腺病毒介导双自杀基因CD/TK对人肝癌细胞株Bel7402的抑制作用

目的探讨含胞嘧啶脱氨酶(CD)／5-氟胞嘧啶(5-Fc)单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶基因融合自杀基因(CD／TK)的重组腺病毒治疗肝癌的疗效。方法重组腺病毒Ad．CD／TK感染人肝癌细胞Bel7402,用噻唑蓝(MTT)方法观察不同浓度5-Fc和无环鸟苷(GCV)对其杀伤效应; 建立Bel7402裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad．CD／TK,腹腔注射GCV(50 mg／kg体重)和／或5- Fc(500 mg／kg体重)10 d,观察肿瘤生长抑制效应。结果在对感染Ad．CD／TK的Bel7402细胞的体外杀伤实验中,GCV的IC50为(12．1±2．3)μmol／L,5-Fc的IC50为(223±15)μmol／L,并且两者有协同效应。在Bel7402裸鼠移植瘤模型中,联合Ad．CD／TK和GCV、5-Fc能够显著抑制肿瘤的生长。结论腺病毒为载体的双自杀基因转染和前药的应用对人肝癌细胞的体内、体外治疗疗效明显。     

TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的实验研究

目的观察胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)双自杀基因系统对结肠癌的治疗效果,并结合研究结果进行作用机理的分析。方法采用培养细胞移植法,将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型。将32只裸鼠随机分为4组:空白对照组,TK/GCV治疗组,CD/5-Fc治疗组,TK/GCV CD/5-Fc联合治疗组,每组8只。TK/GCV CD/5-Fc采用逆转录病毒介导,采用瘤体内直接注射法,同时腹腔注射GCV、5-Fc治疗,观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标,比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响。结果各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制,治疗后各组体积数增加(P<0.05),治疗组裸鼠存活期显著延长,TK/GCV CD/5-Fc联合治疗组效果最好,疗效q值=1.675>1.15,即TK/GCV、CD/5-Fc有交互协同作用。结论TK/GCV与CD/5-Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用,TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统效果更强。     

TK／GCV、CD／5-Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的实验研究

目的观察胸苷激酶／丙氧鸟苷（TK／GCV）、胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-Fc）双自杀基因系统对结肠癌的治疗效果，并结合研究结果进行作用机理的分析。方法采用培养细胞移植法，将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下，建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型。将32只裸鼠随机分为4组：空白对照组，TK／GCV治疗组，CD／5-Fc治疗组，TK／GCV＋CD／5-Fc联合治疗组，每组8只。TK／GCV＋CD／5-Fc采用逆转录病毒介导，采用瘤体内直接注射法，同时腹腔注射GCV、5-Fc治疗，观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标，比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响。结果各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制，治疗后各组体积数增加（P〈0．05），治疗组裸鼠存活期显著延长，TK／GCV＋CD／5-Fc联合治疗组效果最好，疗效q值=1．675〉1、15，即TK／GCV、CD／5-Fc有交互协同作用。结论TK／GCV与CD／5-Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用，TK／GCV、CD／5-Fc双自杀基因系统效果更强。     

双自杀基因CD、HSV-tk共表达对肝门部胆管癌细胞杀伤作用实验研究

目的:观察逆转录病毒介导的双自杀基因CD、HSV-tk共表达对肝门部胆管癌细胞FRH的杀伤作用,探讨肝门部胆管癌的基因治疗方法.方法:在脂全Lipofectamine的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PwzheoCDglytk转导入包装细胞PA317,经G418筛选后培养产病毒的阳性克隆PA317/CD 细胞株,收集其病毒上清,转染FRH细胞,再次经G418筛选,获得稳定表达双自杀基因的FRH/CD tk细胞株,用RT-PCR检测双自杀基因的表达.给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocy-tosine,5-Fc)或无环鸟苷(Gancicioir,GCV)后,用MTT法测定转基因组及未转基因组FRH细胞的存活率.结果:双自杀基因在FR细胞中可稳定表达,联合使合5-Fc和GCV对靶细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-Fe或GCV.结论:逆转录病毒介导自杀基因可有交往杀死肝门部胆管癌细胞.双自杀基因共表达较单一自杀基因有更强的抗瘤作用.     

