PML-RARα多肽和NB4细胞体外诱导CTL细胞杀伤活性分析

目的了解PML-RARα多肽和NB4细胞体外诱导体外诱导增殖的T细胞的特异性细胞毒作用.方法采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养(MLTC)方法,经丝裂霉素C处理的NB4细胞或PML-RARα 多肽(LSSCITQGKAIETQSSSSEE)作为刺激原体外诱导脐血单个核细胞增殖.利用LDH方法检测诱导后T细胞的细胞毒性.结果 PML-RARα多肽诱导组第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:49.65±6.7%(p<0.01)和73.13±8.42%(p<0.01),NB4细胞诱导组第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:53.33±8.82%(p<0.01)和74.46±9.57%(p<0.01),而无诱导组的第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:15.93±9.25%和38.19±10.54%,前两组T细胞对NB4细胞的杀伤作用均明显高于对照组.结论 PML-RARα多肽和NB4细胞体外可诱导出特异性T细胞,他们对表达PML-RARα的NB4细胞具有选择性杀伤作用.     

PML-RARα多肽和NB4细胞体外诱导CTL细胞杀伤活性分析

目的了解PML-RARα多肽和NB4细胞体外诱导体外诱导增殖的T细胞的特异性细胞毒作用.方法采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养(MLTC)方法,经丝裂霉素C处理的NB4细胞或PML-RARα多肽(LSSCITQGKAI-ETQSSSSEE)作为刺激原体外诱导脐血单个核细胞增殖.利用LDH方法检测诱导后T细胞的细胞毒性.结果PML-RARα多肽诱导组第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:49.65±6.7%(p<0.01)和73.13±8.42%(p<0.01),NB4细胞诱导组第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:53.33±8.82%(p<0.01)和74.46±9.57%(p<0.01),而无诱导组的第10d和第15d T细胞对NB4细胞的杀伤活性为:15.93±9.25%和38.19±10.54%,前两组T细胞对NB4细胞的杀伤作用均明显高于对照组.结论PML-RARα多肽和NB4细胞体外可诱导出特异性T细胞,他们对表达PML-RARα的NB4细胞具有选择性杀伤作用.     

NLS-RARα通过激活AKT调节白血病NB4细胞的增殖

目的构建携带NLS-RARα的重组慢病毒,感染白血病NB4细胞并观察其对NB4细胞增殖和AKT蛋白的影响。方法以质粒p CMV-HA-NLS-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,将其亚克隆到慢病毒表达载体质粒LV5中,经DNA测序鉴定重组载体,用4质粒系统共转染293T细胞,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组慢病毒的滴度;重组慢病毒感染NB4细胞,经过嘌呤霉素筛选获得稳定转染NLS-RARα的NB4细胞株;CCK-8法检测NLSRARα对NB4细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期和感染效率;Western blot分别检测NLS-RARα、t-AKT和p-AKT的表达。结果 NLS-RARα克隆入LV5的多克隆位点,慢病毒浓缩后滴度为2×108Tu/m L;感染效率为86.54%;NLS-RARα能够明显促进细胞增殖,S期细胞增多,G1和G2期细胞减少;NLS-RARα基因在NB4细胞中稳定的表达,同时p-AKT明显增高,用PI3K抑制剂LY294002处理后p-AKT明显降低。结论 NLS-RARα通过激活AKT促进白血病NB4细胞的增殖。     

PML-RARα融合基因及其诱导特异性免疫应答

PML-RARα融合基因通过其转录抑制作用而诱发APL已基本得到认可,但其引发APL的机制是错综复杂的,在PML-RARα融合基因的致病过程中,必须有其他因素的共同参与才能导致APL.同时PML-RARα融合蛋白上存在着抗原性,PML-RARα多肽可诱导特异性免疫应答,为免疫治疗的研究提供了可能性.     

siRNA干扰沉默HOXA9基因对急性白血病K562细胞凋亡的影响

白血病是一种发生于造血组织的恶性疾病,其特点是某一类型白血病细胞在骨髓组织或其他造血组织中呈肿瘤性增生.白血病发病率占儿童恶性肿瘤的第一位.在我国白血病的患者30％是儿童.急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)约占儿童急性白血病的20％,过去20年,5年生存率已上升至60％[1].     

