PCR微孔板杂交法检测TTV DNA影响因素探讨

1997年底日本学者利用代表性差异分析法首先发现ＴＴＶ[1],1998年我国周育森、周伯平、孟庆华等[2～4]用巢式ＰＣＲ证实我国存在ＴＴＶ。我们根据Ｏｋａｍｏｔｏ[5]报道的ＴＴＶ基因全序列设计引物和探针,建立了ＰＣＲ微孔板杂交法检测ＴＴＶＤＮＡ。本文对该法影响因素进行探讨。1　材料和方法11　血清标本　取10份ＴＴＶＤＮＡ阳性血清混合作阳性对照,取10份ＴＴＶＤＮＡ阴性献血员血清混合作阴性对照。12　方法　将血清标本中的ＴＴＶＤＮＡ抽提后经ＰＣＲ扩增,扩增产物变性后,加入到包被有链霉亲合素的微孔板中,产物中的生物素与微孔板…     

用微板核酸杂交-ELISA技术检测皖北地区不同人群TTV感染情况

目的：用微板核酸杂交－ＥＬＩＳＡ技术检测皖北地区不同人群ＴＴＶ感染情况。方法：用ＰＣＲ法将患者血清标本中的ＴＴＶ ＤＮＡ扩增后,与两条特异性探针夹心杂交,通过酶联显色检测血甭标本中的ＴＴＶ ＤＮＡ,进行分型并与套式ＰＣＲ方法比较。结果：ＴＴＶ在学生、血透患者、肝病患者中的阳性率分别为３．３％,１６．７％和１３．５％,前者与后两者比较差异均有显著意义（Ｐ〈０．０５）;１４例非甲－非戊（ＮＡ－ＮＥ）肝     

荧光定量PCR检测HBV—DNA的临床意义

本文采用荧光定量ＰＣＲ法对本院临床和门诊血清标本2 0 0份进行ＨＢＶ ＤＮＡ含量测定 ,探讨ＨＢＶ ＤＮＡ含量与肝病变发展的关系。1　材料和方法1 1　材料　标本取自确诊或怀疑乙肝的患者及无症状体检者 ,共检测 2 0 0例。试剂∶荧光定量ＨＢＶ ＤＮＡ试剂盒由匹基公司提供。仪器∶ＰＥ5 70 0ＰＣＲ仪。1 2　方法　ＨＢＶ ＤＮＡ定量分析采用荧光定量ＰＣＲ法。按操作说明书进行。1 3　统计学方法　各组ＨＢＶ ＤＮＡ含量均数比较采用ｔ检验。遇有阴性结果不参加平均值的统计。2　结果2 1　ＨＢＶ ＤＮＡ、ＦＱ ＰＣＲ标准曲线　ＨＢＶ …     

血液透析患者输血传播病毒感染状况的初步研究

目的：研究血液透析（ＨＤ）患者输血传播病毒（ＴＴＶ）的感染状况和基因型。方法：设计特异性引物,建立工聚合酶链反应,对２０例ＨＤ患者血清标本进行ＴＴＶ－ＤＮＡ的检测。并对阳性ＰＣＲ产物进行荧光法直接测序。结果：经过巢式ＰＣＲ检测,ＨＤ患者ＴＴＶ－ＤＮＡ阳性率为２５％。随机选择ＴＴＶ－ＤＮＡ阳性ＰＣＲ产物进行荧光法直接测序,与国外报道的日本株Ｎ２２比较,核苷酸同源性为９５．８％。     

血液透析病人中输血传播病毒（TTV）感染的检测及序列分析

目的：检测我国南方地区血液透析的病人中经输血传播病毒（ＴＴＶ）的感染。方法：采用ＴＴＶ基因组ＯＲＦ１区段设计特异性引物,建立巢式ＰＣＲ方法检测４８例血液适析病人血清标本中ＴＴＶ ＤＮＡ,并对分离出的２例ＴＴＶ部分基因进行核苷酸序列分析。结果：血液透析病人ＴＴＶＤＮＡ阳性率为４１．７％（２０／４８）,２例ＴＴＶＤＮＡ基因序列与日本ＴＴＶ基因相对应位置的核苷酸同源性分别为９２％和９５％。结论：我国南方     