HSV-tk/CD融合基因杀伤人胆管癌细胞QBC939的体内实验

目的 研究单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）／胞嘧啶脱氨酶（CD）融合基因在动物体内对人胆管癌的杀瘤作用。方法构建人胆管癌的裸鼠皮下移植瘤动物模型,按排序法随机分为4组,每组8只。对照组,每只裸鼠腋部瘤体内注人不含自杀基因的腺病毒液0．1ml,CD基因组、tk基因组和HSV-tk／CD融合基因组,在每只裸鼠腋部瘤体内分别注人CD基因、tk基因及HSV-tk／CD融合基因的重组腺病毒液0．1ml。注射后24h每只裸鼠腹腔内注射5-氟胞嘧啶（5-flurocytosine,5-FC）和丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）,观察肿瘤的生长情况。结果CD基因组、tk基因组及HSV-tk／CD融合基因组肿瘤的生长均受到不同程度的抑制,与对照组比较,抑制率分别为41．2％、55．7％和70．7％,P均〈0．05;病理组织学检查显示,对照组肿瘤生长良好,细胞分裂相多见;其余各组出现不同程度的肿瘤坏死,这种现象以HSV-tk／CD融合基因组最为明显。结论HSv-tk／CD融合自杀基因在胆管癌细胞体内也具有较强的杀瘤活性,但作用不够彻底,可能与旁观者效应（bystand ereffect,BSE）的效应强度有关。     

胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶融合基因抑骨肉瘤生长的研究

目的观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶/胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因(HSV-TK/CD)对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后将其分为6组:(1)PBS对照组;(2)重组腺病毒(adenovirus,Ad)-Lac-Z/GCV 5-FC组;(3)Ad-TK/GCV组;(4)Ad-CD/5- FC组;(5)Ad-TK/GCV Ad-CD15-FC组;(6)Ad-TK-CD/GCV 5-FC组。各组经治疗后观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果(2)组与(1)组比较,肿瘤体积与肿瘤坏死程度差异无统计学意义(P>0.05);与(1)、(2)组比较,(3)～(6)组肿瘤的生长均受到明显抑制(P<0.05),且(5)、(6)组与(3)、(4)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论融合自杀基因HSV-TK/CD对裸鼠骨肉瘤生长有明显的抑制作用。     

双自杀基因系统对体内外胆管癌抑制作用的实验研究

目的观察胞嘧啶脱氨酶基因（CD）和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）双杀基因对胆管癌细胞和裸鼠胆管癌移植瘤的抑制作用.方法在脂质体介导下将质粒pWZLneoCDglytk转入胆管癌QBC939细胞,经G41 8筛选获得稳定表达双自杀基因的QBC939/CD＋tk细胞株,RT-PCR法鉴定CD和tk基因的表达.体外给予前体药物5-氟胞嘧啶（5-Fc）和/或丙氧鸟苷（GCV）,作用于QBC939/CD＋tk细胞,MTT法测定细胞抑制率.裸鼠皮下注射QBC939/CD＋tk细胞,成瘤后腹腔注射前体药物,用药前后测量移植瘤的大小判断疗效.结果CD和tk基因在QBC939/CD＋tk细胞中获得稳定表达.联合5-Fc和GCV与任何单一药物相比,在较小剂量下可产生较强的抑制作用.随着药物浓度的提高,对细胞生长的抑制作用也相应地提高.前体药物对QBC939/CD＋tk细胞早期生成的移植瘤抑制作用明显,肿瘤可完全消失,并观察到明显的局部旁观者效应.结论双自杀基因系统在体内外对胆管癌细胞和裸鼠移植瘤均有明显的抑制效果,旁观者效应也很明显.     

