早泄肾阳虚证血清蛋白质组学分析及蛋白质相互作用网络构建

目的鉴定早泄肾阳虚证血清蛋白质组,从蛋白质相互作用角度探索肾阳虚证发病机制。方法分别取4例早泄肾阳虚证患者及4名健康人外周血,提取血清蛋白,获取肾阳虚证相关蛋白质组,采用同位素标记相对和绝对定量技术鉴定肾阳虚证血清蛋白质组,采用STRING数据库构建肾阳虚证蛋白质相互作用网络,对各网络中蛋白质功能进行生物信息学分析。结果共鉴定血清蛋白质总数238个,其中有定量信息的162个。筛选差异表达蛋白质9个,其中1个上调,8个下调。肾阳虚证蛋白质相互作用网络由72个蛋白质节点和283对蛋白质相互作用构成,并可以聚为16个模块,其中蛋白质节点≥3的模块有10个。每个模块都有一个核心蛋白,其中C3、C5、C1S和MASP2为补体系统的组分蛋白,主要参与补体激活生物学过程。结论早泄肾阳虚证差异蛋白质相互作用网络中蛋白模块的功能主要富集于补体激活生物学过程,提示以补体激活途径异常为主导的免疫功能紊乱可能是肾阳虚证的主要病理机制之一。     

多囊卵巢综合征痰湿证患者血清差异蛋白质组学研究

目的 应用蛋白质组学探讨多囊卵巢综合征(PCOS)的潜在血清特异生物标志物。方法 分别采集2019年4月—2020年10月于山西省中西医结合医院和黑龙江中医药大学附属第一医院的12例PCOS痰湿证患者和同期健康对照者血清,采用相对和绝对定量同位素标记技术(iTRAQ)联合超高液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行蛋白组学分析,寻找差异表达的蛋白质。结果 经质谱分析共得到有意义差异蛋白646个,筛选出87种显著性差异蛋白(P<0.05),其中胰岛素样生长因子Ⅱ、胱抑素-C等10种蛋白表达上调,补体C3、载脂蛋白B、维生素D结合蛋白等77种蛋白表达下调。这些差异蛋白共涉及8条KEGG信号/代谢通路。结论 应用iTRAQ联合LC-MS/MS筛选出了PCOS痰湿证的血清差异表达蛋白,为寻找PCOS痰湿证特异性标志物提供了生物学基础。     

基于蛋白质相互作用网络分析右归丸治疗肾阳虚证的疗效机制

目的建立右归丸治疗肾阳虚证疗效相关的差异蛋白质相互作用网络,探索右归丸治疗肾阳虚证的疗效机制。方法对前期实验取得的蛋白质组数据作进一步数据挖掘。首先筛选肾阳虚证患者经右归丸治疗前后比较的差异表达蛋白,再采用STRING数据库构建差异蛋白质相互作用网络,定位网络中关键蛋白质相互作用关系,并以Ami GO数据库对联系紧密的蛋白质作Gene Ontology(GO)条目富集。结果筛选到7个差异表达蛋白质(P0.05)。这7个蛋白质与另外10个预测蛋白质构成的差异蛋白质相互作用网络包含17个节点(蛋白质)、57条边(相互作用关系),其中22个蛋白质相互作用关系的综合置信值0.7,其中C3、C5和CFH均为补体系统重要成分,其功能主要与免疫调节有关。结论右归丸对肾阳虚证的调控作用包括补体激活、创伤愈合、体液水平调节等多个方面,其中对补体系统的调节作用可能为右归丸促进肾阳虚证免疫平衡的重要机制之一。     

