苏木对糖尿病大鼠血管内皮细胞自噬相关蛋白表达的影响

目的探讨中药苏木通过调控BECN1、LC3-Ⅱ、p62自噬相关蛋白表达,对糖尿病大鼠血管内皮细胞的保护作用。方法将30只雄性SD大鼠随机分10只为正常组,其余20只进行糖尿病造模。成模后分为模型组与苏木组。苏木组给予810mg/kg每日1次灌胃。4周后,3组大鼠取主动脉,运用HE染色、透射电镜观察主动脉结构,Western-blot检测BECN1、LC3-Ⅱ、p62蛋白表达。结果苏木组血管平滑肌规则,厚薄均匀;透射电镜显示自噬体数量增多;Western-blot检测BECN1、LC3-Ⅱ的蛋白表达增加,p62的蛋白表达下降。结论苏木能调控自噬相关蛋白,保护糖尿病大鼠血管内皮的损伤。     

针灸对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织自噬相关蛋白的影响

摘要：目的 观察针刺、艾灸对类风湿关节炎大鼠滑膜组织自噬相关蛋白表达的影响,探究针灸治疗RA的可能作用机制。方法 将50只大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组、针刺组、艾灸组，每组10只，将正常组以外的4组大鼠足跖底部注射0.1ml完全弗氏佐剂造模，阳性药组按照 0.1 mg/100 g 的剂量进行甲氨蝶呤灌胃，1 次/3d（每周2次）；针刺组针刺肾俞、足三里，每穴20分钟；艾灸组艾条温和悬灸针刺相同穴位，每穴20分钟；每组治疗21d；正常组和模型组不予治疗。分别在造模成功后、治疗结束后测量AI指数和足爪容积的指标， ELISA法检测大鼠血清TNF-α，IL-1β水平，Western blot法检测滑膜组织中LC3-II、Beclin-1蛋白表达。结果 造模后大鼠关节均明显肿胀，治疗后的大鼠关节肿胀度均有改善；与正常组比较，模型组LC3-II蛋白表达上升（P＜0.05）、Beclin1蛋白表达明显上升（P＜0.01），阳性药组和针刺组Beclin1蛋白表达上升显著（P＜0.01）；与模型组相比，针刺组LC3-II蛋白表达明显下降（P＜0.01）、Beclin1蛋白表达上升（P＜0.05），艾灸组LC3-II蛋白表达下降（P＜0.05）、Beclin1蛋白表达显著升高（P＜0.01）。结论 针刺、艾灸均对类风湿关节炎有治疗效果，其机制可能与抑制自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1蛋白表达有关。     

丹参酮ⅡA注射液对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠皮质神经元自噬及Akt-mTOR通路的影响

目的观察丹参酮ⅡA注射液对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠皮质神经元自噬及Akt-mTOR通路影响并探讨其机制。方法 7日龄SD新生大鼠80只,随机平均分为5组,分别为假手术组、模型组及经丹参酮ⅡA处理的高剂量组(0.1 mg/g)、中剂量组(0.05 mg/g)、低剂量组(0.02 mg/g)。Rice法造模,透射电镜观察新生大鼠大脑皮质神经元变化情况,TTC染色检测脑梗死情况,蛋白免疫印迹检测脑组织LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt、p-mTOR、p-S6蛋白表达情况。结果假手术组神经元结构正常,模型组中观察到皮质神经元中存在大量的自噬体和自噬溶酶体,其中泡状自噬体中包裹有可见的细胞质结构。相较于模型组,高剂量组、中剂量组、低剂量组中自噬体数量明显减少,且呈一定的剂量依赖性(P 0.05)。与假手术组相比,模型组中幼鼠脑梗死面积显著增加(P 0.05)。与模型组相比,高剂量组、中剂量组、低剂量组中脑梗死面积显著减小,且呈一定的剂量依赖性(P 0.05)。与假手术组相比,模型组中LC3-Ⅰ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)的比值与Beclin-1蛋白表达水平显著增高(P 0.05)。与模型组相比,高剂量组、中剂量组、低剂量组中LC3-Ⅰ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)的比值与Beclin-1蛋白表达水平显著降低,且呈剂量依赖性(P 0.05)。与假手术组相比,模型组中pAkt、p-mTOR、p-S6蛋白表达水平均显著降低(P 0.05)。与模型组相比,高剂量组、中剂量组、低剂量组中pAkt、p-mTOR、p-S6蛋白表达水平均显著增加,且呈剂量依赖性(P 0.05)。结论丹参酮ⅡA对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤大脑皮质神经元自噬具有显著的抑制作用,推测其机制可能为通过激活Akt-mTOR信号转导通路实现的。     

