水蛭不同工艺提取物抗凝与纤溶活性比较及酶解物组成分析

目的:比较水蛭不同提取工艺的抗凝溶栓作用;初步确定水蛭酶解产物的化学成分组成。方法:通过活化部分凝血活酶时间(APTT)试验及纤维蛋白平板试验,比较水蛭胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、仿生酶解、醇提、水煎提取物的体外抗凝与纤溶活性差异。采用Sephadex G-100凝胶柱色谱法对优选提取物进行进一步分离纯化,并采用MALDI-TOF-质谱法对其组成进行分析。结果:与生理盐水组比较,在相同的剂量下,水蛭胃蛋白酶酶解物可明显延长大鼠APTT,并具有较强的纤溶作用,其余几种提取物的作用不明显。胃蛋白酶酶解物经Sephadex G-100凝胶柱色谱分离纯化的活性部位经MALDI-TOF-质谱法检测为分子量在700～3 200之间的一组寡肽。结论:胃蛋白酶酶解是水蛭较为理想的提取方法,其有效部位的组成为寡肽。     

北冬虫夏草多肽酶解工艺及对小鼠免疫功能的影响

目的研究北冬虫夏草多肽的酶解提取工艺及对小鼠免疫功能的影响。方法选用胃蛋白酶和胰蛋白酶,分别采用单酶酶解法和双酶酶解法,按不同酶解条件设计正交试验,通过测定水解度获得最佳水解条件。将小鼠随机分为空白对照组,模型组,北冬虫夏草多肽低(32 mg/kg)、中(160 mg/kg)、高剂量组(800 mg/kg)和阳性药组,连续灌胃45 d,用环磷酰胺在给药结束前5 d通过腹腔注射造模,连续2 d,给药结束后测定各项指标。结果采用胃蛋白酶,水解时间5 h,加酶量2.5%,底物为12%时酶解效果最佳。北冬虫夏草多肽能促进小鼠免疫器官的生长,增加小鼠血液中白细胞的数量,增强绵羊红细胞诱导小鼠足肿胀程度,提高小鼠血清中溶血素的含有量。结论北冬虫夏草多肽具有提高小鼠免疫力的作用。     

虾蛄多肽的酶解工艺及其抗肿瘤活性的初步研究

目的:通过正交试验优化酶解条件,提取分离虾蛄软体组织,根据其体外抗肿瘤活性,筛选最佳酶解条件。方法:采用L16(45)正交试验设计方法,通过探索其抗前列腺癌作用,优化胰蛋白酶酶解虾蛄多肽的提取条件。结果:虾蛄多肽酶解最佳条件为:料液比1∶2,pH为7.5,加酶量为1000u/g,温度40℃,时间为4h,其对前列腺癌PC-3细胞株的体外抑制率为60.9%。结论酶解所得的虾蛄多肽对前列腺癌细胞具有一定的抑制生长作用。     

正交试验法优选骨洗方气雾剂提取工艺的研究

目的:优选骨洗方气雾剂的最佳水提醇沉工艺。方法:采用正交实验对水提与醇沉工艺进行研究。结果:最佳水提醇沉工艺为药材加8倍量水,浸泡2h,煎煮3次,每次1.5h,水提液过滤合并浓缩至0.75g/ml(生药∶药液),用95%乙醇调醇浓度至55%,沉淀24h,过滤得骨洗方药液,此提取工艺的确定为大生产提供了科学的依据。结论:制剂稳定,此方法可作为骨洗方气雾剂的最佳提取工艺。     

基于蛋白免疫印迹的水蛭抗凝活性成分研究

目的：建立Native-PAGE结合Western blot检测水蛭活性多肽与凝血酶相互作用产物的方法,探究水蛭有效抗凝成分。方法：本研究分别提取宽体金线蛭、日本医蛭两种水蛭虫体总蛋白及日本医蛭唾液蛋白,用凝血酶滴定法测定其抗凝血酶活性,Western blot检测凝血酶-活性多肽复合体。结果：研究发现两种水蛭Native-PAGE-WB均检测到凝血酶-活性多肽复合体,且SDS-PAGE-WB检测到复合体变性后产生凝血酶条带。结论：建立的Native-PAGE-WB法可有效检出水蛭活性多肽和凝血酶相互作用产物,且发现同水蛭素类似,宽体金线蛭活性抗凝多肽与凝血酶在体外也能形成稳定的蛋白复合体。     

