一种优化的DNA家族改组方法

目的 :优化DNA家族改组方法 ,增加改组分子库的多样性。方法 :以人、猴、兔的BPI2 3基因为模板 ,首先将3种基因的PCR产物等量混合后用DNaseⅠ消化 ,回收 5 0bp左右的片段 ,再经过无引物和有引物两步PCR反应获得与原基因大小相同的改组分子 ,将其与载体连接获得改组分子库。随机挑取 4个克隆测序观察改组效果。结果 :4个克隆均为 3种模板基因片段的杂合体 ,其中 3个克隆还包含氨基酸点突变 ,表明改组分子库多样性较大 ,改组方法较为成功。结论 :该方法的建立为进一步筛选高活性的BPI2 3分子打下基础 ,并为改组其他基因家族提供了借鉴。     

胃癌中生长抑素表达的临床病理意义及DNA含量分析

应用免疫组化及图像分析技术观察１４０例组织学类型胃癌中生长抑素的表达，并随其中１２７例。     

X射线诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及线粒体DNA基因表达下调

目的 研究不同剂量X线对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响，并检测其线粒体DNA（mtDNA）基因的差异表达。方法 以同步培养的未受照细胞为对照，8MVX线分别以2、4、6和8Gy的吸收剂量照射A549细胞，MTT比色法分析细胞增殖曲线；并于照射后24h，流式细胞仪测定细胞周期分布和凋亡率，电镜观察细胞超微结构，人mtDNA基因表达谱芯片检测靶基因的表达变化。结果X射线抑制A549细胞增殖，以4Gv为显著；随着照射剂量的增加，细胞凋亡率增加，G2／M期细胞比率增加，6和8Gy组表现出G2／M期阻滞，透射电镜下4Gy组可见凋亡的形态改变，8Gy组细胞近碎裂；X射线照射后mtDNA编码基因呈普遍下调表达，包括2Gy组的3种tRNA基因、4Gy组的2种tRNA基因和4种mRNA基因、6Gy组的6种tRNA基因和1种rRNA基因，8Gy组的2种tRNA基因。结论X射线可抑制A549细胞增殖，诱导细胞凋亡及mtDNA编码基因的普遍下调表达。随着辐射剂量的增加，剂量依赖性效应逐步减弱而解除。4Gy为体外研究的相对高效、安全剂量。     

裸DNA肌肉注射不同注射方法对标记基因转染效率的影响

在肌肉损伤基因治疗应用研究中 ,裸DNA直接注射法具有安全可靠 (不会引起炎症反应和导致插入突变 )、制作工艺简单、操作简便 (与传统的注射方法非常相近 )、可重复注射等优点。以往研究表明 ,肌肉DNA注射基因转移的注射技术是显著影响表达水平的一个重要参数。因此 ,本研究比较了直接注射、注射后保持和缩进式注射三种不同注射方法对基因转移效率的影响 ,进行了不同注射方法的机理探讨。实验结果显示 ,缩进式注射方法转染效率最高 ,直接注射和注射后保持两种方法间无显著性差异。结果提示 ,质粒不是通过细胞膜的破损进入细胞 ,可能是“受体介导”或“T管和内陷”作用的结果。这一结果支持“T管和细胞内陷说”和“受体介导说”。     

DNA甲基转移酶1在子宫颈癌组织和细胞中的表达及意义

目的 研究DNA甲基转移酶1(DNMT1)在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达情况,分析其表达率与宫颈癌临床病理因素之间的关系,并探讨其在官颈癌发生发展过程中的作用.方法 采用免疫组化SP法检测DNMT1蛋白在3株宫颈癌细胞系(SHa、Hela、C33A细胞系)及89例宫颈癌组织、20例宫颈上皮内瘤变(CIN)、20例正常宫颈上皮组织石蜡标本中的阳性细胞表达率,并分析其与宫颈癌临床病理因素之间的关系;用RT-FCR方法检测DNIVlT1mRNA在3株宫颈癌细胞系及35例宫颈癌组织、24例CIN、20例正常宫颈组织新鲜标本中的表达情况.结果 DNMT1蛋白在3株宫颈癌细胞中均有表达,而在对照组(人子宫内膜间质细胞)中无表达,在宫颈癌组织中的阳性表达率为71. 9%,高于CIN组织(35.0%,P<0.05)和正常宫颈组织(10.0%,P<0.05);DNMT1蛋白的异常表达与宫颈癌组织的分化程度有关(P<0.05),与年龄、肿瘤病理型别、有无淋巴结转移和临床分期无明显关系.DNMT1mRNA在3株宫颈癌细胞中均有表达,对照组细胞中无表达,在宫颈癌组织中的阳性表达率为85.7%,高于CIN组织(强33.3%,P<0.05)和正常宫颈组织(5.0%,P<0.05).结论 DNMT1 mRNA和蛋白在宫颈癌组织和细胞中的阳性表达率均高于正常宫颈组织,有可能作为宫颈癌早期诊断的标志物.     

