延迟性低氧预适应降低小鼠脑皮质cPKCγ蛋白表达

目的探讨cPKCα和γ膜转位水平及蛋白表达量在延迟性脑低氧预适应形成过程中的变化。方法应用SDS-PAGE和Western bolt等技术,并结合Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测延迟性脑低氧预适应小鼠(H5和H6组)脑组织内cPKCα和γ的膜转位水平及蛋白表达量。结果延迟性低氧预适应(H5和H6组)明显降低小鼠脑皮质组织内cPKCγ蛋白表达量(P<0.05),而膜转位(活性)水平变化不显著。对海马cPKCγ、大脑皮质和海马cPKCα蛋白表达量及膜转位水平的影响均不显著。结论大脑皮质cPKCγ蛋白表达量的改变可能参与延迟性脑低氧预适应形成,且可能与皮质和海马低氧选择易损性的差异有关。     

缺血预处理对大鼠视网膜内cPKC亚型特异性膜转位和蛋白表达量的影响

目的通过观察缺血预处理(IP)对大鼠视网膜内经典型蛋白激酶C(cPKC)α、βⅠ、βⅡ和γ等4种亚型特异性膜转位(激活)水平和蛋白表达量的影响,确定可能参与视网膜缺血预适应(IPC)形成的cPKC亚型。方法体重200~250g雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(C,n=6),IP组(左眼内压17.29kPa并维持5min,n=48),假手术组(Sham,n=48);后两组分别在手术处理后10、20和40min及1、12、24、72和168h(每个时间点n=6)取视网膜组织。应用Western blot检测cPKC亚型特异性膜转位水平和蛋白表达量。结果大鼠视网膜组织内cPKCα、βⅠ、βⅡ和γ等亚型中,cPKCα膜转位水平在IP处理后10min~168h内与C和Sham组相比无显著改变,而蛋白表达量在IP处理后12~168h明显升高,在72h达高峰。cPKCγ膜转位水平在IP处理后20min~1h内显著增高,在40min达高峰;cPKCγ蛋白表达量在IP处理后12~72h明显增高,在24h达高峰。IP处理对视网膜组织内cPKCβⅠ、βⅡ膜转位水平和蛋白表达量均无显著影响。结论cPKCγ膜转位(激活)增强可能参与大鼠视网膜IPC早期形成,而cPKCα和γ蛋白表达量的增高可能与晚期IPC的维持有关。     

OGD增加小鼠离体海马组织内cPKC βⅡ和nPKCε的膜转位

目的：通过观察无糖低氧（OGD）刺激对小鼠海马脑片内蛋白激酶C（PKC）特定亚型膜转位水平（激活程度）的影响,进一步证实我们在整体低氧预适应小鼠模型上所获实验结果,并为离体海马脑片缺血/低氧预适应（I/HPC）模型建立及后续药物干预实验打下基础.方法：急性分离小鼠海马组织、制备400μm厚度的脑片,并用无糖低氧（OGD）人工脑脊液（ACSF）模拟缺血/低氧刺激;应用SDS-PAGE和Western bolt等生化技术,并结合GelDoc凝胶成像系统,半定量检测OGD刺激2、5、10、15和30min后海马脑片内cPKCβⅡ和nPKCε的膜转位水平.结果：OGD刺激可增高海马脑片内cPKCβⅡ和nPKCε的膜转位水平,且这种增高从刺激5 min开始持续至30 min均有显著差异（P＜0.001,n=6）.结论：实验结果进一步证实cPKCβⅡ和nPKCε可能参与脑缺血/低氧性预适应的形成过程,并提示OGD 10 min作为制备离体海马脑片I/HPC模型的预处理刺激较为合理.     

