养下,Kusa-A1细胞表现出较高碱性的ALP活性(约为0. 75IU/mg)、一定的钙沉积能力,并可检测到OPN和OC表达,但无CN形成,RANKL蛋白低于可检测水平。诱导培养条件下,细胞ALP活性先升高后降低、钙沉积量持续升高、OPN和OC表达水平后期显著提高,汇片后3~7d检测到大量CN形成,汇片后24h可检测到RANKL蛋白。结论:Kusa-A1可能是一种成骨前体细胞,经诱导可以向成骨细胞分化,在体外表现出良好的成骨细胞活性。Kusa-A1细胞可作为成骨细胞功能及其分化机制研究的模型细胞。     

骨髓基质细胞体外培养及其生物学特性的研究

目的:建立一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型。并对其生物学特性进行研究。方法:选择大耳白兔骨髓基质细胞为材料进行体外成骨细胞培养实验,在不同培养体系中进行体外培养,通过倒置显微镜观察、透射电镜、扫描电镜、组织化学染色技术、钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性进行研究。结果:获得的细胞呈多种形态,有长短不一、大小不均的胞浆突起,且互相连接,细胞互相重叠呈复层生长,并形成细胞结节;胞浆丰富,富含线粒体、粗面内质网、高尔基体等,具有合成分泌功能旺盛的结构,与典型成骨细胞的形态结构相似。同时,胞浆富含碱性磷酸酶活性,在条件培养基中细胞发生钙化现象,这与典型成骨细胞的生物学特性相似。且获得的细胞在体外能连续传代,形态和功能不变。结论:我们认为用骨髓基质细胞为材料进行体外培养是成骨细胞体外培养的一种新型的生物学模型,为人工骨替代材料的研制、成骨细胞移植修复骨缺损等开辟了新的途径     

骨髓基质细胞的体外培养和成骨方向的诱导分化

目的:体外分离狗的骨髓基质细胞,诱导其成骨分化并鉴定成骨活性.方法:体外分离培养狗的骨髓基质细胞,传代培养中加入10-8rnol/L地塞米松、50 μg/ml维生素C和10mmol/L β-甘油磷酸钠进行诱导分化,进行细胞形态和增殖观察,矿化结节Von Kossa染色,细胞碱性磷酸酶染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色检测其成骨活性.结果:骨髓基质细胞经诱导后表现出明显的成骨活性,体外矿化结节Von Kossa钙染色阳性;传代细胞碱性磷酸酶染色阳性,酶活性＞80%,Ⅰ型胶原免疫组化染色强阳性.结论:体外分离培养的骨髓基质细胞中含有骨源性前体细胞,传代细胞具有较强的成骨潜能.     

兔成骨细胞体外培养及自体肌内成骨的实验研究

目的 :建立一种体外培养兔成骨细胞的生物学模型 ,并对其生物学特性及体内成骨能力进行研究。方法 :抽取日本大耳白兔骨髓液经离心后得骨髓单个核细胞 ,以1×106/ml的细胞浓度进行培养 ,经传代培养 ,通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜、透射电镜、碱磷酸酶 (alkalinephosphatase,ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和VonKossa钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性研究。然后将细胞与载体材料—膨体聚四氟乙烯(ePTFe)复合培养1周后回植自体兔肌肉内 ,4周、8周后分别取材 ,组织学方法观察其成骨能力。结果 :培养的细胞形态多样 ,呈集落样生长 ,可相互重叠成复层状 ,胞浆富含线粒体、粗面内质网和高尔基体 ,胞浆突起长短、粗细不等 ,互相连接。培养细胞富含ALP活性Ⅰ型胶原和VonKossa染色均阳性。这与典型成骨细胞的生物学特性相似。成骨细胞经体外增殖 ,与载体复合培养后生长良好。植入体内早期(4周时 )形成的骨基质结构疏松 ,周围仍有较多成骨细胞 ,晚期 (8周时 )则可见形成的骨样组织结构致密 ,内有骨细胞位于骨陷窝中 ,与典型的骨组织结构相似。结论 :用兔骨髓基质细胞在体外筛选、培养成骨细胞的方法是可行的     