血清蛋白质组学技术筛选寻常型银屑病不同中医证型的差异蛋白

目的:研究不同证型寻常型银屑病患者血清中的差异表达蛋白,从蛋白质组学探讨寻常型银屑病的发病机理及微观辨证物质基础。方法:收集寻常型银屑病患者血瘀证、血虚证、血热证各10例,健康人10例的血清。应用蛋白提取、定量、双向电泳技术、质谱鉴定和数据库检索,找出寻常型银屑病组与正常组、寻常型银屑病组不同证型之间的差异蛋白。结果:寻常型银屑病组与正常组间差异蛋白有20种,寻常型银屑病组患者血液中纤维蛋白原β链、血液结合素、纤维蛋白γ链、HPX蛋白、α-胰蛋白酶、载脂蛋白A-Ⅳ、补体C3、凝聚素(载脂蛋白,片段)、血清转铁蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂H4重链(片段)、载脂蛋白E、补体C4-B、甘露糖结合蛋白-C、富亮氨酸-α-2-糖蛋白及血清白蛋白的表达明显升高,而血清白蛋白(片段)、甲状腺素转运蛋白、IgαC链、载脂蛋白L1、结合珠蛋白的表达则显著降低。其中,寻常型银屑病组不同证型之间也存在一定差异,补体C3、凝聚素、血清转铁蛋白等在血虚型寻常型银屑病患者的血清中表达高于其他两种证型的银屑病;纤维蛋白原β链、血液结合素等的表达在血热型寻常型银屑病患者血清中的表达水平高于血瘀型寻常型银屑病患者。结论:寻常型银屑病组和正常组以及寻常型银屑病不同中医证型间出现的血清蛋白差异表达,可能与寻常型银屑病的发病机制和银屑病不同证型的物质基础有关。     

基于iTRAQ技术的中医实热“上火”血清蛋白质组学特征分析

目的:筛选实热"上火"血清差异表达蛋白,为实热"上火"机制的深入研究提供科学依据。方法:采用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)对血清蛋白质进行检测,结合生物信息学分析(GO、STRING)筛选实热"上火"与正常非"上火"人群差异显著的蛋白质。结果:与正常对照组比较,实热上火组血清筛选出49个差异蛋白质,其中上调的22个,下调的27个。载脂蛋白C3(Apo C3)、乳酸脱氢酶(LDH)和维生素K依赖蛋白S(PROS1)等显著上调,而载脂蛋白A4(Apo A4)、超氧化物歧化酶3(SOD3)和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)等显著下调。结论:观察组脂质代谢、糖酵解异常与氧化应激、炎性反应的发生密切相关,且凝血功能下降,易造成出血,筛选的差异蛋白可为实热"上火"的生物学基础研究提供依据。     

中国小型猪痰瘀互结证冠心病模型的血清蛋白质组学研究

目的:研究中国小型猪痰瘀互结证冠心病模型血清蛋白表达谱的改变情况。方法:在建立中国小型猪痰瘀互结证冠心病模型基础上,应用双向电泳分离小型猪血清蛋白;通过图谱分析软件和基质辅助激光解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分别进行差异比较和质谱鉴定及数据比对。结果:小型猪痰瘀互结证冠心病模型组血清与正常组相比共有17个差异蛋白点,6个上调点,1个下调点,7个缺失点,3个特异表达的点。挖取这些差异蛋白点进行胶内酶解、MALDI-TOF质谱分析及MASCOT搜索引擎检索,鉴定出apolipoprotein E precursor(apoE)、complement component 4 binding protein(C4BP)等2种蛋白。结论:初步发现的差异蛋白可能与痰瘀互结证冠心病的形成、发生、发展相关,但是还需要通过其它方法做进一步验证。     