低氧预适应增加小鼠脑组织蛋白激酶C膜转位

初步探讨蛋白激酶C(PKC)在脑低氧预适应发生机制中的作用，以我室建立的小鼠低氧预适应模型，结合SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western bolt)等生化技术，观察了低氧预适应对小鼠大脑皮层及海马组织内PKC膜转位的影响。结果表明，在小鼠大脑皮层和海马组织内的PKC膜转位均随着低氧次数(小鼠低氧耐受时间)的增加而增高。特别是低氧3次的海马组织和低氧4次的大脑皮层和海马组织内，PKC膜转位的增加有统计学显著意义。结果提示，PKC的激活可能在脑低氧预适应发生机制中具有重要的作用。     

OGD增加小鼠离体海马组织内cPKCβII和nPKCε的膜转位

目的:通过观察无糖低氧(OGD)刺激对小鼠海马脑片内蛋白激酶C(PKC)特定亚型膜转位水平(激活程度)的影响,进一步证实我们在整体低氧预适应小鼠模型上所获实验结果,并为离体海马脑片缺血/低氧预适应(I/HPC)模型建立及后续药物干预实验打下基础。方法:急性分离小鼠海马组织、制备400!μm厚度的脑片,并用无糖低氧(OGD)人工脑脊液(ACSF)模拟缺血/低氧刺激;应用SDS-PAGE和Westernbolt等生化技术,并结合GelDoc凝胶成像系统,半定量检测OGD刺激2、5、10、15和30min后海马脑片内cPKCβII和nPKCε的膜转位水平。结果:OGD刺激可增高海马脑片内cPKCβII和nPKCε的膜转位水平,且这种增高从刺激5min开始持续至30min均有显著差异(P<0.001,n=6)。结论:实验结果进一步证实cPKCβII和nPKCε可能参与脑缺血/低氧性预适应的形成过程,并提示OGD10min作为制备离体海马脑片I/HPC模型的预处理刺激较为合理。     

低氧预适应升高小鼠脑内JNK磷酸化水平和蛋白表达

目的探讨C-JUN氨基末端激酶或应激激活蛋白激酶(JNKs/SAPKs)在脑低氧预适应发生、发展过程中的作用。方法将小鼠整体低氧预适应模型中BALB/C小鼠随机分为正常对照(H0)、早期(H1~H4组)和延迟性(H5~H6组)低氧预适应等7组。应用SDS-PAGE和Western bolt方法,并结合Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测大脑皮层和海马组织内JNK1和JNK2/3的磷酸化水平及其蛋白表达量的变化。结果在早期低氧预适应形成过程中,随低氧次数的增加,小鼠大脑皮层和海马组织内JNK1的磷酸化水平(未检测到磷酸化的JNK2/3)逐渐升高,且以皮层内(H1和H2组)和海马组织内(H1~H4组)的增高明显(P<0.05,n=6);而JNK1和JNK2/3只在延迟性低氧预适应(H5~H6组)发展过程中明显上调(P<0.05,n=6)。结论JNK1的激活以及JNK1和JNK2/3蛋白表达量的增高可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生和发展。     

低氧预适应对小鼠脑组织内cPKCβI和Βii膜转位水平的影响

目的:通过观察重复性低氧刺激对蛋白激酶CβI和βII亚型(cPKCβI,cPKCβII)膜转位水平(或激活程度)的影响,初步探讨cPKCs特定亚型在脑低氧预适应发生发展过程中的作用。方法:按我室已建立的小鼠低氧预适应模型方法,制备重复性低氧1-4次小鼠(H1-H4)。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)等生化技术,并结合应用Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测小鼠海马和大脑皮层组织内cPKCβI和βII的膜转位水平。结果:随低氧刺激次数(H1-H4)的增加,小鼠海马组织内cPKCβII的膜转位水平升高,H4组膜转位水平显著高于H0(100%,n=10)和H1(79·5%±10·7%,n=10)组(173·3%±21·3%,P<0·01,n=10);同样,大脑皮层内cPKCβII膜转位水平也随低氧次数的增加而升高,H3(119·8%±7·7%,n=6)和H4(131·8%±4·7%,n=6)组膜转位水平均显著高于H0(100%,n=6)组(P<0·05,n=6);而cPKCβI亚型的膜转位水平无论在大脑皮层还是海马组织内的变化均不显著(P>0·05,n=8)。结论:cPKCβII膜转位(激活)可能在脑低氧预适应的发生发展过程中发挥着重要作用。     

