蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究

 目的 研究蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学。方法 以回芹内酯为内标,采用液质联用（LC/MS）的方法测定蛇床夫内酯在体外代谢中的代谢产物3″,8- 甲氧基异欧前胡内酯（M1）和5″- 羟基-8- 甲氧基异欧前胡内酯（M2）。用Linewrave-Burk作图分析数据,计算酶促动力学常数。结果 代谢物M1的V_max=1.152 5 μmol·(min·mg pro)-1, K_m=133.156 6 μmol·L-1,M2的V_max=1.630 8 μmol·(min·mg pro)-1, K_m=292.857 1 μmol·L-1。 结论 该方法简单、快速、可靠,适用于蛇床夫内酯的体外代谢研究。     

液体发酵生产猪苓胞内多糖的条件优化

目的: 优选猪苓液体发酵生产胞内多糖的工艺条件。方法: 采用摇瓶培养法制备猪苓胞内多糖的发酵培养基,以猪苓胞内多糖得率为指标,通过单因素试验考察氮源、碳源和发酵条件,正交试验优选培养基的组成。结果: 液体发酵生产猪苓胞内多糖的最适碳源为蔗糖,最适氮源为黄豆粉,优选的培养基组成为马铃薯10.0%,蔗糖4.0%,黄豆粉0.3%,KH₂PO₄ 0.2%,MgSO₄·7H₂O 0.15%;发酵条件为初始pH 5.2~5.6,振荡速度180~200 r·min^-1,培养温度28℃,培养时间7 d。结论: 液体发酵猪苓胞内多糖具有周期短、产量高的优势,对猪苓多糖工业化生产和降低生产成本具有重要意义。     

龙葵碱对HepG2细胞NAT1酶活性及动力学影响的研究

 目的 探讨龙葵碱诱导HepG2细胞凋亡的芳香胺N-乙酰化转移酶（NAT1的影响。方法 采用高效液相色谱法(HPLC,以对氨基苯甲酸(PABA为底物,以PABA被NAT1乙酰化为乙酰对氨基苯甲酸(Ac-PABA的量反应NAT1酶的活性。观察不同浓度、不同时间龙葵碱对完整HepG2细胞NAT1酶活性的影响;龙葵碱对HepG2细胞细胞质中NAT1酶活性的影响;通过改变底物PABA浓度,采用双倒数作图法,以底物PABA浓度的倒数(1/S对NAT1反应速率的倒数(1/V作直线,得出回归方程,计算K_m和V_max。结果 在NAT1酶活性测定中,龙葵碱能显著降低HepG2完整细胞NAT1的活性;龙葵碱能够降低HepG2细胞质内NAT1的活性;随着作用时间的增加Ac-PABA生成的量逐渐增加,但在相同作用时间段龙葵碱能显著降低Ac-PABA生成的量。动力学研究表明,以PABA为底物,对于HepG2完整细胞,阴性对照组的K_m和V_max分别为(1.04×10-3±8.36×10-5mmol·L -1、(1.64×10-4±9.57×10-6 nmol·106 cells-1,龙葵碱组的K_m和V_max分别为(1.06×10-3±6.97×10-5 mmol·L-1和(1.48×10-4±4.28×10-6 nmol·106 cells-1·h-1。对于HepG2细胞质,阴性对照组的K_m和V_max分别为(3.32×10-1±2.35×10-4mmol·L -1、(2.60×10-3±6.79×10-6 nmol·h-1·mg pro-1,龙葵碱组的K_m和V_max分别为(3.35×10-1±1.66×10-4 mmol·L-1和(2.22×10-3±8.12×10-6 nmol·h-1·mg（Pro-1,经统计学处理表明,对于HepG2完整细胞和细胞质,阴性对照组和龙葵碱组的K_m没有差异,而V_max差异显著。结论 龙葵碱是HepG2细胞NAT1酶的非竞争性抑制剂。龙葵碱通过作用于NAT1与PABA结合位点以外的其他位点抑制NAT1酶的活性而诱导HepG2细胞凋亡。     

戊二醛固定化脂肪酶活性包涵体的性质研究

 目的 考察戊二醛（GA）交联的黏质沙雷氏菌ECU1010脂肪酶活性包涵体的酶学性质。方法 分别对游离酶和固定化酶的pH稳定性、热稳定性、K_m值、有机溶剂和金属离子耐受性进行研究,同时考察固定化酶的操作稳定性和贮存稳定性。结果 固定化酶在pH 5.0~10.0稳定性较好;60 ℃以下仍可保持48%以上的酶活;对亲水性有机溶剂和金属离子的耐受性增强;操作稳定性和贮存稳定性大有提高。结论 脂肪酶活性包涵体经固定化后其稳定性显著提高。     