246份母—脐血配对HBV检测结果与分析

我们收集了 2 4 6份母 脐配对血进行ＨＢＶ血清标志物及ＤＮＡ定量检测 ,结果报告如下。1　材料与方法1 1　标本来源　 2 4 6份母 脐配对血均来自 1999年 11月至 2 0 0 0年 6月本院产科住院产妇静脉血及所产新生儿脐带血 ,分离血清置 - 2 0℃冰箱内保存。对ＨＢｓＡｇ阳性的母血 ,无论其对应脐血ＨＢＶ血清标志物结果怎样 ,均进一步用荧光定量ＰＣＲ(ＦＱ ＰＣＲ)检测ＨＢＶ ＤＮＡ。1 2　试剂与方法　ＨＢＶ Ｍ检测使用科华公司试剂盒按说明书操作。ＦＱ ＨＢＶＤＮＡ试剂购自复星公司。用ＰＥ5 70 0荧光定量扩增仪 ,结果自动测出。1 3　结…     

套式PCR法在检测血清TTV DNA的临床应用

为了建立诊断ＴＴＶ感染的实验方法 ,开展对ＴＴＶ感染的人群调查及运用于临床诊断 ,我们在中国人民解放军军事医学科学院帮助下[1] ,利用供给试剂设计引物 ,结合本实验室的特点建立了检测ＴＴＶＤＮＡ套式ＰＣＲ的方法 ,经 4 0 9例标本测定 ,阳性率为 18.58% ,阳性标本又经军事医学科学院鉴定符合率为 92 % ,13例标本经测序诊断所证实 ,现将结果报道如下 :1　材料与方法1.1　标本来源于本院就诊病人 10 9例 ,住院部病人 142例和体检人群 2 3例 ,献血员标本 135例。1.2　实验材料 :ＨＢｓＡｇ、抗ＨＣＶ试剂购自华美公司 ;Ｔａｑ酶ｄｎｔｐ…     

利用实时定量PCR检测TTV DNA含量

为了评价健康人群与肝病病人之间血清ＴＴＶＤＮＡ水平的差异 ,本文建立实时ＰＣＲ检测 (ＲｅａｌｔｉｍｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎＰＣＲ ,ＲＴＤ ＰＣＲ)系统对感染ＨＣＶ的病人和感染ＴＴＶ的志愿献血员(ＢＤＳ)中的血清ＴＴＶＤＮＡ水平进行定量 ,并判定ＴＴＶ数量与肝损害严重性之间的关系。作者分析 78份感染ＨＣＶ而ＨＢＳＡｇ为阴性的病人血清样本 (63份血清ＡＬＴ升高 ,1 5份正常 )。对照组为 70份ＢＤＳ 血样 ,其ＴＴＶ为阳性而ＨＩＶ、ＨＢＶ及ＨＣＶ为阴性 ,ＡＬＴ正常。所有样本贮存于 - 80℃备测。制备 2对引物和探针设置于 5’未…     

PCR检测HBV－DNA提取方法的比较

ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ提取方法的比较步恒富，马立人，刘志红，刘耀清，王全立（北京军事医学科学院放射医学研究所，北京１００８５０）我们对ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ时标本处理这一关键性问题进行了模索，现报告如下。１材料和方法１．１血清样品某宾馆服务员普查...     

供血员、血液透析及非甲～庚型肝炎患者中TTV的感染状况

了解供血员,血液透析及非甲－庚型肝炎患者中输血传播病毒的感染状况,方法对４０份供血员标本,２７例血液透析及６０例散发性非甲－庚型肝炎患者血清标本,采用ＰＣＲ方法检测ＴＴＶ－ＤＮＡ,分析ＴＴＶ的感染状况。结果：４０份供血员血清中,有５例检出ＴＴＶ－ＤＮＡ阳性,检出率为１２．５％;血液透析患者中ＴＴＶ的检出率为２２．２％（６／２７）,而６０例散发性非－庚型肝炎患者血清中,无１例检出ＴＴＶ－ＤＮＡ。在１     