基于体外药效实验的全蝎提取工艺研究

目的:以体外药效实验为指标研究全蝎提取工艺.方法:以APTT法、纤维蛋白原平板法为考察指标,对仿生酶解、复合酶解、水提醇沉、生理盐水浸提各法的提取效果进行比较.结果:仿生酶解法凝血时间最长,抗血栓效果明显.酶解的条件拟为:全蝎先用37℃人工胃液加入3.0%(酶底比)胃蛋白酶酶解3h,残渣转入37℃人工肠液加入5%(酶底比)胰蛋白酶酶解4 h.结论:仿生酶解法适于提取全蝎抗凝血和溶栓的有效部分.     

北冬虫夏草活性多肽的制备工艺研究

目的通过酶解法制备北冬虫夏草活性多肽并筛选出最佳酶解条件。方法分别用胃蛋白酶和胰蛋白酶对北冬虫夏草进行单酶酶解,然后先加胃蛋白酶后加胰蛋白酶进行双酶酶解。按时间,加酶量和底物浓度不同条件采用正交试验,通过茚三酮比色法检测水解度优化最佳酶解工艺,采用MTT法检测单酶酶解液和双酶酶解液对PC12细胞活性的影响。结果胃蛋白酶和胰蛋白酶水解度测定吸光度最大值分别为0.899和0.788,对应酶解时间、加酶量和底物浓度都是5h、2.5%和12%;双酶酶解在此条件下的吸光度值为0.875。酶解液对PC12细胞修复率影响最大值为139.59%,对应样品为胃蛋白酶酶解原液稀释10~(-6)倍。结论胃蛋白酶酶解效果高于胰蛋白酶和双酶。     

酶解辅助提取广藿香挥发油成分分析与抗肿瘤活性初探

目的:优化广藿香挥发油的提取方法并考察其抗肿瘤活性。方法:在蒸馏法提取广藿香油之前进行酶解处理,通过正交试验研究酶的用量、酶解时间、温度以及pH对广藿香油提取率的影响,优选最佳工艺。采用气-质联用(GC-MS)测定广藿香挥发油的组成以及各成分的相对百分含量。通过MTT法测定广藿香油对Hela细胞增殖活性的抑制作用。结果:酶辅助提取广藿香油的最佳条件是:酶用量为生药重量的1%,在pH 4.5,45℃条件下酶解1 h;药典法、酶解法提取的总挥发油的提取率分别为2.2220、3.1360 mg/g;两种方法提取的广藿香油抑制He-la增殖细胞活性的IC50分别为:12.2±0.46、0.36±0.03μg/mL。结论:酶解法可提高广藿香挥发油的提取率,该法提取的广藿香油抑制Hela细胞增殖的活性强于药典法提取的广藿香油。     

鹿茸冻干粉的酶解及其酶解产物性质的研究

目的:通过研究鹿茸冻干粉酶解产物的促成骨细胞增殖活性,抗氧化性以及血管紧张素转化酶Ⅰ(angiotensin Ⅰ-converting enzyme,ACE,EC3.4.15.1)抑制活性,为阐明鹿茸强筋健骨的机制以及揭示鹿茸体内生理功能发挥的机制提供研究线索.方法:采用体内常见的消化酶胃蛋白酶和胰蛋白酶分别和同时对鹿茸冻干粉进行酶解,确定酶解完全的条件,收集相对分子质量小于1万的多肽混合物,对其抗氧化性,ACE抑制活性以及促成骨细胞增殖活性进行研究.结果:鹿茸冻干粉的不同酶解产物对羟自由基的清除效果非常明显,其IC50均低1 g·L-1,远低于维生素C的5.5 g·L-1,同时胃蛋白酶和双酶酶解产物对ACE抑制效果极佳,胰蛋白酶酶解产物对大鼠成骨细胞(UMR-106细胞)的促增殖作用达73.43%.结论:本实验进一步验证了鹿茸强筋健骨以及强身抗老等传统功效,对于ACE抑制活性的试探性研究也表明鹿茸酶解产物具有潜在的高血压防治功能;本实验结果也为进一步分离提取鹿茸酶解产物中的抗氧化性多肽,ACE抑制活性肽以及促成骨细胞活性肽提供强有力的依据.     