冠心病不同证候的蛋白质组学研究进展

从冠心病血瘀证、痰证、痰瘀互结证、气虚证、心肾阴虚证的蛋白差异表达进行评价,筛选出差异蛋白,探讨其诊断价值及证候发展规律;对冠心病蛋白质组学实验提出规范检测标准、优化实验设计、创新技术手段等建议。冠心病与正常组的差异蛋白为CD41、视黄醇结合蛋白、结合珠蛋白、血清白蛋白等;痰证以脂质代谢异常所导致的"高脂"为主要特点,其与血瘀证主要差异蛋白为载脂蛋白E、载脂蛋白H及巨噬细胞刺激蛋白1等;痰瘀互结证的特点为"高脂、高凝",其与痰证差异蛋白为纤维蛋白原β链、补体C4、载脂蛋白AI前体、载脂蛋白E、白蛋白等。心肾阴虚证与血瘀证的差异蛋白为补体C3、补体C1、载脂蛋白A-1、载脂蛋白4前体、载脂蛋白E等;气虚证与血瘀证的差异蛋白为补体C3、补体C4-A、补体C7、血浆血管舒缓素、血红素结合蛋白等。以上差异蛋白可作为辨别中医证型的依据。     

基于iTRAQ蛋白质组学技术筛选类风湿关节炎湿热瘀阻证血清标志物

目的筛选类风湿关节炎(RA)湿热瘀阻证差异蛋白,为进一步研究证候机制及临床辨治提供依据。方法以RA湿热瘀阻证与RA非湿热瘀阻证以及健康对照组各30例,收集血清标本,采用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术(iTRAQ)进行定量标记,再以超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-QE-MS)进行分析检测。所得质谱数据选用Thermo Proteome Discoverer 2.1软件进行蛋白的检索和鉴定,并以Western Blot对筛选蛋白进行验证。结果共得出RA湿热瘀阻证差异蛋白72个,其中上调蛋白25个,下调蛋白47个,RA非湿热瘀阻证中得出上调差异蛋白1个,下调蛋白11个。湿热瘀阻证上调蛋白中有6个蛋白(SAA1、AGP1、HP、AGP2、SAA4、CRP)表达与急性期炎症直接相关;有3个蛋白(ACTB、FGA、FGG)表达与血小板聚集、凝血、纤维蛋白凝块形成相关。与健康对照组比较,湿热瘀阻证组差异蛋白富亮氨酸α2糖蛋白(LRG1)表达水平差异有统计学意义(P0.05);与非湿热瘀阻证组比较,湿热瘀阻证组LRG1蛋白表达差异亦有统计学意义(P0.05)。结论 RA湿热瘀阻证与疾病的活动性存在重要联系。LRG1蛋白可作为RA湿热瘀阻证血清学标志物的价值之一。     

基于iTRAQ技术结合2D-LC-MS/MS研究黄连对CYP450同工酶表达的影响

黄连是临床常用药材,在中医药中被广泛应用,具有清热燥湿、泻火解毒之功,中药成分比较复杂,细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)同工酶是药物的主要代谢酶,研究黄连对CYP450酶的影响具有很重要的临床意义。实验选用大鼠肝脏组织,差速离心法分离肝微粒体,BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量,应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术结合2D-LC-MS/MS筛选差异蛋白。黄连一共鉴定出30个CYP450同工酶,7个表达上调,8个表达下调,15个没有发生变化。iTRAQ技术结合2D-LC-MS/MS可以全面研究CYP450酶,但黄连有必要进一步在体外水平对其进行评价,预防潜在的临床药物相互作用。     

肾阳虚大鼠股骨皮质骨差异蛋白质表达分析

目的比较分析肾阳虚证模型大鼠与正常大鼠股骨皮质骨差异表达蛋白质,从骨组织功能蛋白质角度初步探讨肾阳虚证的实质。方法 60只雄性WISTAR大鼠随机分为正常组和肾阳虚组,每组各30只,适应性喂养1周。肾阳虚组:臀部肌肉注射氢化可的松注射液2.5 mg/100 g,每日1次,自由饮水、饮食。正常组:自由饮食、饮水。注射造模干预15 d后继续观察3周。模型鉴定成功后分别获取肾阳虚组和正常组大鼠股骨皮质骨标本,进行总蛋白的提取制备。采用双向凝胶电泳(2-DE)技术展示2组大鼠的皮质骨蛋白质组图谱,应用PDQuest软件分析2组间差异表达蛋白点,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)初步鉴定差异表达蛋白点。结果 2组皮质骨2-DE凝胶图谱可辨别蛋白点数目为470个;与正常组比较,肾阳虚组皮质骨中存在12个已知的差异表达蛋白,其中载脂蛋白A-I、α烯醇化酶和热休克蛋白60表达上调,原肌球蛋白异构体2α-3链、I型胶原α-1链、GDP解离抑制因子β、LOC683667蛋白、白细胞酪氨酸激酶受体、线粒体ATP合酶亚基α、膜联蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白质二硫键异构酶A3表达下调。结论股骨皮质骨12个蛋白表达改变可能与肾阳虚证的发生有关。     