电针、艾灸预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响

目的:观察针灸预处理对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响,探讨针灸预处理在MIRI过程中对自噬调控的作用机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、缺血预适应(IP)组、电针组和艾灸组,每组8只。冠状动脉结扎法建立大鼠MIRI模型。电针组及艾灸组造模前分别电针或艾灸"内关"穴,每次20min,每日1次,连续7d。HE染色法及透射电镜检测左心室心肌病理形态学的变化,TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况及凋亡指数,Western blot法检测LC 3、Beclin 1蛋白在心肌细胞中的表达。结果:模型组心肌损伤较严重,心肌细胞排列紊乱、边界模糊,炎性细胞浸润,部分横纹坏死、溶解,线粒体结构紊乱、模糊,空泡化严重,并出现大量双层膜结构的自噬小体;IP组、电针组及艾灸组心肌损伤较模型组轻微,肌纤维大多正常,肌丝间局灶性水肿,线粒体丰富伴空泡增多,偶见自噬体。与假手术组比较,模型组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ均明显升高(P0.01),LC 3Ⅰ蛋白表达显著下降(P0.01);与模型组比较,IP组、电针组及艾灸组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ均明显降低(P0.01),LC 3Ⅰ蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01);电针组凋亡指数、LC 3Ⅱ及Beclin 1蛋白表达水平、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ明显低于IP组及艾灸组(P0.05),而LC 3Ⅰ蛋白表达水平则显著高于IP组及艾灸组(P0.01)。结论:IP、电针或艾灸"内关"穴预处理对MIRI大鼠均具有保护作用,可对MIRI大鼠心肌的自噬产生调节作用,尤以电针最佳,而这种适度调节MIRI过程中的自噬水平可能与下调LC 3Ⅱ、Beclin 1蛋白的表达有关。     

脾气虚大鼠海马神经元线粒体自噬的初步研究

目的:通过观测大鼠海马神经元线粒体自噬现象和标志物表达,探讨脾气虚的发生机制。方法:16只雄性SD大鼠随机分为正常组和脾气虚模型组(模型组),每组8只;透射电镜观察海马神经元线粒体形态;提取海马神经元线粒体,JC-1法检测膜电位(△Ψm),ELISA法检测ATP水平,Western blot法检测不协调51样自噬激活激酶1(uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)、微管相关蛋白轻链3(light chain 3,LC3)-I和II及突触融合蛋白17(syntaxin17,STX17)表达。结果:与正常组比较,模型组线粒体数量减少,且自噬结构减少;模型组△Ψm和ATP水平明显下降,ULK1、LC3-I和STX17表达均显著减少,但LC3-II表达变化不明显。结论:海马线粒体自噬减退与脾气虚发生有关。     

