骨肉瘤端粒酶逆转录酶的定性与定量检测及其意义

目的 对骨肉瘤中人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达进行定性及定量检测,探讨hTERT在骨肉瘤中的表达及意义.方法 用免疫细胞/组织化学法分别定性检测人宫颈癌细胞株HeLa、人骨肉瘤细胞株U2-OS、MG-63、SAOS-2及15例骨肉瘤组织中hTERT的表达情况;用蛋白印迹法(Western-blot,WB)定量检测上述细胞株及7例骨肉瘤组织中hTERT的表达情况.结果 免疫细胞/组织化学显示,HeLa细胞hTERT表达率最高(95.16%);MG-63、SAOS-2、U2-OS细胞系中hTERT阳性率分别为8.75%、5.26%、2.33%;骨肉瘤组织中hTERT表达阳性率26.7% (4/15).蛋白印迹法显示,Hela、MG-63及两个骨肉瘤样本(OS1和OS2)有hTERT表达,U2-OS及SAOS-2中几乎没有hTERT表达.结论 hTERT在骨肉瘤中表达很低,可能无法成为骨肉瘤的临床治疗靶点.     

端粒酶逆转录酶及VEGF在卵巢肿瘤中的表达

目的探讨卵巢肿瘤组织中端粒酶逆转录酶(TRT)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达及相关性.方法对89例卵巢肿瘤(良性肿瘤44例、交界性肿瘤9例、恶性肿瘤33例)采用免疫组织化学S-P法测定其TRT和VEGF的表达,并进行相关分析.结果 TRT和VEGF在不同卵巢肿瘤组中的表达明显各异,两者在良性组、交界性组、恶性组中的阳性率分别是9.1%、55.6%、83.3%和11.4%、66.4%、86.1%.它们的阳性表达强度亦随着肿瘤的恶性度增高而逐渐增强;各组比较均有显著性差异(P＜0.01).相关分析显示TRT和VEGF的表达密切正相关(P＜0.01).结论 TRT和VEGF在卵巢肿瘤组织中的高表达与恶性度关系密切,二者的同时检测可作为判断卵巢肿瘤恶性度的重要指标.     

端粒酶逆转录酶研究现状

 目前研究认为 ,大部分肿瘤细胞表达端粒酶活性 ,而正常细胞大都没有端粒酶活性表达 ,永生化细胞和恶性肿瘤细胞通过激活端粒酶来维持端粒长度并阻止细胞死亡 ,端粒酶的激活是恶性肿瘤增殖失控的重要原因。端粒酶是一个核糖核蛋白复合体 ,由45 0 bp的 RNA和至少两个蛋白亚单位组成[1]。其中对端粒酶活性表达起限速作用的蛋白组分—端粒酶逆转录酶的作用、基因结构和表达调控研究已逐步深入。本文将就端粒酶逆转录酶的研究现状作一综述。     

骨髓增生异常综合征骨髓细胞端粒酶活性和端粒酶逆转录酶的表达

目的　探讨骨髓增生异常综合征 ( MDS)骨髓细胞端粒酶活性与端粒酶逆转录酶表达的关系及临床意义。方法　采用端粒重复序列扩增 -酶联免疫吸附试验 ( TRAP- EL ISA)检测端粒酶活性 ,RT- PCR法检测端粒酶逆转录酶 ( h TERT) m RNA水平的表达。结果　高危组 MDS患者骨髓细胞端粒酶活性较低危组 MDS患者骨髓细胞端粒酶活性明显增高 ( 0 .2 0 0± 0 .2 2 5 vs 0 .0 2 7± 0 .0 13,P=0 .0 37) ;正常人、缺铁性贫血 ( IDA)患者和低危组 MDS患者骨髓细胞 h TERT m RNA表达检测结果均阴性 ,而高危组 MDS患者和急性白血病 ( AL )患者骨髓细胞均表达h TERT基因 ;h TERT m RNA表达和端粒酶活性呈正相关 ( r=0 .774 ,P=0 .0 2 4 )。结论　端粒酶活性与 h TERT基因 m RNA水平的异常表达能反映出 MDS病情的进展。定期检测 MDS患者骨髓细胞端粒酶活性和 h TERTm RNA水平的表达可作为观察 MDS患者病情变化的指标之一。     