CD/5-FC系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的抗血管形成作用的初步探讨

目的　探讨自杀基因系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的微血管形成的抑制作用。方法　构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)基因的腺病毒穿梭载体 pAdTrack CMV CD ,与骨架载体pAdEasy 1在细菌内重组为 pAd CD ,经 2 93细胞包装、扩增 ,氯化铯密度梯度离心制备纯化高效的CD腺病毒液 ,建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型 ,观察CD基因的原位治疗及微血管形成抑制情况。结果　含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确 ,包装纯化后 ,检测病毒滴度为 2× 10 11pfu/ml,体内实验显示CD基因原位转导对裸鼠胰腺癌移植瘤的微血管形成具有较明显的抑制效应。结论　腺病毒介导CD/ 5 FC自杀基因系统 ,不仅可以直接杀灭癌细胞 ,而且还可通过抑制移植瘤微血管的形成来抑制胰腺癌细胞的生长 ,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法。     

胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对恶性脑胶质瘤荷瘤裸鼠的抗肿瘤作用

目的 评判胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因治疗系统对恶性脑胶质瘤的抗肿瘤效果.方法 采用Lipofectamine2000TM脂质体介导方法将CD基因转染17251恶性胶质瘤细胞系,并接种于裸鼠前臂皮下,成瘤后腹腔注射5-FC(每13500mg/kg体重)10 d,观察荷瘤鼠肿瘤的生长情况,8周后比较转染组与对照组肿瘤的体积与重量,并进行病理形态学分析.结果 U251细胞获得CD基因的成功转染,5-FC用于不同组别荷瘤裸鼠,8周后转染组肿瘤体积(0.09±0.03)cm3和重量(0.28±0.11)g明显小于对照组(1.81±0.77)cm3和(1.63±0.80)g;形态学揭示转染组肿瘤细胞出现明显的凋亡与坏死.结论 裸鼠在体实验研究表明:CD/5-FC自杀基因治疗系统是治疗恶性脑胶质瘤行之有效的手段之一.     

甲胎蛋白启动子驱动的yCDglyTK双自杀基因治疗裸鼠肝癌的机制研究

目的研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内靶向性治疗肝癌的效果和机制。方法构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因表达质粒,通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721肝癌细胞的裸鼠肝癌皮下种植瘤,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果成功构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因,其靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞种植瘤上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞种植瘤上无表达,氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及两者联合可有效抑制HepG2细胞种植瘤的生长,抑瘤效果GCV＋5-FC〉5-FC〉GCV,而SMMC7721细胞种植瘤的生长未受影响。HepG2细胞种植瘤治疗后有明显的细胞凋亡,而SMMC7721细胞种植瘤内极少凋亡细胞。结论携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

逆转录病毒介导的双自杀基因对肝内胆管癌细胞杀伤作用的实验研究

目的观察逆转录病毒介导的双自杀基因对肝内胆管癌细胞HCCC-9810的杀伤作用，探讨肝内胆管癌的基因治疗方法。方法在脂质体的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PwzlneoCDglytk导人包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD tk细胞株，收集病毒上清，转染HCCC-9810细胞，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的HCCC-9810／CD tk细胞株。用RT-PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine，5-FC)和(或)无环鸟苷(ganciciovir，GCV)后，用MTT法测定转基因组及未转基因组HCCC-9810细胞的存活率。结果双自杀基因在HCCC-9810细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCV。结论逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死肝内胆管癌细胞，双自杀基因较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