丙型肝炎病毒核心蛋白激活iNOS表达对DNA的损伤作用研究

目的：在转基因小鼠中，研究丙肝病毒（HCV）核心蛋白激活诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）表达对DNA的损伤作用。方法：携带HCVeDNA的质粒载体pSC—1／HCV显微注射入C57小鼠受精卵。取12月龄小鼠肝组织标本．RT-PCR和Western印迹检测HCV和iNOS的表达水平。尾静脉注射小分子RNA干扰片段作为实验组，PBS作为对照组。对比各组小鼠的iNOS在mRNA和蛋白水平的表达情况及其体内NO的含量。通过连接反应介导的PCR（LM-PCR）方法，评价iNOS和NO水平变化对DNA双链断裂（DSB）的影响。结果：在转基因小鼠的肝脏中，有HCV和iNOS的特异性高表达，NO含量和DSB水平也远高于未转染HCV基因的正常小鼠。经RNA干扰作用6d后，实验组小鼠的iNOS表达在mRNA和蛋白水平都有非常明显的下降（P〈0．01）；同时NO含量也下降（P〈0．01），DSB现象基本消失。结论：HCV核心蛋白在肝细胞中能激活iNOS的表达，诱导生成NO，进而引发DSB现象，造成时基因组DNA的损伤。RNA干扰可以有效逆转HCV对iNOS基因的激活，对于治疗和预防HCV患者发生的肝癌具有重要意义。     

用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA

目的：用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变。方法：用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322-Red)宿主菌，利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至Ⅳ基因长约2100bp的DNA序列，并用kil-N序列中含有的单一酶切位点Xho Ⅰ对混合质粒进行酶切，取酶切产物转化W3110感受态细胞，菌落PCR方法筛选重组阳性克隆。结果：在没有任何筛选标记的情况下，用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆。结论：该方法操作简单、精确，能够避免引入新突变。为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法。     

X射线对人肺腺癌A549细胞增殖及线粒体DNA基因表达的影响

目的 研究X射线辐射对人肺腺癌A549细胞增殖及线粒体DNA(mtDNA)基因表达的影响。方法 8 MV X射线以4 Gy的吸收剂量照射A549细胞,照射后不同时间检测细胞周期分布和凋亡率,电镜下观察细胞超微结构,人mtDNA基因表达谱芯片检测靶基因的表达变化。结果 照射后12 h即出现G₂/M期的阻滞,凋亡率在照射后48 h达到峰值,透射电镜下可见凋亡的形态改变。X射线照射后mtDNA编码基因表达呈普遍下调,包括12 h组的1种tRNA和4种mRNA基因、24 h组的2种tRNA和4种mRNA基因、48 h组的13种mRNA和2种rRNA及4种tRNA基因、72 h组的11种mRNA和2种rRNA基因。结论 X射线辐射可导致A549细胞G₂/M期阻滞,mtDNA编码基因的普遍低表达可能和辐射诱导凋亡相关。     

重离子辐射的DNA链断裂效应

重离子辐射的ＤＮＡ链断裂效应袁雄叶常青周平坤重离子系指原子序数（Ｚ）等于和大于２的原子被剥掉或部分剥掉外周电子后带正电荷的原子核。随着人类向外层空间的拓展和放射治疗的应用，重离子的生物效应研究日益受到重视。但对重离子生物效应的研究远远少于对电子、光子...     