右归丸对肾阳虚证患者TLR4/MyD88/NF-κB信号通路表达的影响

目的探讨右归丸治疗肾阳虚证的免疫调控机制。方法筛选9例肾阳虚证患者,均给予右归丸口服,连服1个月。分别于治疗前后采集患者外周静脉血,制备外周血单个核细胞(PBMC),提取RNA,按照实时定量PCR(q PCR)实验流程,检测TLR4、My D88及NF-κBmRNA表达情况,并进行比较分析。结果治疗后,患者TLR4mRNA表达水平明显下调(P0.05),My D88、NF-κB mRNA表达水平均明显上调(P均0.05)。结论右归丸可以调节TLR4/My D88/NF-κB信号通路的表达,这可能是右归丸良性调节肾阳虚证免疫功能的分子机制之一。     

脾胃湿热证大鼠模型血清蛋白质组学差异表达研究

目的:通过分析脾胃湿热证模型大鼠血清蛋白质的差异表达,从蛋白质组学角度探讨脾胃湿热证的证候实质。方法:应用血清蛋白质组学、生物信息学等系统生物学方法,采用二维凝胶电泳(2-DE)分离技术分离脾胃湿热证模型大鼠血清蛋白质,获得差异表达蛋白质,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和数据库鉴定差异表达蛋白质。结果:发现12个具有明显表达差异的蛋白质斑点,经鉴定可以确定的9个蛋白质分别是备解素B因子、凝血因子Ⅱ、C-反应蛋白、alpha-胰蛋白酶抑制剂重链H4、载脂蛋白AI、重组人载脂蛋白AI、血小板凝血酶敏感蛋白、α-巨球蛋白、补体3。结论:筛选出来的差异表达蛋白质主要涉及机体免疫、物质代谢、炎症反应及血液流变学等,通过对脾胃湿热证模型大鼠蛋白质组差异表达的研究,从理论和技术的角度为运用蛋白质组学对脾胃虚实证候实质的深入研究提供了借鉴。     

肾阴虚、肾阳虚模型大鼠股骨皮质骨差异蛋白质表达的分析

目的研究肾阴虚、肾阳虚模型大鼠股骨皮质骨差异表达的蛋白质,从功能蛋白质组角度探讨肾阴虚、肾阳虚证的实质。方法将90只大鼠按随机数字表法分为正常组、肾阴虚组和肾阳虚组,每组30只,获取造模成功且表现稳定大鼠的股骨皮质骨,分别进行皮质骨总蛋白的提取制备、双向电泳(2-DE)、凝胶图谱的获取与分析、差异蛋白的质谱分析及相关功能的生物信息学检索。结果 3组大鼠股骨皮质骨总蛋白2-DE凝胶图谱可辨识蛋白点数目均为470个,与正常组比较,肾阴虚、肾阳虚组各有12个差异蛋白,其中有6个是肾阴虚、肾阳虚组共有的差异蛋白,4个表达趋势一致,分别为表达上调的载脂蛋白A-1、α烯醇化酶,表达下调的GDP解离抑制因子β、原肌球蛋白异构体2α-3链;有2个蛋白表达趋势相反,Ⅰ型胶原α-1链在肾阴虚组中表达上调,在肾阳虚组中表达下调;线粒体热休克蛋白60在肾阴虚组中表达下调,在肾阳虚组中表达上调;肾阴虚、肾阳虚组各有6个独自的差异蛋白,其中肾阴虚组有3个蛋白表达上调,3个蛋白表达下调;肾阳虚组6个蛋白表达均下调。结论大鼠股骨皮质骨中,4个共同且表达趋势一致的差异蛋白可以视为肾阴虚、肾阳虚证的共性功能蛋白质组;2个表达趋势相反及12个肾阴虚、肾阳虚组独自的差异蛋白可归为相应证型的差异功能蛋白质组。     