双自杀基因体系对胆囊癌细胞体内外杀伤作用的研究

目的　研究联合应用双自杀基因对胆囊癌细胞的杀伤作用。方法　将GBC SD/CD tk细胞和GBC SD细胞分别接种于裸鼠皮下 ,观察前体药物应用前后肿瘤体积的变化。将CD和HSV tk自杀基因转染胆囊癌细胞GBC SD ,MTT法观察 5 氟胞嘧啶或 /和丙氧鸟苷的杀伤作用。结果　单独应用 5 氟胞嘧啶或丙氧鸟苷均能对转染阳性的胆囊癌细胞GBC SD/CD tk产生明显的杀伤效应 ,联合应用可以产生更大的杀伤作用 ,旁观者效应明显 ;GBC SD/CD tk和GBC SD细胞分别接种裸鼠后成瘤性无明显差别 ,转染组的杀伤作用明显 ,体内局部旁观者效应明显。结论　双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用 ,其旁观者效应明显。     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对胆囊癌细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因的应用对胆囊癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染人PA317细胞，用其病毒上清转染胆囊癌细胞GBC-SD，G418筛选出阳性细胞(GBC-SD/CD tk，应用不同浓度的5-FC或(和)GCV，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的GBC-SD/CD tk和GBC-SD细胞混合，联合应用5FC和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5FC或GCV均能对转染阳性的GBC-SD／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用，其旁观者效应明显。     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对MCF-7细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因(胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV-tk)的应用对乳腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染入PA317细胞，用其病毒上清转染乳腺癌细胞MCF-7，G418筛选出阳性细胞MCF-7／CD tk，然后加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Fc)或／和丙氧鸟苷(GCV)，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的MCF-7／CD tk和MCF-7细胞混合，联合应用5-Fc和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5-Fc或GCV均能对MCF一7／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数混合细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对乳腺癌细胞具有明显的杀伤作用．其旁观者效应明显。     

联合应用双自杀基因对SW1990细胞的杀伤作用

目的:研究双自杀基因(胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV-tk)的应用对 SW1990细胞的杀伤作用和旁观者效应.方法:脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染入PA317细胞,用其病毒上清转染胰腺癌细胞SW1990,G418筛选出阳性细胞SW1990/CD tk,然后加入不同浓度的5-Fc或/和GCV,MTT法观察其杀伤作用;将不同比例的SW1990/CD tk和SW1990细胞混合,联合应用5-Fc和GCV杀伤,观察其旁观者的效应.结果:单独应用5-Fc或GCV均能对转染阳性的胰腺癌细胞产生明显的杀伤效应,联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用;当阳性细胞比例达到20%时即可对半数细胞产生杀伤作用.结论:双自杀基因的应用对胰腺癌细胞具有明显的杀伤作用,其旁观者效应明显.     

腺病毒介导的双自杀基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨直肠癌的基因治疗方法。方法 用重组腺病毒介导外源胞嘧啶脱氨酶（CD）基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因转移到人直肠癌细胞系HR－8348,通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法）,检测、分析CD和HSV－tk双自杀基因系统对肿瘤细胞的作用。结果 重组腺病毒介导的CD和HSV－tk自杀基因可在HR－8348细胞高效表达。用腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Linkl(CD tk)、Linkl(-)、pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Kinkl(tk）重组腺病毒感染HR－8348细胞,不加5－氟胞嘧啶（5－FC）、环氧鸟苷（GCV）,各组肿瘤细胞的集落形成和存活率的差异无显著性意义（P＞0．05）。应用5－FC、GCV后,pAdCMV-Linkl(CD tk)转染组细胞集落形成和存活率显著低于对照组pAdCMV-Link（－）转染组（P＜0．01）,也低于pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Linkl(tk）转染组（P＜0．05）。CD和5－FC、HSV－tk和GCV系统联合使用较单一自杀基因系统对HR－8348直肠癌细胞的集落形成、细胞生长有更显著的抑制作用,对肿瘤细胞有更强的杀伤能力和“旁观者效应”。结论 CD和HSV－tk双自杀基因联合作为肿瘤基因治疗的一种手段和方法,较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。