新基因LRP15参与紫外线诱导的DNA损伤的修复作用

目的探讨LRP15基因在K562细胞中对紫外线诱导的DNA损伤的修复作用，以进一步研究该基因的功能。方法利用真核表达质粒pcDNA3．1构建LRP15基因开放阅读框架（ORF）序列的正义及反义重组质粒；两种质粒经阳性脂质体介导法分别转染K562细胞，G418筛选阳性克隆；采用单细胞凝胶电泳（SCGE）技术观察两组细胞对紫外线诱导的DNA损伤的修复作用的差异。结果PCR鉴定证实，正义及反义重组质粒中LRP15基因ORF序列均按预定方向正确插入；SCGE实验表明，经紫外线照射后两组细胞的DNA基础损伤无明显差异（P=0.156）。但经45及90min修复后实验组细胞的DNA迁移长度明显小于对照细胞（P〈0．001）。结论成功构建LRP15基因的正义及反义真核表达质粒；LRP15基因对紫外线诱导的DNA损伤具有修复作用，可能是一个DNA修复基因。     

肝癌裸鼠移植瘤端粒酶活性表达的近日节律

目的：探讨肝癌裸鼠移植瘤细胞DNA合成与端粒酶表达的近日节律。方法：在时辰同步化裸鼠中构建肝癌细胞SMMC-7721裸鼠移植瘤，继续在程控光照条件下饲养，于光照后3、9、15、21h取样，用流式细胞仪测定各时期细胞DNA含量，细胞周期分布及端粒酶活性水平。结果：肝癌裸鼠移植瘤细胞DNA合成随近日节律变化，且伴随端粒酶活性的同步节律变化，呈近日节律特征。结论：肝癌裸鼠移植瘤的生长与端粒酶活性表达在静止相达高峰，为制定肿瘤时辰化疗方案提供了有价值的参考。     

10-23型脱氧核酶对mRNA表达的双重抑制作用

目的：10-23型脱氧核酶是脱氧核糖核酸酶中的一种，能主动在RNA分子嘌呤．嘧啶结合点切割所有RNA分子，通过比较反义寡核苷酸的作用，初步研究10-23型脱氧核酶对基因表达抑制作用的发生机制。方法：采用体外转录GFPmRNA与脱氧核酶反应，以及GFP表达质粒与脱氧核酶共转染HeLa细胞，观察脱氧核酶对GFP的抑制作用。结果：体外和胞内实验均显示据靶点设计的10-23型脱氧核酶对绿色荧光蛋白mRNA具有切割作用。当10—23型脱氧核酶的两翼结合臂各具有连续8碱基互补而处在两翼结合臂和酶解核心连接处的2碱基错配时，尽管不能切割mRNA但是在胞内仍然有表达抑制作用；而当两翼结合臂具有4互补碱基紧接1错配碱基和4互补碱基时，10—23型脱氧核酶体外和胞内均丧失作用。结论：10-23型脱氧核酶对基因较强的表达抑制作用来自结合臂的反义寡核苷酸依赖的RNaseH降解，和本身对mRNA直接切割作用的叠加，即10—23型脱氧核酶在细胞内具有对基因识别切割和诱导RNaseH进行再切割的双重作用。     

基于CO1基因序列的DNA条形码在中尼边境鼠类物种鉴定中的应用

目的 探讨了线粒体CO1基因作为DNA条形码对鼠类进行物种鉴定的可行性.方法 将从中尼边境采集到的42个鼠类标本,提取基因组DNA,用通用引物PCR法扩增线粒体CO1基因,并测序.将测序结果与GenBank中其他鼠类物种的DNA条码进行BLAST比对,并构建分子进化树.结果 本研究中有17个标本能通过PCR扩增出特异性CO1基因条带,17个标本的种内遗传距离平均值为0.035,种间遗传距离平均值为0.47,种间遗传距离是种内遗传距离的10倍以上.根据BLAST比对法,将采集到的17个标本分到不同的鼠种中.结论 CO1基因序列能够对鼠类进行有效的物种鉴定.     

电离辐射损伤与DNA修复基因

DNA辐射损伤直接影响复制、转录和蛋白质合成,进而影响细胞遗传、发育、生长和代谢等生命活动。DNA损伤还是突变的重要原因,而严重的突变可造成细胞癌变,导致肿瘤的发生。然而,生物体内存在着DNA损伤修复系统,其中DNA修复基因起着重要的作用。     

人线粒体核糖体蛋白S17 cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的克隆人MRPS17cDNA,并在大肠杆菌中表达纯化。方法从人原代培养毛乳头细胞中分离总RNA,采用RTPCR及序列测定等方法获得人MRPS17cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;C末端融合了6×His纯化标签的表达产物行Western印迹法分析并用Ni2 NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白行SDSPAGE纯度分析。结果获得了人MRPS17cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28aMRPS17;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约13kD的目的蛋白;表达产物经Ni2 NTA离子交换树脂纯化,纯度>90%。结论克隆得到了人MRPS17cDNA,并在E.coli中成功表达和纯化了MRPS17蛋白,为后续研究奠定了基础。