右归丸调控老龄肾阳虚免疫相关基因表达水平的研究

目的:研究右归丸对老龄肾阳虚体质干预前后其免疫相关基因定量表达水平的差异,探讨右归丸调控的分子靶向。方法:基于课题组前期获得的老龄肾阳虚证差异基因表达谱,筛选免疫相关差异表达基因28条。纳入老龄肾阳虚体质者,给予右归丸治疗28 d,以肾阳虚半定量诊断标准进行疗效评价,采用RT-PCR技术检测右归丸对老龄肾阳虚干预前后28条免疫相关基因的定量表达水平差异。结果:28条免疫相关基因经右归丸干预前后有7条基因存在表达水平差异。结论:经PCR验证的老龄肾阳虚免疫相关差异表达基因集中反映了肾阳亏虚对免疫系统功能的影响,提示肾阳虚体质与肿瘤发生可能存在某种关联机制。     

中医“实热”上火牙龈炎患者血清蛋白质组学特征研究

目的：采用蛋白组学技术研究牙龈炎,筛选实热“上火”血清差异表达蛋白,为实热“上火”机制引起的牙龈炎的进一步研究提供科学依据。方法：收集“实热”上火牙龈炎患者和健康对照者血清,采用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ),并对血清蛋白质进行检测。结合生物信息学分析(GO、STRING)筛选并鉴定出实热“上火”者与对照者人群差异显著的蛋白质。结果：筛选出实热“上火”牙龈炎组与正常对照组相比有43个差异蛋白,其中上调的有27个,下调的有16个。C反应蛋白（CRP）、载脂蛋白家族（ApoC2,APOD,APOM）、血清淀粉样酶A(SAA)、凝血因子12等显著上调,而α-1抗胰蛋白酶（AAT）、热休克蛋白(HSPB1)、微管蛋白等显著下调。结论：实热“上火”牙龈炎组脂质代谢异常与氧化应激、细胞凋亡、炎症反应的发生密切相关。通过研究分析凝血功能下降,易造成出血,筛选的差异蛋白可为实热“上火”牙龈炎的生物学基础研究提供理论依据。     

基于蛋白质组学技术筛选葛根芩连汤防治胰岛素抵抗作用的血清差异表达蛋白

目的采用蛋白质组学技术筛选鉴定2型糖尿病胰岛素抵抗模型大鼠模型组、葛根芩连汤组血清差异表达蛋白,推测葛根芩连汤防治胰岛素抵抗的机制。方法葛根芩连汤组和模型组通过体内高脂饲料联合链脲佐菌素建立大鼠胰岛素抵抗动物模型,连续灌胃给药3个月,于末次给药后1h,取血清,去除高丰度蛋白后,进行蛋白变性、还原、烷基化、酶解及脱盐后,利用液相Thermo EASY-nlc1000和质谱仪LTQ orbitrap Elite分析鉴定,利用Xcalibur软件和Thermo Proteome discoverer1,4进行数据处理,采用SIEVE v2.1×64进行无标定量分析寻找相关差异蛋白,筛选并鉴定差异表达蛋白,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析。结果通过质谱鉴定分析,葛根芩连汤组与模型组差异表达蛋白76个,其中上调49个,下调27个。分析显示差异蛋白主要涉及细胞周期调控、炎症反应、信号通路调节等生物过程。其中上调蛋白磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)(Q63788)、胰岛素受体底物蛋白(IRS)(P35570)等以及下调蛋白载脂蛋白C-Ⅲ(APOC-Ⅲ)(P06759)、肝型脂肪酸结合蛋白(FABP1)(P02692)等差异蛋白可能参与了胰岛素信号转导等通路。结论通过有效的比较分析,得到了一些参与胰岛素信号转导等通路的差异表达蛋白,为研究葛根芩连汤防治胰岛素抵抗的分子机制提供了新靶点。     