糖痛方对糖尿病神经病变大鼠坐骨神经自噬相关蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ表达的影响

目的观察糖痛方对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠坐骨神经自噬相关蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ表达的影响,初步探讨其作用机制。方法雄性SD大鼠75只,随机选取15只为正常组,其余60只采用2%链脲佐菌素诱导制作糖尿病大鼠模型,造模成功4周后,结合缺血再灌注制备DPN模型,成模大鼠随机分为模型组和糖痛方低、中、高剂量组,每组15只,糖痛方低、中、高剂量组分别按成人6.25、12.5、25倍剂量给药,正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃,每日1次,灌胃8周,Western blot和实时荧光定量PCR分别检测大鼠Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白和m RNA的表达,透射电镜观察坐骨神经超微结构。结果与正常组比较,模型组大鼠Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白和m RNA表达均升高,髓鞘肿胀、变性,板层分离;与模型组比较,糖痛方各剂量组大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白和m RNA表达呈下降趋势,以糖痛方中、高剂量组降低明显,髓鞘变性程度减轻。结论糖痛方可能通过抑制模型大鼠过度自噬,发挥对DPN大鼠的治疗作用。     

葛根素对脑缺血再灌注大鼠海马组织中Bcl-2、Beclin1及LC3蛋白表达的影响

目的观察葛根素对脑缺血再灌注大鼠海马组织中Bcl-2、Beclin1及LC3表达的影响。方法 28只雄性SD(250~300g)大鼠随机分为假手术组、模型组、葛根素低剂量(50mg/kg)组和葛根素高剂量(100mg/kg)组。连续给药7 d,末次给药1 h后,建立大脑中动脉闭塞模型,缺血90 min后,再灌注24 h,评估神经功能,采用TTC染色观察脑梗死面积,Western Blotting法检测缺血侧海马组织中Bcl-2、Beclin1及LC3蛋白表达的变化。结果与假手术组比较,模型组的大鼠神经功能损伤显著增强,脑梗死面积增加,Bcl-2蛋白表达显著下调,Beclin1蛋白表达显著上调,LC3-II/LC3-I的比值显著上升;与模型组比较,葛根素低、高剂量组随着剂量的增加,大鼠的神经功能损伤逐渐改善,脑梗死面积逐渐减小,Bcl-2的表达逐渐上调,Beclin1的表达逐渐下调,LC3-II/LC3-I的比值逐渐下降,呈剂量依赖性。结论葛根素可通过调控脑缺血/再灌注后凋亡基因Bcl-2的表达,下调自噬相关蛋白Beclin1及LC3蛋白表达,抑制过度自噬,继而达到保护缺血性中风损伤的目的。     

血管软化丸调控PI3K/Akt/mTOR通路影响细胞自噬及抗动脉粥样硬化的作用机制研究

目的通过观察血管软化丸对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的调控,研究血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制。方法动物实验,观察各组小鼠主动脉横截面病理损伤程度,观察血管软化丸对小鼠主动脉组织Akt、mTOR mRNA和蛋白质表达。体外实验,观察血管软化丸含药血清、Akt抑制剂康士得、mTOR抑制剂雷帕霉素及mTOR-siRNA对小鼠RAW264.7巨噬细胞的影响,观察巨噬细胞自噬体的变化,观察含药血清对巨噬细胞微管相关蛋白LC3-II表达的影响,观察含药血清对巨噬细胞Akt、mTOR、微管相关蛋白LC3-II及自噬相关蛋白Beclin 1的表达的影响,观察含药血清对巨噬细胞分泌炎症因子水平的影响。结果动物实验显示:血管软化丸组动脉粥样硬化病变程度明显较轻。与对照组比较,血管软化丸组小鼠主动脉组织Akt和mTOR表达水平明显较低(均P<0.05)。体外实验发现,与对照组相比,血管软化丸含药血清组和各抑制剂组透射电镜下观察到自噬体数量明显较大(均P<0.05),巨噬细胞微管相关蛋白LC3-II和Beclin1表达明显升高(均P<0.05),而Akt及mTOR的mRNA及蛋白表达水平明显较低(均P<0.05),巨噬细胞分泌的炎症因子IL-10水平明显高低(P<0.05),而炎症因子IFN-γ水平明显较高(P<0.05)。结论血管软化丸通过抑制炎症反应治疗动脉粥样硬化的分子机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,调节巨噬细胞自噬,减少斑块巨噬细胞浸润有关。     