纳米载体介导的人端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞的增殖抑制作用及端粒酶表达的影响

目的 探讨纳米载体介导的人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸(ASODN)在体内外对食管癌EC9706细胞的增殖抑制作用及端粒酶表达的影响.方法 制备线型聚乙烯亚胺(L-PEI)/ASODN纳米级复合物及NGR修饰的L-PEI/ASODN靶向纳米复合物,转染人食管癌细胞系EC9706.采用激光共聚焦显微镜观察细胞对纳米复合物的摄入情况,通过二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测细胞抑制率,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化法分别检测hTERT mRNA和蛋白的表达情况,Annexin V-FITC/PI双标法检测凋亡细胞.通过体内药物分布实验和抑瘤实验观察NGR的靶向肿瘤细胞作用、裸鼠移植瘤的生长情况、组织形态学和超微形态学改变.结果 共聚焦显微镜观察可见,L-PEI可以保护hTERT ASODN有效进入细胞核内;N/P=10、ASODN终浓度40 μg/ml的L-PEI/ASODN复合物转染细胞后24、48、72和96 h,增殖抑制率分别为45.6%、55.8%、67.0%和83.1%;L-PEI/ASODN转染组hTERT mRNA水平明显降低,hTERT条带与内对照条带灰度值的比值为0.27±0.04,与空白对照组、ASODN转染组和L-PEI/SODN转染组相比,差异均有统计学意义(均P＜0.05),hTERT蛋白不表达;转染48 h后,L-PEI/ASODN转染组细胞凋亡明显,早期凋亡率和晚期凋亡率分别为38.0%和52.2%.NGR修饰的L-PEI/ASODN-FAM纳米复合物注射于荷瘤小鼠,其靶向肿瘤作用明显;给药8 d后,NGR/L-PEI/ASODN静脉给药组和皮下给药组的肿瘤体积均明显小于生理盐水组和NGR/L-PEI/SODN组(均P＜0.05);超微结构观察可见典型凋亡小体.结论 NGR修饰、L-PEI介导下的hTERT ASODN可抑制EC9706细胞的增殖,降低其端粒酶的表达,还可有效到达裸鼠人食管癌移植瘤内,抑制肿瘤的生长.     

端粒酶逆转录酶及其基因表达与调控

人染色体端粒由串联排列的 TTAGGG重复片段所构成。正常体细胞端粒序列不能完全复制，因而随着细胞分裂将导致端粒重复片段的丢失，使端粒缩短，最终导致细胞老化死亡 [1]。目前研究认为，恶性肿瘤增殖失控的关键在于端粒酶的激活，永生化细胞和恶性肿瘤细胞通过激活端粒酶活性来维持端粒长度并阻止细胞死亡 [2]。端粒酶是一个核糖核蛋白复合体，由 450 bp的 RNA和至少 2个蛋白亚单位组成。许多学者发现，大部分肿瘤细胞表达端粒酶活性，而正常细胞大都没有端粒酶活性表达，因而端粒酶已成为新的肿瘤标志物，也可能成为肿瘤基因治疗新的突破口 [3]。目前，有关端粒酶的研究已广泛开展，尤其是对端粒酶活性表达起限速作用的端粒酶逆转录酶的研究已成为热点，对其表达和调控作用亦有许多新的认识。本文仅将端粒酶逆转录酶的表达及其调控研究作一综述。     