PML-RARα融合基因及其诱导特异性免疫应答

PML-RARα融合基因通过其转录抑制作用而诱发APL已基本得到认可，但其引发APL的机制是错综复杂的，在PML-RARα融合基因的致病过程中，必须有其他因素的共同参与才能导致APL，同时PML-RARα融合蛋白上存在着抗原性，PML-RARα多肤可诱导特异性免疫应答，为免疫治疗的研究提供了可能性。     

siRNA干扰Oct4基因对P19细胞中miR-302启动子活性的影响

目的检测siRNA干扰Oct4基因对P19细胞中miR-302启动子活性的影响,探讨维持胚胎癌(EC)细胞及胚胎干细胞(ES)全能性的调控机制。方法采用Western blotting检测Oct4 siRNA对Oct4蛋白的干扰效果;采用双荧光素酶报告基因分析系统检测siRNA干扰Oct4基因对P19细胞中miR-302基因启动子活性的影响。结果对于Oct4蛋白的最适干扰量为2.0μg siRNA1和2.0μg siRNA2;向P19细胞中转染Oct4 siRNA可以降低miR-302启动子的荧光素酶活性。结论 Oct4对miR-302的启动子具有正向调控作用。     

过表达prohibitin促进NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡

目的构建人prohibitin基因真核过表达载体,探讨上调prohibitin对NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡的影响。方法 PCR钓取目的基因prohibitin,与pEGFP-N1-3FLAG真核载体定向连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将阳性重组载体pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin转染NB4-R1细胞,以实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测过表达效果,annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测prohibitin过表达对NB4-R1细胞凋亡的影响。结果 PCR筛选及测序比对,证明成功构建了prohibitin基因过表达载体;对NB4-R1细胞转染率可达70%以上;qRT-PCR结果显示转染pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin过表达载体组(OE)prohibitin mRNA表达水平较空白对照组(CON)和阴性对照组(NC)分别上调(1.64±0.37)倍和(1.58±0.43)倍(P0.05),Western blot结果显示OE组prohibitin蛋白表达水平较CON组和NC组分别上调(1.91±0.33)倍和(1.99±0.37)倍(P0.05);流式细胞术结果表明CON组、NC组和OE组NB4-R1细胞凋亡率分别为(5.88±0.43)%、(6.63±0.46)%和(28.22±1.33)%,OE组较CON组和NC组细胞凋亡率分别增加了(3.80±0.24)倍和(3.39±0.30)倍(P0.05)。结论过表达prohibitin可诱导NB4-R1细胞凋亡。     

急性早幼粒细胞白血病TNF-α基因多态性和蛋白表达水平的相关研究

目的 探讨北方地区汉族人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因型别的多态性和TNF-α蛋白表达与急性早幼粒细胞白血病(APL)的相关性.方法 对21例APL患者采用酶联免疫分析法(ELISA)测定TNF-α含量,应用顺序特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法检测TNF-α基因型别的多态性变化,并与31名健康献血者对照.结果 APL组血中TNF-α蛋白含量(1.810±0.116)显著高于对照组(1.107±0.095),P＜0.05;APL组和正常对照组TNF-α(308A)等位基因频率分别是(9.524%)和(9.68%)组间差异无统计学意义(P＞0.05),提示该等位基因频率与APL不相关,血中TNF-α蛋白表达增高与APL相关.结论 中国北方地区汉族人TNF-α基因308位点基因多态性与APL的易感性、临床以及预后可能不起重要作用;而TNF-α蛋白表达与APL的易感性相关联.     

48例急性早幼粒细胞白血病的细胞遗传学研究

目的　探讨不同病期急性早幼粒细胞白血病 (APL)的细胞遗传学特点及意义。方法　随机选取 4 8例APL患者 ,采集新鲜骨髓 ,采用 2 4h预加秋水仙素的短期培养法制备染色体 ,应用G显带技术进行核型分析并照相。结果　本研究4 8例患者 (未缓解期 16例 ,复发期 3例 ,完全缓解期 2 9例 )中 ,具有染色体异常的有 2 8例 ,其中未缓解期 16例 (16 /16 ) ,复发期 3例 (3/3) ,完全缓解期 9例 (9/2 9)。异常类型以染色体易位和片段缺失比例较高 ,其中具有典型t(15 ;17)易位者 7例 ,为未缓解期或复发期患者 ;易位涉及 8q2 2者 5例。其中 ,同时具有t(15 ;17) ,t(8;2 1)易位 1例 ;同时具有t(5 ;8) ,t(15 ;17)易位 1例 ;t(5 ;8)易位 1例 ;t(8;17)易位 1例 ;以t(8;2 1)为基础的复杂易位 1例。具有 17q2 1-者 6例。结论　对白血病进行细胞遗传学研究不但具有十分重要的诊断和预后价值 ,而且能发现与疾病发生有关的新基因及涉及白血病转化和增殖的分子损伤位点。     