基于自噬探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜保护的作用机制

目的 通过观察健脾益肠散对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠自噬相关分子表达的影响,探讨其肠黏膜保护 的作用机制。方法 将 SD 大鼠随机分为正常组、模型组、健脾益肠散组和柳氮磺吡啶组。采用 2, 4, 6-三硝基 苯磺酸 （TNBS） -乙醇溶液复合法建立溃疡性结肠炎大鼠模型;模型复制成功后灌胃给药,每日 1 次,持续 14 d。 观察大鼠一般状况,计算疾病活动指数 （DAI） 评分;苏木素-伊红 （HE） 染色法观察结肠组织病理形态;透射电 镜观察结肠上皮细胞自噬情况;免疫荧光染色法、蛋白免疫印迹法 （Western Blot） 检测结肠组织肌球蛋白样 BCL2 结合蛋白 （Beclin1） 、微管相关蛋白 1 轻链 3 （LC3） 蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应 （Real-time PCR） 检测自噬蛋白 5 （Atg5） 、自噬蛋白 7 （Atg7） 、泛素结合蛋白 62 （p62） mRNA 表达。结果 与正常组比较, 模型组一般情况较差,DAI 评分明显升高 （P＜0.000 1） ;结肠组织出现明显的上皮细胞损伤,电镜下自噬体的 数量明显减少;结肠组织 Beclin1、LC3-II/LC3-I 蛋白及 Atg5、Atg7 mRNA 表达明显降低 （P＜0.000 1） ,p62 mRNA 表达明显升高 （P＜0.000 1） 。与模型组比较,健脾益肠散组大鼠一般情况明显恢复,DAI 评分明显降低 （P＜0.000 1） ;结肠组织病理损伤有不同程度的改善,电镜下自噬体的数量明显增多;结肠组织 Beclin1、LC3-II/ LC3-I 蛋白及 Atg5、Atg7 mRNA 表达明显升高 （P＜0.01,P＜0.001,P＜0.000 1） ,p62 mRNA 表达明显降低 （P＜0.01） 。结论 健脾益肠散可通过上调自噬相关分子 Beclin1、LC3、Atg5 及 Atg7 的表达,下调 p62 的表 达,增强自噬以达到保护溃疡性结肠炎模型大鼠结肠黏膜损伤的作用。     

犀角地黄汤通过线粒体途径抑制免疫性骨髓衰竭血小板凋亡的实验研究

目的:探讨犀角地黄汤对免疫性骨髓衰竭小鼠模型线粒体途径血小板凋亡的调控作用。方法:将60只C57BL/6小鼠随机分为6组,每组10只,分别为正常对照组、模型对照组、环孢素(CSA)对照组和犀角地黄汤低、中、高剂量组。除正常对照组以外,其余各组小鼠建立免疫性骨髓衰竭模型。造模当天开始,正常对照组和模型对照组予生理盐水灌胃,CSA对照组予CSA灌胃,犀角地黄汤各剂量组分别予犀角地黄汤低、中、高剂量灌胃。治疗后各组小鼠用自动血细胞分析仪检测血常规,采用流式细胞仪测定线粒体膜电位(ΔΨm)、细胞色素C(Cyt C)、磷脂酰丝氨酸(PS)、钙离子(Ca2+),采用蛋白印迹(Western blot)法检测Bax、Bak、半胱天冬酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9的表达,透射电镜下观察骨髓巨核细胞、血小板超微结构的变化。结果:与模型对照组比较,CSA对照组、犀角地黄汤各剂量组小鼠血小板计数明显升高(P0.01),CSA对照组、犀角地黄汤各剂量组ΔΨm、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9明显升高(P0.01),CSA对照组、犀角地黄汤各剂量组Cyt C、PS、Ca2+、Bax、Bak明显下降(P0.05,P0.01)。电镜下CSA对照组、犀角地黄汤各剂量组巨核细胞、血小板结构损伤均较模型对照组有所减轻。结论:犀角地黄汤治疗急性骨髓衰竭血小板减少的机制可能通过线粒体途径抑制血小板凋亡,且治疗效果与剂量有一定相关性。     