抗凝血酶效价测定法综合考察水蛭的提取工艺

目的:通过考察水蛭提取物的抗凝血生物活性,确定水蛭的最佳提取工艺,保证水蛭抗凝血活性成分获得最大保留。方法:选择浸泡时间、煎煮次数、煎煮时间、水与水蛭质量比为考察因素,按L9(34)正交设计因素水平表排列,考察水蛭提取物得率和提取物的凝血酶效价。结果:水蛭的最佳提取工艺为水蛭药材先用10倍量的水浸泡4h,加水煎煮3次,每次煎煮1.5h。结论:水蛭经水提、乙醇精制后凝血酶活性依然保留完好,得率与凝血酶效价呈正相关。此工艺对水蛭提取物的生产简便可行。     

正交试验结合HPLC指纹图谱优选丹参总酚酸的提取工艺

目的:优选丹参中丹参总酚酸的最佳提取工艺。方法:采用HPLC指纹图谱技术,以5个成分(丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B)的含量、丹参总酚酸提取物干浸膏得率及丹参总酚酸提取物的HPLC特征图谱的共有峰总面积之和为综合评判指标,通过L_9(3~4)正交试验设计来考察料液比、提取时间、醇沉溶液的含醇量等因素对丹参总酚酸提取物提取工艺的影响。结果:最佳提取工艺是料液比为1∶12(g/m L)、提取时间为1.5 h、醇沉溶液的含醇量为70%。结论:该实验建立了丹参总酚酸提取物的最佳提取工艺,补充药典中关于丹参总酚酸提取物提取条件的空缺,为以后丹参总酚酸提取物的进一步研究提供了依据。     

马鹿茸多肽提取工艺研究

目的:优选马鹿茸多肽水提取乙醇沉淀的最佳工艺。方法:采用L9(34)正交设计法,以马鹿茸多肽含量为评价指标优选提取工艺,考察药材粒度、料液比、提取次数、提取时间等因素对水提取工艺的影响;考察乙醇醇沉前药液相对浓度、乙醇浓度、醇沉时间三因素对醇沉工艺的影响。结果:水提取的最佳工艺为鹿茸粒度80~100目,料液比1∶12,提取次数3次,每次20 min;乙醇沉淀工艺为药液相对浓度0.5 g·m L-1(生药)、乙醇浓度65%、醇沉时间4 h。结论:经过验证实试验该马鹿茸多肽的提取工艺稳定、简便、合理、可行。     

广金钱草总黄酮成分不同提取方法的比较

目的比较不同方法提取广金钱草中总黄酮成分的效果。方法以总黄酮提取率及HPLC指纹图谱评价水提法、醇提法、酶解法和半仿生法提取广金钱草的效果,紫外分光光度法测定总黄酮含有量,HPLC指纹图谱共有模式评价各提取液中黄酮类共有成分的变化。结果酶解法与醇提法的总黄酮得率都较高,其中前者对广金钱草的特征成分夏佛塔苷的提取效果更好,而水提法与半仿生法的提取效果较差,尤以后者为甚。结论 4种提取方法的效果依次为酶解法醇提法水提法半仿生法。     

土鳖虫仿生酶解法提取工艺研究

目的研究土鳖虫的仿生酶解法提取工艺。方法采用正交实验优选仿生酶解的最佳工艺条件。结果土鳖虫仿生酶解最佳工艺条件为:药材粉碎过80目筛,加10倍量水煮沸15 min,待冷至40℃,以稀盐酸溶液调节p H1.5~2.0,加入1%土鳖虫量的胃蛋白酶,40℃保温酶解1 h,以20%氢氧化钠溶液调节p H7.5~8.0,加入1%土鳖虫量的胰蛋白酶,40℃保温酶解3 h,加热煮沸15 min,即得。结论优选出的提取工艺条件合理、可行、提取效率高。     

