微小RNA-199a-5p通过靶向SIRT1促进心肌纤维化相关基因表达

目的:研究微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)对心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达的调控作用及其可能作用的靶基因。方法:原代分离并体外培养成体C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞;双萤光素酶报告基因实验检测miR-199a-5p与潜在靶基因沉默信息调节因子1(SIRT1)3’端非翻译区(3’-UTR)的结合作用;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western blot法分别检测SIRT1以及纤维化标志物胶原蛋白(Col)1a1、Col3a1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表达。结果:在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠心肌成纤维细胞中,Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达增强,miR-199a-5p表达上调。在心肌成纤维细胞中过表达miR-199a-5p可以增强Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。双萤光素酶报告基因实验显示miR-199a-5p与SIRT1 3’-UTR有结合作用。RT-q PCR和Western blot结果证实miR-199a-5p可在转录水平抑制SIRT1表达。过表达miR-199a-5p和沉默SIRT1均能一致性促进心肌成纤维细胞中Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。抑制AngⅡ诱导的小鼠心肌成纤维细胞中NF-κB激活,可显著降低miR-199a-5p表达。结论:SIRT1是miR-199a-5p的作用靶基因,并介导miR-199a-5p促进纤维化标志物Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。     

沉默circ＿0006104上调miR-370-3p抑制小鼠心脏成纤维细胞增殖、活化和胶原合成

目的 探索环状RNA 0006104(circ＿0006104)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心脏成纤维细胞(CFs)的增殖,活化和细胞外基质(ECM)合成的作用和机制。方法 分离培养乳小鼠原代CFs,分为对照组、circ＿0006104敲低组、AngⅡ组、AngⅡ+circ＿0006104敲低组和AngⅡ+circ＿0006104敲低+miR-370-3p抑制组。EdU免疫荧光染色检测CFs的增殖水平;Western blot检测活化相关基因(α-SMA)的表达;RT-qPCR检测collagenⅠ和Ⅲ(ColⅠ和ColⅢ)的表达。结果 利用RNA-seq高通量测序结果,筛选得到circ＿0006104。沉默circ＿0006104对生理条件下CFs的增殖、活化和ECM合成没有显著影响;而沉默circ＿0006104可显著抑制AngⅡ诱导的CFs增殖,活化以及ECM合成水平(P<0.05)。此外,circ＿0006104可靶向结合并负向调控miR-370-3p;抑制miR-370-3p明显减轻circ＿0006104沉默对AngⅡ诱导的CFs增殖,活化和ECM合成的的阻碍作用...     

TXNIP通过诱导氧化应激促进心肌纤维化的发生（英文）

目的:探讨硫氧还蛋白-互作蛋白(TXNIP)在心肌纤维化发生过程中的表达变化及其潜在调节机制。方法:通过皮下泵入血管紧张素(Ang)II建立心肌纤维化小鼠模型,Western blot检测TXNIP在心肌纤维化小鼠和假手术组小鼠心肌组织中的表达差异。分离和培养新生大鼠的心肌成纤维细胞(CFs),外源性使用人重组Ang II和(或)losartan处理CFs,用Westernblot和细胞免疫荧光检测TXNIP表达的变化。构建TXNIP的小干扰RNA(si RNA),利用细胞划痕实验、结晶紫染色、Western blot以及细胞活性氧簇探针等多种方法检测TXNIP对Ang II刺激状态下CFs迁移、纤维激活相关蛋白[Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅲ)、波形蛋白(vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)]表达、氧化应激及MAPK信号通路的影响。结果:TXNIP在心肌纤维化小鼠的心肌组织中表达上调。Ang II可浓度和时间依赖性地促进CFs中TXNIP表达上调,这种效应可以被losartan完全抵消。敲减TXNIP可以显著抑制Ang II诱导的CFs迁移及Col Ⅰ、Col Ⅲ、vimentin和α-SMA表达升高。此外,敲减TXNIP可以抑制Ang II诱导的细胞氧化应激和MAPK信号通路激活。结论:TXNIP可能通过MAPK信号通路诱导CFs发生氧化应激,进而促进心肌纤维化的发生;TXNIP可能成为治疗心肌纤维化的新靶点。     