三氧化二锑诱导急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡的研究

目的 研究锑剂三氧化二锑（Sb2O3)对早幼粒细胞白血病细胞株NB4凋亡的诱导作用，以寻求早幼粒细胞白血病治疗的新方法。方法 采用细胞生长曲线，形态学及硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验，判定NB4细胞的生长，分化及功能。采用细胞周期分析和DNA电泳研究细胞凋亡。结果 Sb2O3能诱导早幼粒白血病细胞凋亡，且具有时间，剂量依赖性。结论 Sb2O3能有效地诱导早幼粒白血病细胞凋亡，提示锑剂诱导细胞半亡的疗法，有望成为临床治疗早幼粒细胞白血病的新方法。     

急性早幼粒细胞白血病与MHC-A*基因的相关研究

目的探讨北方地区汉族人急性早幼粒细胞白血病（APL）与人类主要组织相容性复合体MHC～A＊基因多态性的关系。方法应用顺序特异性引物和聚合酶链反应（PCR—SSP）技术，对21例急性早幼粒细胞白血病患者及29例无血缘关系的健康人的MHC—A＊各等位基因及亚基因进行了检测分析。结果结果表明，MHC～A＊11（RR=5．333．P〈0．05=；和MHC—A＊24（RR=3．60，P〈0．05=基因与APL呈正相关，显著高于对照纽，两组之间比较差异有显著性意义，而其它MHC—A＊各等位基因未见异常，均无统计学差异。结论本项研究结果提示，MHC—A＊11和24基因可能是我国北方汉族人APL致病的易感基因，为揭示APL的发病机制中免疫遗传学作用提供了重要信息和依据。     

早幼粒细胞白血病基因的功能研究进展

为上幼粒白血病基因和维甲酸受体α（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α,ＰＭＬ－ＲＡＲα）的致病机理,对野生ＰＭＬ基因的生物学功能的研究进展进行综述。从近年来国内外公开发表的有关报道,结合本研究所的部分研究结果,提示ＰＭＬ的高表达有抑制细胞生长和诱导凋亡的作用;ＰＭＬ可能参与基因表达的调控;且ＰＭＬ功能的发挥与其３个重要功能区和核内定位有关     

三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病细胞分泌细胞因子的影响与意义

为了探讨细胞因子在三氧化二砷诱发APL细胞白细胞升高的作用 ,首先按照FAB细胞形态学和细胞遗传学标准选择APL患者。常规Ficoll密度梯度法分离骨髓和PBMC ,体外培养 1h去除贴壁细胞。体外IL 1β、IL 6、IL 8、TNF α和G CSF分泌水平采用ELISA方法进行测定 ,NBT还原实验用以检测APL细胞分化状态。直接细胞计数法和MTT法观察细胞增殖变化。研究结果证实体外 10 6M或体内以 10mg/d三氧化二砷治疗 96h后 ,APL细胞分泌IL 1β和G CSF平均水平升高 (P <0 0 5 ) ,IL 6和IL 8水平降低 (P <0 0 5 ) ,TNF α水平无明显变化 (P >0 0 5 )。进一步分析结果表明 ,体外APL细胞的增值比率与IL 1β或G CSF分泌升高比率呈现正相关 ,检测到IL 1β或G CSF患者的细胞数量增加比率高于未检测到IL 1β或G CSF组 ,说明IL 1β或G CSF分泌增加在三氧化二砷诱导后的APL细胞增殖中起着一定作用     

建立实时定量PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因转录本

目的 建立实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)法榆测急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)PML/RARa融合基因转录本,评价其在APL患者诊断和微小残留病(minimal residual disease,MRD)监测中的意义.方法 设计TaqMan探针和引物,建立RQ-PCR法对长型(L-form)、短型(S-form)、变异型(V-form)不同类型PML/RARa阳性模板进行扩增,并检测6例APL患者PML/RARa融合基因转录本含量.结果 RQ-PCR法最低可检测到10个拷贝/μL的阳性模板,但重复性较差,而108～102拷贝/μL阳模的重复性良好,止常对照无扩增信号.6例初诊APL患者不同类型PML/RARa融合基因转录本绝对含量为4.27×103～3.36×105拷贝/50 ng(中位4.33×104拷贝/50 ng),ABL纠正后的相对含量为29.38%～600.53%(中位48.12%).1例患者诱导缓解后PML/RAHa融合基因转录本下降,复发时义明显升高.结论 RQ-PCR方法敏感、可靠,可用于APL患者的诊断和MRD监测.     