应用iTRAQ技术构建胃癌唾液的蛋白质组差异表达谱

目的：应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术标记定量蛋白组技术对胃癌患者唾液的全组蛋白进行鉴定和定量分析,初步获得胃癌患者唾液的蛋白组差异表达图谱。方法：胃癌患者与正常人唾液各10例,各组等量混合后利用iTRAQ8标试剂标记后的样本,采用Nano—LC—Ms／Ms分离、分析肽段,运用Proteinpilot4．0软件对蛋白进行鉴定和定量分析,并比较这些蛋白的表达差异。结果：对样品进行了2次Nano—LC—Ms／Ms,标记率〉95％,错误发现率〈1％,鉴定出符合假阳性率〈1％,共鉴定了747个蛋白。与正常对照组相比,胃癌组共出现了2倍以上表达差异的蛋白质21个,其中上调的12个,下调的9个。结论：iTRAQ联合NanoLC—MS／MS技术能高通量地筛选胃癌患者唾液中相关的蛋白,为胃癌患者早期诊断和预后提供可能的生物学标志物或治疗靶点,建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。     

iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在生命科学领域中的应用

同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术—利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团,经高精度质谱仪串联分析,可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量,是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术,正迅速被广大学者所接受。主要从iTRAQ实验技术概要、iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在生命科学领域中的应用、问题与展望等三个方面进行简要总结。     

右归丸治疗肾阳虚型慢性肾脏病2～3期的临床疗效研究

[目的]观察右归丸治疗肾阳虚型慢性肾脏病2~3期的临床疗效。[方法]选取80例肾阳虚型慢性肾脏病2~3期患者,随机分为治疗组和对照组,对照组(40例)予西医一体化治疗,治疗组(40例)在西医一体化治疗的基础上加用右归丸,观察两组患者在治疗前、治疗后的血清肌酐(Scr)、估算肾小球滤过率(e GFR)、24 h尿蛋白定量及中医证候积分的变化情况,观察周期为24周。[结果]在血清Scr、24 h尿蛋白定量、e GFR及中医证候改善方面,治疗组均优于对照组(P0.05)。[结论]右归丸可有效改善肾阳虚型慢性肾脏病2~3期患者的中医证候积分及其肾功能,降低24 h尿蛋白定量,具有一定的肾脏保护作用,并且临床运用安全。     

右归丸加减联合激素替代疗法治疗肾阳虚型卵巢早衰30例临床观察

目的:观察右归丸加减联合激素替代疗法治疗肾阳虚型卵巢早衰的临床疗效。方法:将60例肾阳虚型卵巢早衰患者随机分为中西医组和西医组各30例,中西医组采用右归丸加减联合激素替代疗法治疗,西医组采用单纯激素替代治疗。连续用药3个月后观察两组患者的中医临床症状,检测血清卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)水平,运用阴道超声对卵巢体积(OV)、卵巢动脉收缩期峰值流速(PSV)、阻力指数(RI)进行检测。结果:两组患者治疗后中医证候总积分,血清FSH、E2值,OV、PSV、RI值比较,差异有统计学意义(P0.05);治疗后两组的总体疗效比较,差异有显著统计学意义(P0.01),且中西医组的总体疗效明显优于西医组。结论:右归丸加减联合激素替代治疗对肾阳虚型卵巢早衰患者的临床症状、血清激素水平、卵巢功能均有明显的改善作用,与西医组比较具有更明显的优势。