血管紧张素-(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化的影响

目的: 观察血管紧张素-(1-7) 对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化及细胞外基质分泌的影响并初步探讨其机制。方法: 体外培养正常大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F), 分为对照组和Ang-(1-7)组、AngⅡ组和Ang-(1-7)+AngⅡ组, 培养72 h后, 细胞免疫化学染色法检测细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)和胰岛素样生长因子I(IGF-I)表达; 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测上清液中TGF-β₁、IGF-I及细胞外基质成分Ⅰ型胶原(ColⅠ)的含量。结果: 对照组仅有基础水平的α-SMA表达, 几无Col I、TGF-β₁和IGF-I表达, Ang-(1-7)组与之类似; AngⅡ组细胞α-SMA及ColⅠ、TGF-β₁、IGF-I表达较对照组显著增加(P<0.05); AngⅡ+Ang-(1-7)组与AngⅡ组比较, 细胞α-SMA及Col I、TGF-β₁、IGF-I表达明显减少(P<0.05)。结论: Ang-(1-7)可抑制AngⅡ诱导的肾间质成纤维细胞活化, 减少细胞外基质成分ColⅠ的合成, 其机制可能是通过下调致纤维化细胞因子TGF-β₁和IGF-I的表达。     

巨噬细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α激活抑制巨噬细胞炎症反应诱导的心脏成纤维细胞活化及迁移

目的:研究巨噬细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)激活对巨噬细胞炎症反应诱导的心脏成纤维细胞活化及迁移的影响。方法:将小鼠骨髓来源巨噬细胞随机分为4组:对照组、PPARα激动剂WY14643(10μmol/L)组、血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ; 1μmol/L)组和Ang Ⅱ+WY14643组。培养24 h后收集上述各组巨噬细胞的培养上清作为条件培养基(CM),并利用RT-qPCR检测巨噬细胞PPARα及促炎因子白细胞介素6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF-α)的mRNA表达,Western blot检测IL-6和IL-1β的蛋白表达。用上述4组CM培养心脏成纤维细胞24 h,RT-qPCR检测心脏成纤维细胞纤维化标志物I型胶原α2链(Col1a2)、Ⅲ型胶原α1链(Col3a1)和肌动蛋白α2(Acta2)的mRNA表达,Western blot检测心脏成纤维细胞中collagen I、collagen ⅡI和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA;由Acta2基因编码)的蛋白水平。心脏成纤维细胞加入上述4组CM后用划痕实验观察迁移情况。结果:Ang Ⅱ显著增加巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达的同时明显降低PPARα的表达,而WY14643显著降低Ang Ⅱ诱导的巨噬细胞炎症因子的表达。AngⅡ也可显著增加巨噬细胞中IL-6和pro-IL-1β的蛋白表达,而WY14643明显降低Ang Ⅱ诱导的巨噬细胞IL-6和pro-IL-1β的蛋白表达。Ang Ⅱ处理后的CM显著促进心脏成纤维细胞迁移及Col1a2、Col3a1和Acta2的mRNA表达,而WY14643处理后的CM则抑制心脏成纤维细胞的迁移以及Col1a2、Col3a1和Acta2的mRNA表达。Ang Ⅱ处理后的CM也促进心脏成纤维细胞collagen I、collagen ⅡI及α-SMA的蛋白表达,而WY14643处理后的CM则抑制心脏成纤维细胞collagen I、collagen ⅡI及α-SMA的蛋白表达。结论:WY14643激活的PPARα通过减轻Ang Ⅱ诱导的巨噬细胞炎症反应而抑制心脏成纤维细胞的活化及迁移。     