标本处理对聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸的影响

目的 研究对血清标本进行乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ聚合酶链反应（ＰＣＲ）测定前的最佳标本处理方法。方法 使用煮沸裂解方法和核酸纯化方法同时处理２份ＨＢＶ ＤＮＡ含量不同血清标本及３份溶血和正常血清标本,比较荧光定量ＰＣＲ测定的重复性及测定值的差异。结果 煮沸裂解法处理２份标本所得结果的重复性（变异系数ＣＶ分别为０．２１６５和０．３２６２）明显差于对样本进行核酯纯化后的测定重复性（ＣＶ分别为０．０６９９和０．１０９２）;并且,当标本中血红蛋白含量大于５．８９ｕｇ／Ｌ时（肉眼未见有明显溶血）,采用煮沸裂解法处理标本所得ＨＢＶ ＤＮＡ量较核酸纯化方法所得值低约２个数量级（Ｐ〈０．０５）。结论 在ＨＢＶ ＤＮＡ ＰＣＲ检测时,煮沸裂解法不适合用来处理血清标本,而应使用核酸纯化方法。     

泰州地区不同人群TT病毒检测及意义

近年来的研究表明,在排除了ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ、ＨＧＶ等肝炎病毒感染后,仍有部分肝炎患者不能确定病因。1997年底日本在输血后非甲—非庚型肝炎患者血清中发现与人类相关的ＤＮＡ病毒—ＴＴ病毒[1],为了探讨ＴＴ病毒在泰州地区不同人群中的感染状况,了解ＴＴ病毒感染者的病程和转归,我们以套式聚合酶链反应[2](ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ)方法检测了50例健康人,72例新生儿,100例献血员,100例各型肝炎患者,35例血透患者的血清,发现ＴＴ病毒在该地区也有存在,现报告如下。1　材料和方法献血员100例,血清标本采自泰州市血站。72…     

微波处理全血标本用于PCR检测HBV DNA的可行性研究一附172…

本文在微波处理微量全血标本用于ＰＣＲ检测ＨＢＶ ＤＮＡ的可行性进行了研究，在１７２例受标标本中，微波处理全血和血清标本提取模板ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增的方法ＨＢＶＤＮＡ检出阳悸分别为１５４例和１５１例，而且常规方法处理全血和血清标本制备ＤＮＡ模板ＨＢＶ ＤＮＡ的阳性例数分别为６９和１４３例，结果显示，应用微波处理全血标本，不仅可以提高检出率而且具有方法简单，取样方便易为患者接受的优点，适用于临床工作。     

肝病患者中抗—TTV—IgG和TTV DNA检测的临床意义

为研究ＴＴ病毒 (ＴＴＶ)在肝病患者中的感染状况 ,我们对 12 7例各类肝病患者进行了抗 ＴＴＶ ＩｇＧ及ＴＴＶＤＮＡ检测。一、材料和方法1.对象　 12 7例肝病患者为按 2 0 0 0年 9月西安全国传染病寄生虫病、肝病学分会制订的标准诊断的本院住院病人 ,其中乙型肝炎 84例、甲型肝炎 5例、丙型肝炎 3例、戊型肝炎 5例、非甲非戊型肝炎 30例。南通市血站的 2 0名献血员作为对照。2 .方法　ＴＴＶＤＮＡ检测采用套式ＰＣＲ法 ,抗 ＴＴＶ ＩｇＧＨＤＶ Ｍ采用ＥＩＡ法 (北京医科大学肝病研究所试剂 ) ,抗 ＨＡＶ ＩｇＭ、ＨＢＶＭ、抗 ＨＣ…     

荧光定量PCR与RT-PCR技术检测HCV-RNA的比较观察

目的 比较荧光定量ＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ（定性）检测不同检材中的ＨＣＶ－ＲＮＡ,评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值。方法 采用荧光定量ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ（定性）技术同时检测了７１例血液透析患者的血清,血浆,淋巴细胞、尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果 血清、淋巴细胞,尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４６．３８％,８０．００％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－Ｐ     

生殖泌尿道分泌物中TTV DNA检测

自从 1997年底日本学者首次从输血后肝炎病人血清中发现了新的肝炎相关病毒 -ＴＴＶ[1] ,国内学者也研究证实我国人群中存在ＴＴＶ感染[2 ] ,并发现ＴＴＶ能够通过肠道途径传播[3] 。为了解ＴＴＶ是否通过性接触传播 ,我们采用聚合酶链反应方法检测了 94例生殖道和尿道分泌物中ＴＴＶＤＮＡ ,现将结果报告如下 :1　材料与方法1.1　标本来源　分泌物标本 :1998年 8～ 10月间 ,我院妇科门诊、男性科门诊随机病人 95例 ,其中男性 30例 ,女性 6 5例 ,年龄 10～ 6 5岁 ,男性病人取尿道分泌物 ,女性病人取阴道分泌物。血液标本 :7例分泌物ＴＴＶＤ…     