犬骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外诱导分化为成骨细胞的方法和活性检测。方法:抽取犬骨髓3 mL,使用成骨条件培养液,贴壁法体外培养,将培养的第2、3代细胞进行透射电镜、流式细胞仪、生长曲线、碱性磷酸酶、Von Kossa和免疫组化等检测。结果:第2代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性表达;第3代细胞Von Kossa染色、骨桥素、骨涎蛋白和骨钙蛋白呈阳性表达;第3代细胞透射电镜显示高尔基体和线粒体丰富;流式细胞仪检测显示第3代处于S期的细胞比例较第2代增加。结论:犬骨髓基质细胞在体外能定向诱导分化为成骨细胞。     

纳米羟基磷灰石/胶原对富血小板血浆促进骨髓基质干细胞成骨向分化的影响

目的：探讨纳米羟基磷灰石/胶原（nHAC）作为支架材料对兔自体富血小板血浆（PRP）体外诱导兔骨髓基质干细胞（rBMSCs）向成骨细胞分化能力的影响。方法：兔自体PRP分别作用于与nHAC联合培养的rBMSCs及常规培养的rBMSCs,利用扫描电镜观察rBMSCs在nHAC上的生长情况;通过碱性磷酸酶（ALP）活性测定,骨钙素（OCN）含量测定,骨桥蛋白（opn）mRNA相对表达量的分析,比较两种培养条件下兔自体PRP诱导rBMSCs向成骨细胞分化能力上的差异。结果：联合培养的rBMSCs在nHAC上生长良好,其ALP活性、OCN含量均较常规培养明显增加,且opn mRNA相对表达量是常规培养组的4.78倍。结论：nHAC作为支架材料可明显提高兔自体PRP诱导rBMSCs向成骨细胞分化的能力。     

犬不同部位BMSCs对牙周膜细胞增殖和成骨分化的影响

目的:研究犬髂骨骨髓基质细胞(iliac bone marrow stromal cells,I-BMSCs)和犬颌骨骨髓基质细胞(maxilla bone marrow stromal cells,M-BMSCs)对犬牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)增殖和成骨分化的影响,了解不同部位来源的骨髓基质细胞对牙周膜细胞调控作用的差异性。方法:原代培养犬髂骨骨髓基质细胞、颌骨骨髓基质细胞和牙周膜细胞。分别建立犬髂骨和颌骨来源的骨髓基质细胞与牙周膜细胞的Transwell共培养体系;制备骨髓基质细胞条件培养液培养牙周膜细胞,MTT法检测牙周膜细胞生长曲线;利用实时荧光定量PCR法检测牙周膜细胞成骨相关基因核心结合因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的变化;Westernblot法检测牙周膜细胞Runx2和OCN蛋白的表达变化。结果:髂骨骨髓基质细胞条件培养液能促进牙周膜细胞的增殖;颌骨骨髓基质细胞条件培养液对牙周膜细胞增殖有抑制作用;QPCR检测到共培养组牙周膜细胞Runx2、OCN、ALP基因表达高于对照组,Westernblot检测到共培养组牙周膜细胞的Runx2和OCN的蛋白表达高于对照组,且颌骨骨髓基质细胞诱导牙周膜细胞成骨分化效果更显著。结论:犬颌骨骨髓基质细胞条件培养液可能会抑制牙周膜细胞的增殖,相较于髂骨骨髓基质细胞,颌骨骨髓基质细胞促进牙周膜细胞成骨分化效果更显著,颌骨骨髓基质细胞和牙周膜细胞共同作为种子细胞可能更有利于牙周组织再生。     

富血小板血浆对兔骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的:探讨自体富血小板血浆(PRP)对体外培养的兔骨髓基质细胞(rBMSCs)生物学特性的影响。方法:体外培养的rBMSCs分为实验组和对照组,实验组中加入含1%PRP的DMEM条件培养基,对照组为不含PRP的DMEM培养基,在不同时间点收集两组细胞,分别进行形态学观察、细胞周期分布和增殖指数测定、碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定、骨钙素(OCN)含量测定以及骨桥蛋白(OPN)mRNA相对表达量的分析。结果:实验组细胞具有成骨细胞的形态学特征;PRP作用7d后S期细胞比例较对照组明显增加,细胞增殖指数由22.89±1.24增至33.15±1.02,具有统计学意义(P<0.01);实验组ALP染色呈阳性,且ALP活性、OCN含量均较对照组明显提高,差异具有统计学意义;OPN mRNA相对表达量是对照组的3.48倍。结论:PRP可促进rBMSCs的增殖并可提高rBMSCs的体外成骨潜能,使其向成骨细胞转化。     