食管鳞癌组织端粒酶亚基的表达及端粒酶活性的关系

目的　探讨食管鳞癌组织中端粒酶活性、端粒酶逆转录酶 (h TERT)及端粒酶相关蛋白 - 1(TP- 1)的表达及其关系。方法　应用 TRAP-银染法对 45例食管鳞癌组织端粒酶活性的检测 ,同时应用原位杂交对癌组织切片进行 h TERT、TP- 1的 m RNA表达的检测。结果　癌组织端粒酶活性阳性率为 82 .2 %。癌组织中不同分化程度的端粒酶活性差异无显著性 (P>0 .0 5 )。有淋巴结转移者癌组织端粒酶活性明显高于无淋巴结转移者 ,差异有显著性(P<0 .0 5 )。癌组织中 h TERTm RNA表达的阳性率为 6 4.4%,TP- 1的阳性率为 6 2 .2 %。 h TERT的 m RNA表达与端粒酶活性密切相关 ,而 TP- 1的 m RNA表达与端粒酶活性无相关。结论　食管鳞癌组织中端粒酶活性及h TERT、TP- 1的 m RNA表达均较高。端粒酶活性与淋巴结转移有关。 h TERT与端粒酶活性有密切关系。     

食管黏膜脱落细胞DNA倍体和端粒酶活性检测对食管癌诊断的价值

目的 :探讨胃镜直视下刷取食管病灶处的黏膜细胞的端粒酶活性及DNA倍体分析对食管良恶性疾病的鉴别诊断价值 ,能否为大规模开展食管拉网细胞进行分子生物水平普查食管癌奠定基础。方法 :采用TRAP PCR银染定性法对78例食管黏膜脱落细胞进行端粒酶活性分析 ,同时进行流式细胞DNA倍体分析 ,经病理组织学证实食管癌 45例 ,食管良性疾病 3 3例。结果 :端粒酶活性在食管癌组中的阳性率为 88 89% ( 4 0 /4 5 )明显高于食管良性疾病组的 9 0 9% ( 3 /3 3 ) ,食管癌组的黏膜脱落细胞DNA倍体的阳性率为77 78% ( 3 5 /4 5 )明显高于食管良性疾病组的3 0 3 % ( 1/3 3 ) ,食管癌组中端粒酶活性和DNA倍体分析同时阳性为 71 11% ( 3 2 /4 5 ) ,食管良性疾病组中端粒酶活性和DNA倍体分析同时阳性为 0 ( 0 /3 3 ) ,端粒酶活性联合DNA倍体分析对食管癌的诊断率为 95 5 6% ( 4 3 /4 5 ) ,端粒酶活性联合DNA倍体分析区别食管病变良恶性的敏感度为 95 5 6% ( 4 3 /4 5 )、特异度为 10 0 0 0 % ( 3 3 /3 3 )。结论 :食管黏膜脱落细胞DNA倍体分析联合端粒酶活性测定是诊断食管癌特异而敏感的方法 ,为大规模开展食管拉网细胞进行分子生物水平普查食管癌奠定基础     

Attenuation of telomerase activity by hammerhead ribozyme targeting human telomerase RNA induces growth retardation and apoptosis in human breast tumor cells

Ribozyme possesses specific endoribonuclease activity and catalyzes the hydrolysis of specific phosphodiester bonds, which results in the cleavage of target RNA sequences. Here, we evaluated the ability of hammerhead ribozymes targeting human telomerase RNA (hTR) to inhibit the catalytic activity of telomerase and the proliferation of cancer cells. Hammerhead ribozymes were designed against 7 NUX sequences located in open loops of the hTR secondary structure. We verified the ribozyme specificity by in vitro cleavage assay by using a synthetic RNA substrate. Subsequently, we introduced ribozyme expression vector into human breast tumor MCF-7 cells and assessed the biologic effects of ribozyme. Hammerhead ribozyme R1 targeting the template region of hTR efficiently cleaved hTR in vitro, and stable transfectants of this ribozyme induced the degradation of target hTR RNA and attenuated telomerase activity in MCF-7 cells. Moreover, the ribozyme R1 transfectant displayed a significant telomere shortening and a lower proliferation rate than parental cells. Clones with reduced proliferation capacity showed enlarged senescence-like shapes or highly differentiated dendritic morphologies of apoptosis. In conclusion, the inhibition of telomerase activity by hammerhead ribozyme targeting the template region of the hTR presents a promising strategy for inhibiting the growth of human breast cancer cells.     