聚合酶链反应凝胶呈像技术检测乙型肝炎病毒

目的 建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）－凝胶呈像（ｇｅｌｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍＧＤＳ）技术,并应用于临床检测乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核酸ＤＮＡ。方法 用凝胶呈像技术对血清ＨＢＶ－ＤＮＡＰＣＲ扩增产物的电泳凝胶进行摄像,分析,并与紫外灯下的肉眼观察结果相比较,对肉眼未判断出阳性而凝胶呈像分析邮阳性的血清标本,用定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）方法检测ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果 通过３８份血清标本的检测,发现     

深圳地区流行TTV的基因分型与基因变异

目的：探讨深圳地区流行ＴＴＶ病毒的主要基因型、基因变异状况。方法：采集长期维持性血液透析患者,以及非甲－非庚但血清ＡＬＴ升高肝炎患者血清标本,提取病毒ＤＮＡ后,巢式ＰＣＲ扩增ＴＴＶ ＯＲＦ１部分基因,克隆、测序后,进行基因分型及基因变异分析。结果：对２１例ＴＴＶ ＯＲＦ１部分基因进行序列分析,基因同源性为６０．３％～９８．５％。２１例ＴＴＶ分离株中,Ｇ１型１７例,其中,Ｇ１ａ亚型１６例,Ｇ１ｂ亚型     

荧光信号引物PCR定量测定血清HCV—RNA的实验室评价

目的对Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ荧光标记ＨＣＶ定量ＰＣＲ方法进行实验室考核。方法２８例抗ＨＣＶ（＋）、定性ＰＣＲ（＋）的血清标本，用于重复性测定；２０例健康人血清用于正常值测定；５例定性ＰＣＲ（＋）和５例定性ＰＣＲ（－）标本用于Ａｍｐｌｉｓｅｍｓｏｒ和ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ两种方法的比较。结果孔间变异系数（ＣＶ）为 ２０．６％，操作者间ＣＶ为 ４３．８％，批内 ＣＶ为 ６１．９％，批间ＣＶ为８５．１％。２０例健康人血清测定值均小于最小检测浓度，即１０２拷贝／ｍｌ。用Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ和ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ两种方法对５ 例定性ＰＣＲ（－）标本测定，Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ和ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ均为阴性；对５ Ｎ定性ＰＣＲ（＋）标本测定，Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ均为阳性，ＨＣＶ－ＲＮＡ的浓度为 ２． ５ × １０５拷贝 ／ｍｌ～ １． ７ ×１０６拷贝 ／ｍｌ， ｂｒａｎｃｈ－ＤＮＡ方法有 ２例未能检出。结论 Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ ＨＣＶ定量 ＰＣＲ方法特异性和灵敏度均好，可用于临床疾病的研究和抗病毒药物疗效的评估。由于批内、批间变异系数较大，试验与操作均应严格规范。     

斑点杂交与荧光定量PCR检测血清HBV-DNA的临床意义

ＨＢＶ ＤＮＡ是一种十分重要的ＨＢＶ感染标志 ,是直接反映ＨＢＶ的存在、病毒活动性复制与具有传染性的标志 ,对于确定ＨＢＶ感染的诊断有重要价值[1] 。目前ＨＢＶ感染的基因诊断技术已从定性发展到定量[2 ] 。斑点杂交定性检测不能直接反映病毒负荷量。近年来 ,荧光定量ＰＣＲ逐渐应用于临床检测ＨＢＶ ＤＮＡ。通过对 10 5例慢性乙型肝炎患者用斑点杂交与荧光定量ＰＣＲ两种方法同时进行血清ＨＢＶ ＤＮＡ检测 ,以了解两种方法的一致性 ,探讨两者的临床应用价值及问题。1　材料和方法1.1　研究对象　 2 0 0 1年 3至 7月间中山医科大学…