血管软化丸治疗脑梗死对血栓相关因子和自噬的影响

目的:观察血管软化丸治疗脑梗死对血栓相关因子和自噬的影响。方法:80例随机分为观察组和对照组各40例。两组均用常规疗法,观察组加用血管软化丸治疗。治疗4周后观察治疗前后血浆HCY、VWF和GMP-140等血栓相关因子水平,检测血清中微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)和自噬相关蛋白Beclin1表达量。结果:观察组Hcy、VWF和GMP-140血栓相关因子水平与治疗前降低(P0. 05)、并低于对照组(P0. 05)。观察组LC3-Ⅱ、Beclin1表达量与治疗前及对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。观察组NIHSS积分和BI积分较治疗前明显改善,且改善程度大于对照组(P0.05)。结论:血管软化丸能够降低血栓相关因子水平,改善自噬相关指标。     

电针、艾灸预处理对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡和自噬的影响

目的:观察针灸预处理对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡指数和自噬相关蛋白LC3表达的影响,探讨针灸预处理对心肌缺血大鼠心肌细胞自噬能力的预保护作用。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、缺血预适应(IP)组、电针组、艾灸组,每组8只。电针组及艾灸组造模前分别电针或艾灸"内关"穴,每天1次,每次20min,连续7d。采用冠状动脉结扎术复制心肌缺血模型。电镜观察左心室缺血区组织病理形态学及心肌细胞自噬体的变化,TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况及凋亡指数,Western blot法检测LC3蛋白在心肌组织中的表达情况。结果:假手术组心肌细胞形态完整,排列整齐,线粒体较完整,可见少量自噬空泡;与假手术组相比,模型组心肌细胞形态不完整,排列紊乱,肌纤维溶解,线粒体肿大,胞核边聚化,自噬空泡较多;与模型组相比,IP组、电针组、艾灸组心肌细胞损伤较轻,少量肌纤维溶解,线粒体丰富,自噬空泡及溶酶体数量增多。与假手术组比较,模型组凋亡指数升高(P0.05);与模型组相比,IP组、电针组、艾灸组凋亡指数均降低(P0.05);与IP组、艾灸组比较,电针组凋亡指数降低(P0.05)。与假手术组比较,模型组心肌组织LC3-Ⅱ表达水平、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均升高(P0.05);与模型组比较,IP组、电针组及艾灸组心肌组织LC3-Ⅱ表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均降低(P0.05);与IP组、艾灸组比较,电针组LC3-Ⅱ的表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值上调(P0.05)。结论:针灸预处理能产生与缺血预适应相似的心脏保护作用,适度提高细胞自噬能力,减少细胞凋亡。     

葛根素调节AMPK-mTOR信号通路抑制自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤研究

目的探讨葛根素通过腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)-Unc-51样激酶1(Ulk1)通路抑制自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。方法 40只雄性SD大鼠随机分为4组,即假手术组、模型组及葛根素低、高剂量(50、100 mg/kg)组。各组大鼠连续给药7 d,末次给药30min后,采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺血1.5 h再灌注24 h后,进行神经功能评分,TTC染色观察脑梗死体积,电镜观察自噬小体的形成,Western blotting法检测海马组织中微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62、AMPK、p-AMPK、m TOR、p-mTOR、Ulk1、p S757-Ulk1蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分显著增加,脑梗死体积明显增大,自噬小体增多,LC3-II/LC3-I显著增加,p62蛋白表达水平显著降低,p-AMPK表达水平显著升高,p-m TOR和p S757-Ulk1蛋白表达水平显著降低。与模型组比较,葛根素各组大鼠的神经功能损伤明显改善,脑梗死体积减小,自噬小体减少,LC3-II/LC3-I显著降低,p62蛋白表达水平显著升高,p-AMPK蛋白表达水平显著降低,p-m TOR和p S757-Ulk1蛋白表达水平显著升高。结论葛根素可能通过调控AMPK-m TOR-Ulk1信号通路抑制自噬的过度发生,从而减轻脑缺血再灌注损伤的发生。     