中国肝移植受者口服环孢素的临床常规监测群体药动学研究

 目的 考察肝移植受者口服环孢素的群体药动学特征,为实施个体化用药提供新途径。方法 回顾性收集120例肝移植病人全血稳态谷浓度样本1 947个,利用NONMEM软件考察一天给药剂量,分析其群体药动学模型,估算参数、个体间变异（interindividual variability, IIV）、时间效应变异（interoccasion variability, IOV）和个体内变异,定量考察人口统计学资料、生理状态、肝肾功能和合并用药等因素对药物药动学参数的影响,建立最终回归模型,应用POSTHOC子模块反馈获得个体和群体的药动学参数及预测给药剂量。模型验证用近似外部验证和bootstrap内部验证法。结果 环孢素稳态浓度能用米曼氏模型较好的拟合,最终群体药动学参数Vm为303 mg·d-1,K_m为14.90 μg·L-1。Vm和K_m的IIV分别为12.60%和89.78%,IOV分别为12.30%和36.88%,残差变异为4.00%。 Vm结构模型参数有用药天数（DT）、红细胞压积（HCT）、总蛋白（TP）、尿素（BUN）、甘油三酯（TG）、吗替麦考酚酸酯剂量（MMF）。K_m结构模型参数有胆红质（DBIL）和泼尼松剂量（PR）。结论 NONMEM法考察临床常规监测数据应当考虑IOV,分析得到的群体药动学模型可为临床患者提供用药依据。     

5种黄连生物碱大鼠体外肝代谢特征比较

目的 探讨黄连中5种结构相似异喹啉生物碱大鼠体外肝代谢的选择性。方法 采用大鼠体外肝微粒体温孵方法,通过考察温孵时间、微粒体蛋白浓度以及底物浓度对小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱和药根碱代谢的影响,求得代谢反应动力学参数K_m、V_max和CL_int。结果 5种黄连生物碱成分的体外肝代谢动力学参数K_m和CL_int间差异明显（P＜0.05）。结论 黄连中5种异喹啉生物碱大鼠体外肝代谢存在显著选择性。     

LC-MS/MS研究新型酪氨酸酶抑制剂UP302在大鼠肝微粒体中代谢的酶动力学

 目的 建立并验证测定大鼠肝微粒体孵育液中UP302含量的高效液相色谱-串联质谱法,研究UP302在大鼠肝微粒体中代谢的酶动力学。方法 经大鼠肝微粒体孵育的UP302样品,经色谱柱分离,电喷雾离子化负离子检测,扫描方式为选择反应监测,用于定量分析的离子反应分别为m/z 301.1→135.2（UP302）和m/z 252.9→132.0（内标大豆苷元）。考察不同孵育时间、底物浓度和微粒体浓度对UP302代谢的影响,确定最佳反应条件。结果 标准曲线线性范围为0.1～20 μmol·L-1,线性关系良好,日内日间准确度在86.42%～112.59%,日内日间精密度均小于9.09%,回收率在100.50%～109.91%之间。确定了酶动力学参数,最大反应速度V_max为196.08 μmol·L-1·min-1·g-1 ,米氏常数K_m为14.98 μmol·L-1,内在代谢清除率CL_int为13.09 mL-1·min-1·g-1。结论 该检测方法快速、专属、灵敏度高,可满足酶动力学检测要求。     

假单胞菌菌株ZL8发酵培养基及发酵条件的优化

目的 课题组前期从猪苓菌核中分离得到对丹参枯萎病等植物病原真菌具有广谱抑制作用且对植物生长有促进作用的假单胞菌菌株ZL8，该研究在此基础上对假单胞菌菌株ZL8的发酵培养基和发酵条件进行优化，以提高单位体积发酵液中菌体数量，为此菌株的开发和应用提供基础。方法 测定ZL8菌株在LB培养基中的生长曲线，明确其在液体培养基中的生长规律；以ZL8菌株发酵液中活菌数、菌体干重和菌悬液A₆₀₀值为检测指标，对不同种类的氮源、碳源及无机盐进行单因素考察以确定最适培养基组分，并进行正交试验优化培养基配比，以筛选最优发酵培养基；对ZL8菌株的接种量、培养温度、时间和转速等4个方面进行单因素和正交试验考察以确定最优培养条件。结果 假单胞菌菌株ZL8的液体发酵最佳培养基为蛋白胨15 g·L^-1、葡萄糖7.5 g·L^-1、氯化钾10 g·L^-1，发酵48 h后，发酵液活菌数可达8.93×10⁹ cfu·mL^-1，为LB液体培养基的3.93倍（P<0.01）；最佳发酵条件为接种量3%、温度28 ℃、时间72 h、转速220 r·min^-1，发酵液中活菌数可达6.37×10¹⁰ cfu·mL^-1。结论 优化后的培养基配方和发酵条件相对LB培养基和初始发酵条件，不仅可有效提高单位体积中假单胞菌ZL8菌株的菌体量及延长菌株生长的稳定期，而且可降低培养基成本，为假单胞菌ZL8的高效发酵和应用提供理论基础。     