青藤碱通过miR-23b-3p/FGF9诱导人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞凋亡

目的:研究青藤碱(SIN)对人类风湿关节炎(RA)成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)凋亡的影响及分子机制。方法:分离培养人RA FLS,用100 mg/L的脂多糖(LPS)处理记为LPS组;3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同处理细胞,记为LPS+SIN组;不作任何处理的细胞作为空白(blank)组。将miR-con、miR-23b-3p、si-con和si-成纤维细胞生长因子9(FGF9)转染至RA FLS中再用100 mg/L LPS处理,分别记为LPS+miR-con组、LPS+miR-23b-3p组、LPS+si-con组和LPS+si-FGF9组;将anti-miR-con、anti-miR-23b-3p、pcDNA和pcDNA-FGF9转染至RA FLS中,再用3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同处理,分别记为LPS+SIN+anti-miR-con组、LPS+SIN+anti-miR-23b-3p组、LPS+SIN+pcDNA组和LPS+SIN+pcDNA-FGF9组。CCK-8法检测细胞活力;集落形成实验检测细胞的集落形成数;Western blot法检测FGF9、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-23b-3p和FGF9 mRNA的表达水平;双萤光素酶报告基因实验验证miR-23b-3p和FGF9的靶向关系。结果:SIN促进LPS诱导的RA FLS凋亡,抑制细胞增殖,上调miR-23b-3p表达,下调FGF9表达。miR-23b-3p靶向调控FGF9,过表达miR-23b-3p或沉默FGF9抑制LPS诱导的RA FLS增殖并促进细胞凋亡。干扰miR-23b-3p或过表达FGF9逆转了SIN对LPS诱导的RA FLS增殖和凋亡的影响。结论:青藤碱可通过miR-23b-3p/FGF9轴诱导RA FLS凋亡,抑制细胞增殖。     

PAX6抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞转分化

目的:探讨配对盒因子6(PAX6)在血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心脏成纤维细胞(CFs)转分化中的作用及其机制。方法:培养原代成年小鼠CFs,用Ang Ⅱ(10-6mol/L)建立CFs转分化模型,利用小鼠PAX6腺病毒载体感染小鼠CFs;实验分为Ad-GFP+Ctrl组(感染对照腺病毒)、Ad-GFP+Ang Ⅱ组(感染对照腺病毒再给予Ang Ⅱ处理)、Ad-PAX6+Ctrl组(感染过表达PAX6腺病毒)和Ad-PAX6+Ang Ⅱ组(感染过表达PAX6腺病毒再给予Ang Ⅱ处理)。倒置荧光显微镜下观察CFs感染后荧光表达情况;采用Western blot检测CFs中PAX6、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(Col I)、纤连蛋白(FN)和转化生长因子β1(TGFβ1)的表达;固定细胞免疫荧光技术检测α-SMA、Col I和FN的表达与分布;qPCR检测PAX6和TGFβ1的mRNA表达。结果:(1)倒置荧光显微镜下观察腺病毒载体感染CFs成功,qPCR和Western blot证明CFs中PAX6过表达成功(P<0.01);(2)在Ang Ⅱ作用下,CFs中肌成纤维细胞标志物α-SMA显著升高,而过表达PAX6显著抑制Ang Ⅱ诱导的α-SMA表达(P<0.01);(3)过表达PAX6显著抑制CFs中Ang Ⅱ诱导的细胞外基质蛋白Col I和FN的表达与分泌(P<0.05);(4)在Ang Ⅱ处理后,TGFβ1的mRNA和蛋白表达显著升高,而过表达PAX6显著抑制Ang Ⅱ诱导的CFs中TGFβ1的mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论:PAX6通过抑制TGFβ1的表达从而抑制Ang Ⅱ诱导的CFs转分化及细胞外基质蛋白的表达与分泌。     