低氧预适应小鼠脑内ERK1/2磷酸化水平和蛋白表达量的改变

目的：初步探讨细胞外信号调节激酶（Extraeellular signal-regulated kinases，ERK1／2）在脑低氧预适应发生发展过程中的作用。方法：按已建小鼠整体低氧预适应模型，将BALB／C小鼠（18-22g，雌雄不限）随机分为正常对照（H0）、早期（H1-H4）和延迟性（U5-H6）低氧预适应等7组（每组至少6只动物）。应用SDS-PAGE和Western blot等生化技术，并结合Gel Doc凝胶成像系统，半定量检测小鼠脑组织内ERK1／2的磷酸化水平和蛋白表达量。结果：①早期低氧预适应形成过程中，随低氧暴露次数的增加（H1-H4），小鼠海马和皮层组织内ERK1／2磷酸化水平显著降低（P〈0．05，n=6），而ERK1／2蛋白表达量并无显著变化；②延迟性低氧预适应中（H5-H6），小鼠大脑皮层和海马组织内ERK1／2的蛋白表达量显著降低（P〈0．05，n=6）。结论：ERK1／2的活性降低（磷酸化水平降低），以及ERK1／2蛋白表达量下调可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生发展过程。     

低氧预适应小鼠脑皮层内与nPKCe相互作用蛋白的鉴定

目的鉴定脑低氧预适(HPC)小鼠脑皮层组织内与新奇型蛋白激酶Cε(nPKCε)相互作用的蛋白。方法利用免疫沉淀(IP)和双向电泳(2-DE)技术分离小鼠脑皮层中与nPKCε相互作用的蛋白;以ImageMaster2D Platinum软件对双向电泳图谱进行差异表达分析;目标蛋白用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)及蛋白印迹(Western blot)进行鉴定分析。结果与对照组比较,HPC小鼠脑皮层内与nPKCε相互作用的胞质成分中有34个蛋白点上调,20个蛋白点下调,膜相关成分中有27个蛋白点上调,28个蛋白点下调;HPC后脑皮层胞质及膜相关成分中与nPKCε相互作用的热休克蛋白(HSP)70和14-3-3γ的蛋白表达量均升高,而HSP60仅在膜相关成分中升高(P<0.05,n=3)。结论nPKCε可能通过调节HSP60、HSP70和14-3-3γ等多种与其相互作用的蛋白参与脑HPC的形成。     

蛋白激酶CβⅡ和γ参与低氧预适应降低脑中动脉阻塞所致鼠脑缺血性损伤

目的 探讨低氧预适应(HPC)对脑中动脉梗塞(MCAO)小鼠脑的保护作用,以及缺血皮层内经典型蛋白激酶C(cPKC) II和 膜转位水平的改变。方法 健康雄性BALB/c小鼠(18～22g,8～10周)随机分为：H0假手术(n=6), H0缺血(n=6),H4假手术(n=6)和H4缺血(n=6)组。运用整体低氧预适应模型和脑中动脉梗塞缺血模型,结合2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)等分子生物学技术,观察脑梗死面积、缺血区密度值和水肿率,以及MCAO小鼠缺血皮层组织内PKC II和 膜转位水平的变化。 结果 研究发现,HPC可明显减小MCAO导致的鼠脑梗死面积(P<0.05),降低缺血区吸光度值(P<0.05)和水肿率(P<0.05);与H0假手术组相比,缺血组小鼠皮层半影区cPKC II和 膜转位水平显著降低 (p<0.05);与H0缺血组小鼠皮层半影区相比,H4缺血组小鼠皮层半影区内PKC II和 膜转位水平明显增高 (p<0.05)。结论 HPC可能通过增加MCAO小鼠皮层组织内cPKC II和 的膜转位水平,对缺血损伤起保护作用。     

急性缺氧预适应对小鼠大脑皮层和海马组织PKCγ膜转位的影响

目的 :被视为细胞内第三信使的蛋白激酶C(PKC)是由Takai于 1977年发现的 ,PKC是一类使底物蛋白内丝氨酸 /苏氨酸残基磷酸化、通过水解而被激活的蛋白激酶家族 ,只有与膜相连并与DAG结合才能活化。近年来 ,PKC在缺氧 /复氧及缺血 /再灌中的病理作用逐渐受到关注。早期的缺血 /缺     