广西特色壮药金边蚂蟥抗痛风活性成分研究

目的：研究金边蚂蟥中具有抗痛风作用的活性成分。方法：采用次黄嘌呤复制小鼠高尿酸血症模型,二甲苯诱导小鼠耳郭肿胀模型,热板法、扭体法筛选金边蚂蟥的活性部位,筛选金边蚂蟥活性成分,观察金边蚂蟥抗抗痛风作用的物质基础。结果：金边蚂蟥水溶性部位是其抗痛风的活性部位,可降低次黄嘌呤诱导的高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平,可抑制二甲苯诱导的小鼠耳郭肿胀,可减少醋酸诱导的小鼠扭体反应和增加小鼠热板痛阈;水溶性部位中水蛭素是主要活性成分。金边蚂蟥活性成分（水蛭素）0.8 g/kg和0.4 g/kg及金边 蚂蟥续滤粉2.0 g/kg 可显著降低血清尿酸水平,血清尿酸水平由模型组的232.73±50.93 umol/L 分别下降到140.70±25.97 umol/L、149.07±39.28 umol/L、176.45±44.33 umol/L（P ＜ 0.01）;金边蚂蟥活性成分（水蛭素）0.8 g/kg、0.4 g/kg和0.2 g/kg及金边蚂蟥续滤粉2.0 g/kg可明显抑制二甲苯引起小鼠耳郭肿胀,肿胀度由22.80±2.86 mg分别抑制到20.10±2.18 mg、19.80±2.57 mg、20.10±1.66 mg、20.85±1.60 mg（P ＜ 0.05）;金边蚂蟥活性成分（水蛭素）0.8 g/kg,可明显降低醋酸引起的小鼠扭体次数,次数由22.80±2.86次降到20.10±2.18次（P ＜ 0.05）。结论：金边蚂蟥抗痛风的活性部位是水溶性部分,其中水蛭素是其主要活性成分。     

影响胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性因素初探及其纤溶活性失活研究

目的通过探讨影响胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的因素及其纤溶活性失活方法,排除胃蛋白酶和胰蛋白酶对中药鼠妇Armadillidium vulgare活性粗蛋白纤溶活性检测的干扰,以在鼠妇活性粗蛋白酶解过程,获取相对分子质量更小、效价更高的蛋白质或多肽。方法采用纤溶蛋白平板法分别研究pH值、温度、金属离子、酶抑制剂和表面活性剂对胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的影响,以获取较佳的酶失活工艺,并研究较佳酶失活工艺对尿激酶、蚓激酶、鼠妇纤溶酶纤溶活性的影响。结果 pH值、温度、金属离子、酶抑制剂和表面活性剂均可对胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性产生影响,其中胃蛋白酶的最优失活方案为pH 6.0~8.0;胰蛋白酶的最优失活方案为质量浓度25 mg/mL TLCK和浓度1 mmol/L EDTA的混合制剂。结论研究所获取的较佳酶失活工艺,可用于以纤维蛋白平板法检测胃蛋白酶、胰蛋白酶降解产物的纤溶活性,操作简单,重复性好,稳定性好。     

不同配比美白中药方剂乙醇提取物对酪氨酸酶抑制效果比较

目的:分析不同配比美白中药方剂乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用。方法:当归、白附子、玉竹、白芷、姜黄、甘草等药材按不同配比组方,采用85%乙醇提取,考察不同配比美白方剂的乙醇提取物对酪氨酸酶及B16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用和对细胞内酪氨酸酶活性的影响。结果:处方1(质量比为1∶1∶1∶0.3∶1∶3)乙醇提取物对酪氨酸酶活性及对B16黑色素瘤细胞增殖及细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用均最强,其IC50分别为0.77mg/m L、679μg/m L、409μg/m L。结论:处方1乙醇提取物具有较好的美白效果。     