靶向CⅡTA基因siRNA对大鼠角膜基质细胞MHCⅡ基因表达影响的研究

目的：探讨靶向主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类抗原转录激活因子（MHCⅡtransactivator CⅡTA）的化学合成小干扰RNA(small interfering RNA)抑制大鼠角膜基质细胞表面的MHCⅡ类抗原表达的可行性。 方法： 设计并合成靶向CⅡTA基因的5条siRNA，分离并培养大鼠角膜基质细胞，经重组大鼠IFN-γ刺激后，在阳离子脂质体的介导下，将siRNA转染大鼠角膜基质细胞。于转染后24 h收集细胞,用荧光定量PCR方法检测CⅡTA和MHCⅡ mRNA水平的变化;流式细胞仪检测MHCⅡ抗原表达的变化。 结果： 大鼠角膜基质细胞经重组大鼠IFN-γ刺激后，CⅡTA和MHCⅡ的表达大幅增强。荧光定量PCR检测显示化学合成的5条siRNA通过脂质体转染大鼠角膜基质细胞后,均能不同程度地抑制CⅡTA和MHCⅡ的表达，与对照组具有显著差异(P<0.01)。其中siRNA-4组的抑制作用最明显，对CⅡTA、MHCⅡ基因的mRNA抑制率分别为95.10%±1.25%、82.70%±1.95%。流式细胞仪检测显示siRNA-4组对MHCⅡ抗原分子表达抑制率为81.90%±1.23%。 结论： 在大鼠角膜基质细胞中，靶向CⅡTA siRNA抑制了自身mRNA表达,并阻止其调控的MHCⅡ类分子的相应表达。从而为进一步研究利用siRNA技术抑制MHCⅡ的表达防治角膜缘移植排斥反应提供了实验依据。     

急性早幼粒细胞白血病与MHC-DRB1*基因的相关研究

目的探讨北方地区汉族人急性早幼粒细胞白血病(APL)与人类主要组织相容性复合体MHC—DRB1*基因多态性的关系。方法应用顺序特异性引物和聚合酶链反应(PCR-SSP)技术,对21例急性早幼粒细胞白血病患者及32例无血缘关系的健康人的MHC—DRB1*各等位基因及亚基因进行了检测分析,并将该方法与其它检测MHC等位基因的方法进行对比。结果结果表明,MHC—DRB1*09(RR=1.59,P<0.05=;MHC—DRB1*14(RR=1.59,P<0.05=基因与APL呈正相关,显著高于对照组,两组之间比较差异有显著性意义,而其它MHC—DRB1*各等位基因未见异常,均无统计学差异。结论本项研究结果提示,MHC—DRB1*09和14基因可能是我国北方汉族人APL致病的易感基因,为揭示APL的发病机制中免疫遗传学作用提供了重要信息和依据。     

丹参酮Ⅱa对急性髓系白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的观察丹参酮Ⅱa对急性髓系白血病细胞增殖和凋亡的影响,并初步分析其作用机制.方法人急性髓系白血病细胞NB4分别用不同浓度的丹参酮Ⅱa处理,11.2μmol/L柔红霉素作为阳性对照,未给予药物作为阴性对照.观察NB4细胞增殖、细胞周期、凋亡及相关通路蛋白的变化.结果丹参酮Ⅱa可明显抑制NB4细胞增殖,诱导细胞周期发生G1期阻滞,促进其凋亡,具有浓度依赖性(P<0.05).丹参酮Ⅱa可剂量性下调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及m-TOR的表达(P<0.05).结论丹参酮Ⅱa可抑制NB4细胞增殖,诱导细胞周期发生G1期阻滞,促进其凋亡,可能与抑制PI3K/AKT/m-TOR信号通路有关.