电导率法筛选微乳处方及对其相行为的研究

 目的 探讨电导行为结合伪三元相图制备微乳,并对其相行为进行研究。方法 通过电导率-含水量曲线精确绘制聚山梨酯80-labrasol/Gemseal40-油酸 /无水乙醇/水体系不同表面活性剂与助表面活性剂的比例（K_m下一系列伪三元相图,筛选微乳处方,采用电导率、稳定性、染色法、粒径等对微乳基本性能进行评价,研究不同K_m对微乳体系的相行为及结构类型的影响。结果 随着含水量的增加,电导率表现为渐进的连续变化,K_m为2:1时,含水量（20%＜Φ＜66.3%电导率直线上升,含水量（66.3%＜Φ＜74.5%电导率趋势变缓,含水量(Φ＞74.5%时电导率下降,且此时伪三元相图中微乳区最大,制备丹皮酚微乳和雷公藤多苷微乳在高速离心无分层,也无絮凝或药物析出,电导率、染色法、粒径等性能均符合微乳特征。结论 电导率法能用于微乳结构的判定并反映微乳相行为的变化,精确绘制伪三元相图筛选微乳处方。     

龙葵多糖对S180荷瘤小鼠红细胞免疫功能的影响

目的 考察龙葵多糖对 S₁₈₀ 荷瘤小鼠红细胞膜唾液酸 (SA)、过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD) 量的影响。方法 应用试剂盒测定 S₁₈₀ 荷瘤小鼠红细胞膜 SA、CAT、SOD 的量。结果 龙葵多糖能增加 S₁₈₀ 荷瘤小鼠红细胞膜表面 SA、CAT、SOD 的量,其中 SA、CAT 低剂量组作用显著 (P＜0.05),中、高剂量组作用非常显著 (P＜0.01)。而 SOD 高、中、低剂量组的作用都非常显著 (P＜0.01)。结论 龙葵多糖能增强 S₁₈₀ 荷瘤小鼠红细胞的 SA、CAT、SOD 的量,这可能是龙葵多糖抗肿瘤作用机制之一。     

外源H2O2对不同水分条件下垂盆草线粒体稳态、生长及品质的调控作用

目的 为揭示外源H₂O₂叶面预处理对不同水分条件下垂盆草Sedum sarmentosum线粒体稳态、生长和黄酮类成分积累的调控作用。方法 设置4个处理即适宜水分、适宜水分＋1 mmol/L H₂O₂、干旱、干旱＋1 mmol/L H₂O₂处理，测定不同处理垂盆草叶肉细胞超微结构及其线粒体抗氧化系统、垂盆草生长指标、生物量、指标性成分含量及多种体外抗氧化能力。结果 在干旱胁迫条件下外源喷施1 mmol/L H₂O₂可以显著提高垂盆草线粒体超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，显著降低线粒体超氧阴离子产生速率及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，减轻线粒体膜结构破坏。在干旱条件下叶片喷施H₂O₂处理的垂盆草鲜质量和干质量分别比干旱处理提高51.53%和38.78%，总黄酮、总酚含量分别提高13.37%和6.50%，但槲皮素和异鼠李素含量显著低于其他处理。适宜水分条件下喷施H₂O₂处理有利于提高生物量和异鼠李素含量。垂盆草ABTS、DPPH、OH·自由基清除能力与抗脂质过氧化能力均以适宜水分＋喷施H₂O₂处理最高，干旱＋喷施H₂O₂处理次之。结论 喷施1 mmol/L H₂O₂可以缓解干旱胁迫对垂盆草的氧化伤害，维持线粒体稳态，提高垂盆草药材产量和品质，从而协调干旱逆境下垂盆草产量和品质之间的矛盾；适宜水分条件下喷施H₂O₂亦有助于提升垂盆草产量和品质。     

