Smad3D和Smad7重组腺病毒载体的快速构建

目的 简化重组腺病毒载体的构造方法，构建含Smad3DcDNA或Smad7cDNA的重组腺病毒载体，为下一步的基因治疗奠定基础。方法 以AdEasy System为基础，应用序贯化学转化方法，在大肠杆菌E．coli BJ5183体内将携带目的基因的穿梭质粒和骨架质粒重组。结果 成功构建了重组腺病毒载体pAd-Smad3D和pAd-Smad7及空腺病毒载体，并经酶切鉴定证实。结论 用序贯化学转化方法，可以快速高效地在大肠杆菌内构建重组腺病毒载体。     

人FAS启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒靶向杀伤SKBR3乳腺癌细胞的研究

目的:构建脂肪酸合成酶(FAS)启动子驱动下的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)重组腺病毒,研究其对乳腺癌细胞SKBR3的靶向杀伤作用。方法:以AdEasyTM腺病毒系统为载体,构建FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒载体Ad-FAS-TK,将线性化的Ad-FAS-TK在AD-293细胞中包装,经过大量扩增和纯化,得到重组腺病毒。MTT法检测重组腺病毒Ad-FAS-TK与前体药物更昔洛韦(GCV)对SKBR3细胞的靶向杀伤作用。TUNEL法检测细胞凋亡。结果:成功构建FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒载体Ad-FAS-TK,经包装、扩增和纯化得到约1010pfu/ml的重组腺病毒。MTT法和TUNEL检测结果显示,FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒与GCV能够诱导SKBR3细胞凋亡,产生靶向细胞毒作用。结论:FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒联合GCV对SKBR3细胞具有靶向杀伤作用,FAS启动子可以作为肿瘤靶向基因治疗的工具。     

重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2的构建及病毒滴度测定

目的:构建重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2,并测定病毒滴度.方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列.将测序正确的片段用Bgl II和Pme I双酶切定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中.通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,TCID50法测定重组腺病毒滴度.结果:成功构建出表达hIL-2基因的重组腺病毒载体(pAdBM5-GFP-hIL-2),获得了高滴度表达hIL-2基因的重组腺病毒.结论:重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-hIL-2)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肝癌的转基因治疗研究.     

人FAS启动子驱动的HSV—TK重组腺病毒靶向杀伤SKBR3乳腺癌细胞的研究

目的：构建脂肪酸合成酶（FAS）启动子驱动下的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）重组腺病毒，研究其对乳腺癌细胞SKBR3的靶向杀伤作用。方法：以AdEasy^TM腺病毒系统为载体，构建FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒载体Ad—FAS—TK，将线性化的Ad—FAS—TK在AD-293细胞中包装，经过大量扩增和纯化，得到重组腺病毒。M1Tr法检测重组腺病毒Ad—FAS—TK与前体药物更昔洛韦（GCV）对SKBR3细胞的靶向杀伤作用。TUNEL法检测细胞凋亡。结果：成功构建FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒载体Ad—FAS—TK，经包装、扩增和纯化得到约10^10pfu／ml的重组腺病毒。MTT法和TUNEL检测结果显示，FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒与GCV能够诱导SKBR3细胞凋亡，产生靶向细胞毒作用。结论：FAS启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒联合GCV对SKBR3细胞具有靶向杀伤作用，FAS启动子可以作为肿瘤靶向基因治疗的工具。     

腺病毒介导靶向碱性成纤维细胞生长因子siRNA载体的构建及鉴定北大核心CSCD

目的构建一种高效"沉默"碱性成纤维细胞生长因子的小干扰RNA重组腺病毒载体,并为该载体在基因研究中提供相关资料。方法设计、合成优选的靶向bFGF特异性siRNA序列。采用限制性内切酶消化和T4 DNA连接酶连接的方法,将bFGF-siRNA序列克隆至腺病毒穿梭质粒pGStrack上,然后将重组穿梭质粒pGStrack-bFGF-siRNA和腺病毒骨架质粒pGSadeno体外LR位点进行特异性重组,将bFGF-siRNA基因转移至腺病毒骨架质粒pGSadeno上,最后重组骨架质粒pGSadeno-bFGF-siRNA。鉴定正确后经Pac Ⅰ酶切,转染HEK 293细胞,包装成重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA。同时在HEK 293细胞中进行病毒扩增,利用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用微量全细胞病变法检测腺病毒滴度,用Western blot方法验证所构建载体作用效果。结果 PCR鉴定重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA构建成功;扩增后检测腺病毒滴度约为5×108 PFU/ml,Western blot结果显示目的基因蛋白沉默效率大于90%。结论应用LR重组法能成功构建携带靶向bFGF基因的siRNA重组腺病毒,该载体转染胶质瘤U251细胞株后目的基因蛋白沉默效率较高,为进一步的相关研究奠定可靠的基础。     