低氧预适应小鼠脑组织内P38 MAPK磷酸化水平增高

目的探讨P38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)在小鼠脑低氧预适应形成过程中的作用。方法用成年雄性BALB/c小鼠制备小鼠整体低氧预适应模型,小鼠随机分为正常对照(H0)、早期(H1～H4)和延迟性(H5～H6)低氧预适应等7组;应用Westernbolt并结合GelDoc凝胶成像系统,定量检测小鼠脑组织内P38MAPK磷酸化水平和蛋白表达量。结果与H0组小鼠相比,H2~H6组的海马和皮层及H3～H6组的下丘脑中P38MAPK磷酸化水平明显增高(P<0·05,每组n=6);H1~H6组的皮层、海马和下丘脑中P38MAPK蛋白表达量无明显变化。结论P38MAPK磷酸化激活而非蛋白表达量的变化可能参与了小鼠脑低氧预适应的发生、发展过程。     

低氧预适应鼠脑海马组织内与cPKCγ相互作用的ERK1/2磷酸化水平降低

目的探讨与经典型蛋白激酶Cγ(cPKCγ)相互作用的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化水平在小鼠脑低氧预适应形成过程中的变化。方法用成年雄性BalB/c小鼠制备整体低氧预适应模型,将小鼠随机分为正常对照(H0)、早期低氧预适应(H3)和延迟性低氧预适应(H6)3组。应用免疫共沉淀,Western blot等方法检测胞质和膜相关成分中与cPKCγ相互作用的ERK1/2的磷酸化水平。结果小鼠海马组织中ERK1/2能与cPKCγ免疫共沉淀,且与H0组相比,H3及H6组ERK1/2的204位酪氨酸磷酸化水平明显降低(P<0.05)。结论小鼠海马组织中,cPKCγ与ERK1/2存在相互作用,且可能参与了脑低氧预适应的发生和发展。     

低氧预适应鼠脑内MSK1磷酸化水平的变化

目的:初步探讨丝裂原和应激激活的蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1,MSK1)在脑低氧预适应(HPC)发生发展过程中的作用。方法:按我们已建小鼠整体HPC模型,将健康成年BALB/c小鼠(18～22g,雄性)随机分为正常对照(H0)、早期(H1-H4)和延迟性(H5-H6)HPC等7组(每组n=6)。应用SDS-PAGE和Western blot技术,并结合Gel Doc凝胶成像系统,定量检测小鼠脑海马和皮层组织内MSK1第645位苏氨酸(p-Thr645-MSK1)和第375位丝氨酸(p-Ser375-MSK1)的磷酸化水平,以及MSK1总蛋白表达量的变化。结果:在脑早期(H1-H4)和延迟性(H5-H6)HPC形成过程中,随重复性低氧暴露次数的增加,H1-H6组小鼠海马和皮层组织内p-Thr645-MSK1及p-Ser375-MSK1的磷酸化水平较正常对照组(H0)显著增高(P<0.05);然而,小鼠海马和皮层组织内MSK1总蛋白表达量在H0-H6组中无明显变化。结论:MSK1磷酸化水平增高可能参与了小鼠脑HPC的发生发展过程。     

cPKCgamma参与低氧预适应对小鼠脑缺血皮层内CRMP2水解和磷酸化的调节

 摘要：目的 探讨经典型蛋白激酶Cgamma( cPKCgamma)在低氧预适应(HPC)调节小鼠脑缺血皮层内脑衰反应蛋白-2(CRMP2)水解和磷酸化中作用。方法 利用雄性BALB/c小鼠(18-22g) HPC和大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,借助蛋白印迹、免疫共沉淀和免疫组化等生物化学技术,观察cPKCgamma激活对小鼠缺血脑皮层内CRMP2蛋白水解程度（BDP）和磷酸化水平（p-CRMP2）、cPKCgamma-CRMP2相互作用和皮层缺血半影区内p-CRMP2阳性细胞数的影响。结果　我们发现,HPC显著提高缺血脑皮层半影区内p-CRMP2水平,降低BDP产物形成,而侧脑室注射cPKCgamma抑制剂Go6983(6nM)可明显解除HPC对半影区内CRMP2蛋白水解和磷酸化的调节作用;免疫共沉淀结果提示,cPKCgamma激活程度参与HPC对缺血脑皮层半影区内cPKCgamma-CRMP2相互作用的调节;同时,免疫组化进一步证实,cPKCgamma激活与HPC提高脑缺血半影区内p-CRMP2阳性细胞数有关。结论 cPKCgamma参与HPC对小鼠缺血脑皮层内CRMP2水解与磷酸化的调节。     