稳斑汤含药血清对巨噬细胞泡沫化自噬相关蛋白LC3B和Beclin 1表达的影响

目的探讨稳斑汤防治动脉粥样硬化的可能作用机制。方法 20只SD大鼠随机分为空白组及稳斑汤低、中、高浓度组各5只。稳斑汤低、中、高浓度组分别给予稳斑汤4.275、8.55、17.1 g/(kg·d)灌胃,空白组给予4 ml蒸馏水灌胃,每天1次,连续灌胃7天。灌胃第8天腹主动脉取血,离心后分离血清。体外培养小鼠巨噬细胞,分为空白对照组、模型组、雷帕霉素组及稳斑汤低、中、高浓度组,每组6孔。除空白对照组外其余各组均进行巨噬细胞泡沫化。空白对照组及模型组予10%大鼠空白血清培养;雷帕霉素组用雷帕霉素10μl/孔(终浓度10 nmol/L)培养;稳斑汤低、中、高浓度组分别用10%稳斑汤低、中、高浓度含药血清200μl/孔培养。48h后收集细胞,在透射电镜下观察各组细胞自噬体的变化,Western Blot法检测各组细胞LC3B和Beclin 1蛋白表达水平。结果透射电镜下观察到,空白对照组无明显自噬体出现,模型组可见少量自噬体出现;与模型组比较,稳斑汤各浓度组与雷帕霉素组的自噬体数量均明显增加,雷帕霉素组数量更多。与空白对照组比较,其余各组LC3B和Beclin 1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,稳斑汤各浓度组及雷帕霉素组LC3B和Beclin 1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤高浓度组LC3B和Beclin 1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论稳斑汤含药血清能够上调巨噬细胞泡沫化自噬相关蛋白LC3B和Beclin 1表达,促进泡沫化的巨噬细胞的自噬,从而抑制巨噬细胞泡沫化的进展,这可能是稳斑汤防治动脉粥样硬化的分子机制之一。     

补阳还五汤抗ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化作用与调控巨噬细胞自噬的机制研究

目的:探究补阳还五汤对高脂饮食造成ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响,及其与斑块内巨噬细胞自噬及表型变化的关系。方法:8周龄60只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、补阳还五汤组5、10、20g/kg组、自噬诱导剂雷帕霉素4 mg/kg组,以C57/BL-6J小鼠作为正常组。模型组和治疗组均采用高脂饲养,造模同时,治疗组分别给予补阳还五汤和雷帕霉素。动物取血后用于血清生化指标高敏C反应蛋白(hs-CPR)、白介素1L-1、1L-6的测定;制备血管组织标本;电镜观察巨噬细胞自噬体形成情况;Western Blot测定自噬相关通路蛋白的水平。结果:ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养16周可成功诱导AS斑块模型。与正常组相比,模型组动脉粥样硬化斑块面积明显增加,血清hs-CRP、白介素IL-1β和IL-6含量均显著升高,小鼠动脉硬化斑块内巨噬细胞自噬体减少,微管轻链蛋白3(LC3-II/I)比值含量明显降低。与模型组相比,补阳还五汤及雷帕霉素组对比模型组斑块面积明显减少,血清hs-CRP、白介素IL-1β和IL-6含量显著降低,自噬体形成显著增多,显著升高LC3-II/I比值含量。与正常组比较,模型组血管组织中P-I3K、P-62、P-mTOR表达量明显升高,P-Beclin1、ULK表达量明显降低;与模型组相比,补阳还五汤各剂量组及其雷帕霉素可以显著抑制PI3K、P-62、P-mTOR的蛋白表达,升高P-Beclin1、ULK的表达。结论:补阳还五汤可以通过减少炎症因子的释放,调控斑块内巨噬细胞自噬水平,从而明显地降低动脉硬化斑块的斑块面积,达到抗动脉粥样硬化作用。     