一种新的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP的构建

 目的 构建表达小鼠甲胎蛋白（murine alpha fetoprotein，mAFP）基因的重组腺病毒载体pAd—BM5-GFP-mAFP，并测定其滴度。方法 从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增mAFP基因，测序确认后，插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，双酶切鉴定重组腺病毒载体。线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞，通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因，并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒，用TCBn法测定重组腺病毒滴度。结果 成功克隆了小鼠mAFP基因，构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP，获得了表达mAFP基因的重组腺病毒，病毒滴度达3．2×10^8PFU／ml。结论 本研究成功构建了pAdBM5-GFP-mAFP载体，获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒，为进一步开展肝癌的免疫基因治疗奠定了基础。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的重组腺病毒载体，为进一步研究GM-CSF基因在肿瘤基因治疗中的应用提供实验基础。方法：采用PCR方法，从重组质粒pcDNA3．1-GM-CSF扩增出GM-CSF基因片段，通过穿梭质粒pShuttle，将带有CMV启动子的目的片段克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA，通过脂质体转染HEK293细胞，经包装扩增后，获得重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF，PCR鉴定，ELISA法检测表达产物。结果：含GM-CSF基因的重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF构建成功，经PCR鉴定和DNA测序等证实了其正确性，重组腺病毒上清液中GM-CSF表达量达26ng／mL。结论：含GM-CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

腺病毒介导的HBsAg基因修饰树突状细胞瘤苗的制备

目的:构建含人HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法:将HBsAg基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-S。用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成pAdeno-S重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno-S体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后Westernblot法检测其表达,流式细胞仪检测其能否诱导树突状细胞凋亡。结果:酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HBsAg基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HBsAg基因感染树突状细胞,经Westernblot法鉴定证实能够表达转染基因,并且不会诱导树突状细胞凋亡。结论:构建成功的含HBsAg腺病毒载体可以在树突状细胞中表达HBsAg,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白和人类血管内皮生长因子的shRNA重组腺病毒的构建与鉴定

 【摘要】　目的　构建表达绿色荧光蛋白（GFP）和人类血管内皮生长因子（VEGF）的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对人类鼻咽癌细胞系CNE的感染效果。方法　使用基因工程技术将GFP和人类VEGF siRNA的cDNA通过LR法体外同源重组从质粒载体pGenesil-1上转移至pGSadeno腺病毒表达载体上,得到腺病毒载体pGSadeno-GFP-VEGF,将PacI线性化的腺病毒DNA转染HEK293细胞,并在其中包装扩增腺病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所携带的GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对CNE细胞感染效率的检测。结果　酶切鉴定及PCR结果证明GFP-VEGF shRNA重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达到2×109 PFU／ml,对CNE有较强的感染能力,感染腺病毒后CNE细胞的增殖速率明显下降。结论　应用体外同源重组方法成功构建了表达GFP和VEGF shRNA的重组腺病毒载体。     

SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体的构建及检测

目的构建携带融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc(SLC-HP-Fc)的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc表达载体。方法提取SLC-HP基因及含Fc段基因的质粒构建携带目的基因的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMVSLC-HP-Fc,经酶切线性化后转入含有pAdEasy-1质粒的E.coli BJ5183中进行同源重组,得到重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc。线性化后的病毒表达载体通过脂质体Lipofectamine 2000转染293细胞,通过包装扩增并经PCR鉴定后得到大量复制病毒并纯化保存。结果得到重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc,成功转染293细胞出现细胞病变反应,经酶切及PCR法确定目的基因的表达。结论成功构建了SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体,并建立了重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc种子病毒库和工作病毒库,为进一步研究该融合基因与肿瘤相关作用奠定了实验基础。