中药牛骨髓中蛋白与多肽提取方法的比较研究

目的研究中药牛骨髓中蛋白、多肽类成分的提取方法、结构信息及其抗菌活性,提高药用价值。方法采用10种提取和3种制备方法,以蛋白含量、提取率、水解度、抗菌活性和相对分子质量等为考察指标,筛选牛骨髓蛋白与多肽的最佳提取和制备部位方法。结果水、NaCl溶液和Tris-HCl溶液提取法得到的蛋白综合指标较高,其蛋白量分别为(52.20±0.58)、(50.19±0.21)、(43.21±0.05)mg/m L,抗菌活性的强弱与蛋白量高低有一定的关系;电泳图谱显示,牛骨髓蛋白样品具有2级谱带,分别为蛋白谱带(66 000)与多肽谱带(4 100~10 000);LC/MS数据显示,水提、0.5 mol/L NaCl和30%(NH_4)_2SO_4部位多肽相对分子质量分别为1 027.84~9 916.32、1 131.17~4 989.95、1 150.46~9 917.00,与其电泳谱带基本吻合。结论水提法操作较简单、快速、成本低,适合于工业化生产;采用SDS-PAGE和LC/MS对牛骨髓蛋白进行分析,为构建其指纹图谱提供理论依据。     

柱前衍生-HPLC法对水蛭的指纹图谱及其16种氨基酸含量测定研究

目的建立18批水蛭药材游离类氨基酸柱前衍生-高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的分析方法,并完成对水蛭中16种游离和水解氨基酸成分的同时定量。方法加水超声提取游离氨基酸,以6 mol/L盐酸提取水解氨基酸;基于异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法,以氨基酸分析专用色谱柱(4.6×250 mm,5μm);流动相A为0.1 mol/L无水乙酸钠(pH 6.5)-乙腈(93∶7),B为乙腈-水(4∶1);流速0.8 mL/min,检测波长254 nm,柱温40℃进行梯度洗脱。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012 A版)”、SAS和SIMCA-13.0进行药材的相似度评价和聚类分析。结果建立了18批水蛭药材中游离氨基酸HPLC指纹图谱的共有模式,确定25个共有峰,并指认16种氨基酸成分;18批药材相似度均高于0.960;聚类分析与主成分分析结果一致,均将药材分为3类;含量测定结果表明不同批次的药材中氨基酸含量差异较大,水解氨基酸中含量最高的谷氨酸范围为7.26~18.36 mg/g,游离氨基酸含量最高的丙氨酸范围为1.43~4.39mg/g。结论建立了18批水蛭药材中游离类氨基酸的HPLC指纹图谱,同时测定了18批水蛭药材中游离和水解氨基酸的含量,该方法准确,重复性好,可全面反映水蛭药材的氨基酸信息,为该药材的质量控制提供一定的参考依据。     

夏枯草抗疱疹病毒多糖的提取及纯化工艺研究

目的:优化夏枯草抗疱疹病毒多糖的提取及纯化工艺,为新药研究提供科学依据。方法:以多糖含量和浸膏得率为指标,采用L9(34)正交试验法对夏枯草多糖提取过程中的提取次数,加水倍量及提取时间3个因素进行优化研究;以多糖含量及体外抗单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)活性为考察指标,对超滤和醇沉两种纯化技术进行比较。结果:最优水提工艺为第1次加水14倍,第2、3次加水12倍,提取3次,每次提取时间1.5 h;采用超滤和醇沉两种技术分别纯化所得多糖。通过MTT法测得醇沉多糖和超滤多糖抑制HSV-1的IC50分别为(93.99±13.12)μg/m L和(51.35±15.30)μg/m L,结果表明超滤技术制备的多糖提取物抗单纯性疱疹病毒活性显著高于醇沉技术。结论:采用超滤技术制备的夏枯草多糖具有较高的含量及抗单纯性疱疹病毒活性,可作为夏枯草多糖开发新药的纯化工艺。