犬骨髓基质细胞体外培养和诱导分化的实验研究

目的：观察犬骨髓基质细胞在体外培养的条件及生物学特性,对其进行鉴定。方法：取犬骨髓分离培养骨髓基质细胞（BMSC）传代后,倒置相差显微镜观察其形态,免疫组化方法加以鉴定,生化检测Vonkossa染色鉴定其成骨能力。结果：原代培养20d后可分离得到骨髓基质细胞BMSC,生长形态相对稳定,具有成骨能力。结论：BM-SC具有贴壁生长特征,易分离扩增,增殖速度快,诱导分化具有成骨能力,可用于骨缺损的修复治疗。     

不同浓度bFGF对犬骨髓基质细胞增殖、分化影响的实验研究

目的：研究不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factot,bFGF）对体外培养的beagle犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal ceils,BMSCs）增殖和分化的影响。方法：体外培养第2代BMSCs的培养液中分别加入不同浓度（25、50、100、200ng／mL）的bFGF,连续6d倒置显微镜下动态观察BMSCs的形态和生长情况．行MTT比色、碱性磷酸酶（alkalin ephosphatase,ALP）活性定量检测、ALP和Von Kossa染色。结果：浓度为50ng／mL的bFGF可明显促进犬的BMSCs增殖（P〈0．05）,但无显著促进犬BMSCs分化的作用（P〉0．051。结论：bFGF能有效促进犬BMSCs的增殖,且与bFGF剂量有关。     

氯化镧对体外培养的犬骨髓基质细胞增殖的影响

目的:观察3种浓度的氯化镧(LaCl3,La3+)对体外培养的犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的影响。方法:用5.564×102、5.564、5.564×10-2μg/mL3种浓度的La3+干预第3代BMSCs,设空白对照组和50ng/mLBMP-2干预的阳性对照组。通过MTT法、碱性磷酸酶半定量检测分析La3+对BMSCs的影响。结果:5.564μg/mL La3+干预组BMSCs在第6、7天表现出较高的生长趋势;碱性磷酸酶半定量检测发现5.564μg/mL La3+干预组OD值均数明显高于另两个实验组均数(P<0.05)。结论:5.564μg/mL浓度的La3+可促进BMSCs增殖。     

甲状旁腺素对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs成骨分化的影响

目的:研究甲状旁腺素(PTH)在持续性或间歇性作用方式下对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs分化和骨质形成的影响.方法:根据PTH应用方式不同分为3组:PTH持续应用组、PTH间歇应用组、空白对照组.用茜素红染色检测培养6 d和14 d后,各组细胞矿化结节的形成情况;用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性,应用Western blot和Real-time PCR检测BMSCs成骨分化、骨形成相关蛋白和基因mRNA.结果:PTH间歇应用组在6 d和14 d时形成的矿化结节数量最多,而PTH持续性应用组形成的矿化结节在3组中数量最少.经过6 d和14 d的PTH作用,PTH间歇应用组的ALP活性,RUNX2、BSP和MMP13蛋白,成骨分化标志物RUNX2,ALP和骨形成相关基因OCN及OSX的表达,均明显高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05).PTH持续应用组COL2a1的mRNA及成骨抑制基因SOST mRNA的表达量明显高于PTH间歇应用组(P<0.05).结论:间歇性应用PTH可明显促进共培养体系的成骨向分化及骨质形成,而持续性应用PTH则抑制该过程.     

犬牙周膜细胞和骨髓基质细胞相互作用的体外实验研究

目的:研究牙周膜细胞(PDLCs)和骨髓基质细胞(BMSCs)共培养是否更利于牙周组织再生。方法 :用组织块法培养PDLCs,用全血贴壁法培养BMSCs,检测它们的成骨、成脂诱导分化能力。用Transwell小室共培养这两种细胞,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测共培养后这两种细胞的增殖能力及部分基因的表达变化。结果:PDLCs和BMSCs具有多向分化潜能。共培养能促进它们各自增殖,上调Ⅰ型胶原(COLI)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)、核心结合因子2(RUNX2)的表达。结论:PDLCs和BMSCs共同运用作为种子细胞可能更有利于牙周组织再生。