艾纳香黄酮类物质生物合成途径分析

为深入了解艾纳香中黄酮类物质的生物合成途径,提高艾纳香黄酮类活性物质的生物合成量,该课题基于艾纳香的转录组数据,将艾纳香的转录组测序结果同KEGG数据库中其他多种高等植物黄酮类物质生物合成途径的研究结论进行比对,预测出了艾纳香中黄酮类物质可能的代谢途径。研究结果表明,艾纳香在KEGG数据库中比对上2条黄酮类代谢通路,分别是:类黄酮生物合成途径,KEGG编号为ko00941,艾纳香转录组信息中有32条基因与该途径相关;黄酮和黄酮醇的生物合成,KEGG编号为ko00944,艾纳香转录组信息中有12条基因与该途径相关。艾纳香中黄酮类物质的生物合成主要与ko00941途径相关。艾纳香中黄酮类物质的生物合成途径与其他物种的高等植物相似,催化黄酮类物质生物合成的关键酶很可能也是CHS与查耳酮异构酶。艾纳香素是艾纳香中重要的药理活性物质,HCT与艾纳香素的生物合成密切相关。     

忍冬原生质体分离条件研究

目的:探讨忍冬原生质体分离的最佳条件,为忍冬原生质体培养、细胞融合以及遗传转化提供大量优质的原生质体.方法:分别对忍冬原生质体分离过程中的若干影响因子如:酶液组成、酶解方式、酶解时间、酶解温度、渗透压进行比较分析,以确定最佳的分离条件.结果:确定了最优化的忍冬原生质体分离条件,即以生长旺盛的疏松的忍冬愈伤组织作为分离原生质体所需材料,以1.5％纤维素酶+0.25％果胶酶作为分离原生质体所用酶液,以含有0.7 mol·L-1甘露醇作为渗透保护剂的细胞-原生质体清洗液(CPW)溶液进行酶液的配制,于25℃静置条件下酶解12 h.结论:利用该实验所确定的忍冬原生质体最佳分离条件可获得大量优质的原生质体,为后续忍冬细胞融合以及遗传转化等实验奠定良好的实验基础.     

引种栝楼过氧化物同工酶分析

目的: 对国内不同产区栝楼进行种源间亲缘关系的分析。方法: 采用烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术对不同种源栝楼过氧化物同工酶(POD)进行研究。结果: 不同产区栝楼过氧化物同工酶在酶带数、迁移率和酶量等方面存在差异。栝楼POD酶谱共有10条谱带,分为5个类群,Ⅰ,Ⅴ和其他4个类群亲缘关系都较远,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ这3个类群的亲缘关系较近。结论: 过氧化物同工酶谱可以作为不同种源栝楼遗传多样性鉴定的参考依据。     

水分胁迫对猴耳环种子萌发及生理特性的影响

目的通过对猴耳环种子萌发进行人工水分胁迫处理,探讨其对种子萌发过程中生理生化指标的影响。方法分别采用5%、10%、15%、20%聚乙二醇6000(PEG)处理猴耳环种子,测定种子的发芽率、平均发芽速度、发芽指数及萌发过程中细胞膜透性、脯氨酸量、可溶性蛋白量、丙二醛(MDA)量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性的动态变化。结果随着PEG胁迫强度的增加,种子萌发受到明显抑制,发芽率、发芽指数显著降低,提高了平均发芽速度;萌发期间各生理指标均高于对照,细胞膜透性、脯氨酸、MDA量呈上升趋势,可溶性蛋白量呈下降趋势,SOD、POD活性均不同程度地表现为先上升后下降的趋势。结论猴耳环在轻度水分胁迫时,具有一定的耐旱性。     

不同养殖密度和换水频率对蚂蟥生长和内在品质影响的研究

采用生物量测定、3,5-二硝基水杨酸比色法、对-棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法、福林-酚法等方法研究不同养殖密度和换水频率对蚂蟥生长、消化酶活性、生化指标和内在品质的影响。结果表明:蚂蟥的最终质量,特定生长率(SGR),增重率(WGR),淀粉酶,脂肪酶,蛋白酶活力,SOD,CAT,ALP酶活性与密度呈反比,与换水频率呈正比(P0.05);换水频率与水中氨氮、亚硝酸盐和硫化氢呈负相关,与溶氧量呈正相关;养殖密度和换水频率对蚂蟥水分、总灰分、酸不溶性灰分、p H和抗凝血酶活性影响不显著。因此,每亩50万条为较适宜的养殖密度,每72 h 1次为较适宜的换水频率。     