端粒、端粒酶及端粒酶催化亚基在大肠癌中的作用

目的:探讨端粒、端粒酶活性及端粒酶催化亚基蛋白(hTERT)在大肠癌发生发展、侵袭转移中的作用。方法:应用Southern blot、端粒重复序列扩增(TRAP)和免疫组织化学方法检测端粒长度(terminal restrictionfragments,TRFs)、端粒酶活性及hTERT表达水平。结果:大肠癌TRFs明显缩短,且随大肠癌Dukes分期的进展进一步缩短;端粒酶活性及hTERT在大肠癌组织中的阳性表达率分别为83.33%及76.67%,显著高于其他组织(P<0.05);大肠癌组织端粒酶与淋巴结转移关系密切,伴淋巴结转移大肠癌组织中的端粒酶活性及hTERT阳性表达率为80%和70%,显著高于无淋巴结转移者的0%和5%(P<0.05);相关分析显示端粒酶活性与hTERT蛋白表达存在显著相关性(P<0.05)。结论:端粒的短缩及端粒酶的活化与大肠癌的发生发展密切相关,hTERT的表达对端粒酶的激活可能起着重要作用。     

脾酪氨酸激酶与食管鳞状细胞癌的关系

目的：探讨脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义。方法：采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测30例食管鳞癌组织、27例食管鳞癌癌旁组织及30例相对正常食管黏膜组织中Syk mRNA的表达;应用免疫组化技术检测39例食管鳞癌组织、27例食管鳞癌癌旁组织及38例相对正常食管黏膜组织中Syk蛋白的表达并分析其与临床病理学指标间的关系。结果：食管鳞癌组织中Syk mRNA表达高于癌旁组织和正常食管黏膜组织,但差异无统计学意义（P〉0.05）。Syk蛋白在食管鳞癌组织中的阳性率（34/39,87.2%）明显高于食管鳞癌癌旁组织（18/27,66.7%）和正常食管黏膜组织（26/38,68.4%）（P〈0.05）。Syk蛋白表达与食管鳞癌患者年龄、性别、肿瘤大小、临床分期均无明显相关关系（P均〉0.05）。结论：Syk mRNA和蛋白在食管鳞癌组织中表达增高,但Syk蛋白表达与临床病理学指标无相关关系。     

Attenuation of Telomerase Activity by siRNA Targeted Telomerase RNA Leads to Apoptosis and Inhibition of Proliferation in Human Renal Carcinoma Cells

OBJECTIVE Telomerase is an attractive molecular target for cancer therapy because the activation of telomerase is one of the key steps in cell immortalization and carcinogenesis. RNA interference using small-interfering RNA (siRNA) has been demonstrated to be an effective method for inhibiting the expression of a given gene in human cells. The aim of the present study was to investigate whether inhibition of telomerase activity by siRNA targeted against human telomerase RNA (hTR) can inhibit proliferation and induce apoptotic cell death in human renal carcinoma cells (HRCCs). METHODS The siRNA duplexes for hTR were synthesized and 786-0 HRCCs were transfected with different concentrations of hTR-siRNA. The influence on the hTR mRNA level, telomerase activity, as well as the effect on cell proliferation and apoptosis was examined. RESULTS Anti-hTR siRNA treatment of HRCCs resulted in specific reduction of hTR mRNA and inhibition of telomerase activity. Additionally, significant inhibition of proliferation and induction of apoptosis were observed. CONCLUSION siRNA against the hTR gene can inhibit proliferation and induce apoptosis by blocking telomerase activity of HRCCs. Specific hTR inhibition by siRNA represents a promising new option for renal cancer treatment.