Mas基因沉默对血管紧张素-(1-7)拮抗血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化的影响

 目的： 探讨Mas基因沉默后对血管紧张素-(1-7) ［Ang-(1-7)］拮抗血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化的影响。方法：（1）有效Mas siRNA的筛选：设计合成3对不同序列针对Mas基因的siRNA,瞬时转染大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）,实验分5组：Mas siRNA序列1、Mas siRNA序列2、Mas siRNA序列3、阴性siRNA序列及正常对照组。转染后48 h,分别用半定量RT-PCR及Western blotting检测Mas mRNA和蛋白的表达水平。（2）研究有效Mas siRNA对Ang-(1-7)拮抗AngⅡ的影响：实验分6组：正常对照组、AngⅡ组、Ang-(1-7)组、AngⅡ+Ang-(1-7)组、阴性siRNA对照组和Mas siRNA转染组。分别培养72 h后,细胞免疫化学法检测细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,ELISA法检测上清液中细胞外基质成分Ⅰ型胶原（ColⅠ）的含量。结果：（1）与组相比,Mas siRNA各组Mas基因的表达均下降,其中以Mas siRNA序列2最明显（P<0.05）。 （2）有效Mas siRNA转染组在加AngⅡ+Ang-(1-7)干预72 h后,较非转染组和阴性siRNA转染组α-SMA及ColⅠ表达均增加,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：Mas siRNA能有效抑制Mas的表达,使Ang-(1-7)拮抗AngⅡ诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化作用明显减弱。     

miR-219与TGFBR2的调控关系在肾脏纤维化中的作用

目的:研究微小RNA-219(miR-219)通过靶向调控转化生长因子βⅡ型受体(TGFBR2)在肾脏纤维化中发挥的作用。方法:收集2017年9月～2018年3月于我院就诊的70例肾脏纤维化患者,选取同期来本院体检的20例健康人设为对照组,RT-qPCR检测肾脏纤维化患者及对照组血清中miR-219的表达水平,并检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激大鼠肾成纤维细胞NRK49F后miR-219的表达水平。Western blot检测转染miR-219模拟物(miR-219 mimics)的NRK49F细胞在AngⅡ刺激后α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达情况。筛选出miR-219的潜在靶基因TGFBR2,并通过萤光素酶报告基因法进行验证。RT-qPCR和Western blot检测miR-219 mimics对TGFBR2的mRNA及蛋白表达的影响。RT-qPCR检测miR-219 mimics对α-SMA、结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)和COL3A1的mRNA表达水平的影响。构建单侧输尿管闭塞(UUO)小鼠模型并检测其肾脏组织中miR-219的表达水平,对UUO小鼠注射miR-219后观察肾脏纤维化的变化情况,并检测COL1A1和COL3A1的mRNA表达水平。结果:肾脏纤维化患者血清中miR-219的表达水平明显低于对照组,UUO小鼠肾脏组织中miR-219的表达显著下降(P0.01);AngⅡ刺激NRK49F细胞后miR-219的表达水平明显降低,且miR-219 mimics可抑制α-SMA蛋白的表达(P0.01);miR-219 mimics对TGFBR2具有靶向调控作用,可抑制TGFBR2的mRNA及蛋白表达;miR-219 mimics可抑制α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1的mRNA表达水平;miR-219可下调UUO小鼠中COL1A1和COL3A1的mRNA表达水平并抑制其肾脏纤维化进程。结论:miR-219可通过抑制TGFBR2的表达从而抑制肾脏纤维化的发展,可能成为肾脏纤维化诊断及治疗的新靶点。     

Intermedin_(1-53)抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞合成胶原

目的探讨IMD1-53对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌成纤维细胞胶原代谢的调节作用。方法培养新生SD大鼠心肌成纤维细胞,将其分成对照组、AngⅡ+不同浓度IMD1-53组。Westem blot法检测心肌成纤维细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达。SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR检测IMD1-53受体样受体(CRLR)和转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达。结果 IMD1-53呈剂量依赖性抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白(P0.01,P0.05)。IMD1-53呈剂量依赖抑制成纤维细胞TGF-β表达(P0.05)。结论 IMD1-53抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞胶原的合成,下调TGF-β表达,可能与IMD1-53抗心肌纤维化作用有关。