千里光过氧化物酶基因的SSR标记及序列分析

目的研究千里光过氧化物酶(peroxidase,POD)基因结构特征和功能的关系,并根据其核苷酸序列设计SSR引物,进一步验证其在多个千里光地方种中的多态性。方法从千里光全长c DNA文库中分离到POD全长序列,运用系列生物信息学软件进行核苷酸与氨基酸的序列特征分析,分析序列中的SSR位点并对多个千里光品系进行PAGE检测和验证。结果基因具有典型的POD结构特征,表现出高度的保守性。PAGE电泳显示该引物在不同地方品系的千里光中扩增稳定,且存在明显多态性。结论研究结果拓展了对千里光POD基因序列和功能的认识,新开发标记能有效应用于POD基因的检测和育种鉴定,同时也可为其他物种的POD研究提供参考。     

艾纳香萜类物质生物合成途径分析

为了全面了解艾纳香中萜类物质的代谢途径,以及具体的基因和催化酶类,以期为从分子水平调控艾纳香中萜类活性成分提供理论依据。基于艾纳香的转录组数据,将艾纳香的转录组测序结果同KEGG数据库中其他多种高等植物萜类合成途径的研究结论进行比对,预测出艾纳香中萜类代谢的具体途径。结果表明艾纳香在KEGG数据库中比对上4条萜类代谢通路:萜类骨架代谢途径、单萜代谢途径、二萜代谢途径、倍半萜与三萜代谢途径,对应基因的数目分别为103,10,29,59条。通过对催化酶与活性产物进行总结分析,结果显示,单萜活性产物为8种、二萜3种、三萜和倍半萜3种。在萜类代谢途径过程中的关键酶主要为脱氧木酮糖-5-磷酸合酶、HMG-Co A还原酶、烯丙基转移酶系。艾纳香中与单萜类物质合成的酶类相对较少,而产物种类较多,这可能与单萜合酶催化产物的不专一性有关。通过对艾纳香中萜类调控途径的整体分析,并对其中关键酶基因的调控,有望整体提高艾纳香中萜类活性物质的产量。     

狭叶柴胡内参基因筛选及皂苷合成关键酶基因组织表达分析

目的筛选适宜狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium组织表达分析的内参基因,分析柴胡皂苷合成关键酶基因的组织表达模式。方法选取Actin、α-tubulin、β-tubulin、Cyclophilin、EF-1α5个常用的内参基因作为候选,分别使用Delta CT、Best Keeper、Norm Finder、ge Norm软件对各候选内参基因的稳定性进行评价,并对候选内参基因的稳定性进行验证,利用实时荧光定量PCR技术,以筛选得到的内参基因分析狭叶柴胡根、茎、叶、果中柴胡皂苷合成关键酶基因HMGR、IPPI、FPS、SS、β-AS基因的组织表达模式。结果候选内参基因平均表达稳定性由高到低排序为β-tubulinCyclophilinActinEF-1αα-tubulin,β-tubulin是狭叶柴胡基因组织表达分析的适宜内参基因。HMGR基因表达量由高到低为根茎/果叶,IPPI基因表达量由高到低为根茎果叶,FPS基因表达量由高到低为叶根茎果,SS基因表达量由高到低为叶果根茎,β-AS基因表达量高低为叶根果茎,其中HMGR与IPPI及FPS与β-AS基因的表达显著呈正相关(P0.05)。结论筛选得到了狭叶柴胡不同组织基因表达分析的最适内参基因为β-tubulin,为狭叶柴胡基因组织表达分析奠定方法学基础。柴胡皂苷合成关键酶基因有不同的组织表达模式,可能参与调控狭叶柴胡不同组织中柴胡皂苷合成与积累的流向。     

微生物降解对人参自毒作用的缓解效应

连作障碍问题严重制约人参生产及土地资源的合理利用,自毒作用是导致连作障碍的关键因子之一。在前期筛选到人参自毒物质降解菌的基础上,研究采用平板培养法和常规生理生化方法测定人参种子萌发的生物学指标和保护性酶活性,以探究自毒物质降解菌对人参自毒作用的缓解效果。研究发现,除棕榈酸外,自毒物质苯甲酸、邻苯二甲酸二异丁酯、丁二酸二异丁酯和2,2-(4-羟基苯基)丙烷降解液对人参种子生长的毒害作用得到显著缓解,与对照无显著差异。除苯甲酸外,其余自毒物质降解后人参SOD,POD,CAT酶活性均较降解前显著降低。研究结果表明,微生物降解是缓解自毒物质抑制人参种子萌发的有效途径,该发现将有助于人参连作障碍问题的解决。