基于活性氧簇-自噬通路调控的加味黄芪赤风汤对肾小球足细胞的保护机制研究

目的观察加味黄芪赤风汤基于活性氧簇(ROS)-自噬通路对AngⅡ诱导肾小球足细胞损伤的保护机制。方法制备低、中、高剂量加味黄芪赤风汤(分别应用生药浓度为0.57、1.15、2.29 g/mL的加味黄芪赤风汤灌胃小鼠)含药血清及替米沙坦(0.83 mg/mL灌胃小鼠)含药血清,采用AngⅡ(1×10~(-7)mol/L)诱导足细胞损伤模型,分为空白组,模型组,加味黄芪赤风汤低、中、高剂量组以及替米沙坦组;为验证自噬与模型的关系,设置3MA与氯喹组。采用Western Blot检测足细胞损伤相关蛋白nephrin、podocin及自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达,溶酶体荧光探针检测自噬流活性,透射电镜观察足细胞内自噬体的形成,流式细胞仪检测细胞内ROS平均荧光强度(MFI)。结果与空白组比较,模型组足细胞nephrin、podocin、P62表达下调(P0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达上调(P0.01),ROS的MFI增强(P0.01)。透射电镜及溶酶体荧光探针结果显示模型组自噬体数量增多,溶酶体表达增强。与模型组比较,加味黄芪赤风汤中、高剂量组及替米沙坦组nephrin、podocin、P62表达上调(P0.01,P0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达下调(P0.01,P0.05);3MA及氯喹组足细胞nephrin、podocin表达下调(P0.01,P0.05);加味黄芪赤风汤低剂量组Beclin-1表达下调(P0.05);各给药组ROS MFI减弱(P0.01,P0.05)。透射电镜及溶酶体荧光探针结果显示加味黄芪赤风汤组及替米沙坦组自噬体数量减少,溶酶体表达减弱。结论 AngⅡ通过下调nephrin、podocin表达损伤足细胞;加味黄芪赤风汤可上调AngⅡ诱导的nephrin、podocin表达,缓解足细胞损伤;加味黄芪赤风汤可能基于ROS-自噬通路,下调AngⅡ诱导的自噬流,拮抗肾小球足细胞损伤。     

电针颈夹脊穴对神经根型颈椎病大鼠局部脊髓组织自噬相关因子LC3和Beclin-1的影响

目的:观察神经根型颈椎病(CSR)模型大鼠脊髓及神经根组织神经细胞自噬小体的变化及LC3、Beclin-1蛋白表达情况,探讨电针颈夹脊穴对CSR大鼠的镇痛作用机制。方法:将30只SPF级SD大鼠,随机分为模型组、针刺组及电针组,每组10只。采用颈椎插线法构建CSR模型大鼠,并于造模后第3天进行干预,模型组予每日抓取1次,针刺组取双侧颈2-3(C2-3)、颈6-7(C6-7)节段颈夹脊穴进行普通针刺,电针组在此基础上以一侧穴位为一组进行电针干预,1次/d,20 min/次,连续干预7 d后处死。治疗后检测各组大鼠外周神经机械性痛阈,取压线处脊髓及神经根组织,通过透射电镜观察其神经细胞自噬小体的变化,并采用免疫组化法检测LC3、Beclin-1蛋白的表达水平。结果:与模型组比较,针刺组及电针组外周神经机械性痛阈、LC3、Beclin-1蛋白表达明显升高(P 0. 05),自噬小体数量明显增加;与针刺组对比,电针组外周神经机械性痛阈、LC3、Beclin-1蛋白表达升高(P 0. 05),自噬小体数量增多。结论:电针颈夹脊穴对CSR大鼠具有明显的镇痛作用,通过调节神经细胞自噬可能是实现其镇痛作用的重要机制之一。     