低氧预适应过程中小鼠脑内CGRP和AngⅡ含量的变化

近年来有研究表明 ,降钙素基因相关肽 (ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｇ ｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ,ＣＧＲＰ)在实验性缺血预适应中具有明显的心肌保护作用[1] ,而血管紧张素Ⅱ (ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡ ,ＡｎｇⅡ )生成的抑制剂则能有效地保护缺血及缺血再灌注引起的脑损伤[2 ] 。本研究观察了反复低氧对小鼠低氧耐受性的影响并监测了小鼠脑内ＣＧＲＰ和ＡｎｇⅡ含量随反复低氧次数增加而发生的动态改变。1　材料与方法1 1　标准耐受时间的测定 :雄性昆明小白鼠体重 18 0～ 2 2 0ｇ(首都医科大学动物部提供 )随机分为对照组、低氧 1、…     

急性重复低氧对小鼠脑游离脂肪酸的影响

用气相色谱法测定急性重复低氧对小鼠脑中游离脂肪酸组分与含量，与对照组相比，１次低氧组的游离脂肪酸含量均显著上升，４次重复低氧组的ＦＦＡ含量均降至对照水平。对照，１次低氧，４次重复低氧３组动物脑匀浆中ＦＦＡ的组分之间均无显著差异，即使低氧耐受时间达１４３分钟，亦未见到新的脂肪酸。结果提示，动物对低氧的耐受性与脑中ＦＦＡ含量的适应性有关。     

低氧预适应鼠脑内核糖体S6激酶磷酸化水平和蛋白表达量的变化

探讨核糖体S6激酶(ribosomal S6kinase,RSK)Ser221(PDK1磷酸化位点)和Thr359/Ser363(ERK1/2磷酸化位点)的磷酸化水平以及总RSK蛋白表达量在小鼠脑低氧预适应发生发展过程中的变化。将成年雄性BALB/c小鼠(18～22g)随机分为正常对照(H0)和重复性低氧1～4次(H1～H4)等5组(每组n=6)。应用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)技术,定量检测整体低氧预适应小鼠海马和皮层组织内Ser221位点(p-Ser221 RSK)和Thr359/Ser363位点(p-Thr359/Ser363 RSK)的磷酸化水平以及总RSK蛋白表达量。结果表明,随着低氧暴露次数增加,小鼠海马和皮层组织内p-Ser221 RSK磷酸化的水平显著增高(P<0.05,n=6),伴随着p-Thr359/Ser363 RSK磷酸化的水平明显降低(P<0.05,n=6);而RSK总蛋白的表达量则无明显改变。结果提示,Ser221 RSK磷酸化水平增高和Thr359/Ser363 RSK磷酸化水平降低可能参与了小鼠脑低氧预适应的发生发展过程。     

急性重复低氧预适应小鼠海马组织蛋白磷酸酶1γ表达的变化

目的:检测急性重复低氧预适应小鼠海马脑组织中蛋白磷酸酶(protein phosphatase,pp)1γ的变化,探讨pp1γ的变化在低氧预适应脑保护中的作用。方法:成年昆明小鼠随机分成低氧暴露1次组(H1)或低氧暴露4次(H4)组和常氧组(H0)。低氧结束后取海马组织,应用Real-time PCR技术和蛋白印记技术检测pp1γ表达的变化;应用磷酸酶活性实验对pp1活性的变化进行检测;应用甲基化测序实验对pp1γ启动子区(95~321 bp)甲基化变化进行检测。结果:pp1γ的mRNA在H4组表达较H0组降低,差异有统计学意义(P0.01);pp1γ的蛋白质变化与mRNA变化一致,在H4组的表达较H0组降低,差异有统计学意义(P0.05);pp1γ水解磷酸的活性在H4组和H1组均低于H0组(P0.05);pp1γ启动子区(95~321 bp)DNA甲基化情况在三组间未见差异。结论:pp1γ变化可能参与了低氧预适应小鼠获得的脑保护,但该变化可能与其启动子区(95 bp~321 bp)的甲基化无关。