银杏内酯B对阿尔茨海默病大鼠海马Synapsin-1、Beclin1和LC3表达的影响

目的:探讨银杏内酯B(ginkgolide B,GB)对阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,AD)大鼠海马Synapsin-1、Beclin1和LC3的影响。方法:将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、银杏内酯B低剂量组、中剂量组和高剂量组,采用Morris水迷宫检测学习记忆,透射电镜观察自噬,免疫组织化学分析海马Synapsin-1、Beclin1和LC3阳性神经元光密度值,荧光定量PCR检测海马Synapsin-1、Beclin1和LC3-Ⅱ的mRNA水平。结果:中、高剂量银杏内酯B可缩短AD大鼠逃避潜伏期,增加穿越平台次数,减少自噬体,提高海马组织Synapsin-1,降低Beclin1 mRNA和蛋白表达,同时下调LC3-ⅡmRNA水平。结论:银杏内酯B可改善AD大鼠学习记忆能力,可能与海马突触相关蛋白Synapsin-1上调、自噬相关基因Beclin1和LC3水平下降有关。     

针刺百会穴对阿尔茨海默病模型大鼠自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的影响

目的:观察针刺百会穴对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马区自噬相关蛋白1(Beclin1)和微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)的影响,探讨针刺治疗AD的可能作用机制。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、针刺组,每组10只,空白组常规喂养,不给予任何干预,假手术组在双侧脑室注射人工脑脊液,模型组、针刺组以链脲佐菌素(STZ)双侧脑室注射诱导阿尔茨海默病模型,并确认造模成功。针刺组选取百会穴进行针刺治疗,造模成功后第2天针刺,连续干预28 d。28 d后利用水迷宫检测大鼠学习记忆能力,免疫印迹法(WB)观察脑组织内自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达。结果:假手术组逃避潜伏期以及跨越平台次数与空白组比较,差异无统计学意义(P0.05);与空白组比较,模型组逃避潜伏期延长、跨越平台次数减少,差异有统计学意义(P0.01),大鼠出现明显的学习记忆障碍;与模型组比较,针刺组逃避潜伏期明显降低、跨越平台次数增加(P0.05)。假手术组Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达与空白组比较,差异均无统计学意义(P0.05);模型组海马组织中Beclin-11、LC3-Ⅱ蛋白表达均低于空白组(P0.05);针刺组Beclin-11、LC3-Ⅱ蛋白表达高于模型组(P0.01)。结论:针刺百会穴可提高阿尔茨海默病大鼠海马区Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达,改善大鼠学习记忆能力;针刺百会穴治疗AD的机制之一可能是调控自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达。     

电针对鱼藤酮诱导的帕金森病模型大鼠黑质内自噬相关蛋白表达的影响

目的:探讨自噬—溶酶体途径在针刺防治帕金森病(Parkinson's disease,PD)中的作用。方法:雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针预处理组、电针治疗7 d组、电针治疗14 d组、电针治疗21 d组、电针治疗28 d组,每组15只。采取颈背部皮下注射鱼藤酮法制备PD模型。电针治疗组取穴"太冲""风府",每次治疗20 min,每天1次,疗程分别为7 d、14 d、21 d、28 d。电针预处理组电针治疗7 d后再造模。观察各组大鼠行为学改变并进行评分。造模后除去死亡与体质量过轻过重及外观、行为学未达标的老鼠,每组均为10只。运用Western blot检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)、微管相关膜蛋白轻链3(LC3-II)、自噬底物蛋白P62和α-突触核蛋白(α-syn)的表达。结果:模型组大鼠出现了毛发变黄变粗、弓背明显、运动缓慢迟钝、拒捕减少等异常行为学表现,而治疗组和预处理组以上表现程度明显减轻。与正常组和假手术组对比,模型组LC3-II、P62、α-syn的表达均明显增加(P0.01),TH表达明显下降(P0.01)。与模型组对比,电针治疗组和预处理组LC3-II的表达水平增加明显(P0.01);TH表达增强(P0.01或P0.05),P62、α-syn蛋白表达均明显下降(P0.01)。结论:电针防治帕金森病的机制可能与针刺能够改善自噬功能障碍,促进PD模型大鼠体内具有细胞毒性作用α-syn的降解有关。