血小板生成素的研究进展

生成血小板的巨核细胞是从骨髓造血干细胞分化发育来的。造血干细胞首先分化生成巨核系祖细胞,即巨核系集落形成单位。祖细胞阶段的细胞核内的DNA一般是2—8倍体,当祖细胞是2倍体或4倍体时具有增殖能力,这也是巨核细胞系可以增加细胞数量的唯一阶段。巨核系祖细胞继续向前分化成为具有8-32倍体的巨核细胞,并进一步成熟后分裂     

采用多功能流式细胞术分析分选造血干细胞和髓系定向分化祖细胞

目的 探讨富集纯化造血干细胞(HSC)和髓系定向分化祖细胞的新实验方案.方法 根据造血干细胞和定向分化祖细胞在发育过程中表达某些特异性分化抗原的特性,通过免疫磁珠分选技术结合四色和六色流式细胞术分析14只健康小鼠的骨髓造血干细胞、造血祖细胞及定向分化祖细胞系列的表达,并对其进行分选,以进一步通过集落细胞培养和传代试验对分选后细胞的活性进行检测.结果 经上述实验方案分析,14只健康小鼠骨髓造血祖细胞(HPC)的表达率约为HSC的10倍;但其牛成活性远不如造血干细胞,共同髓系祖细胞(CMP)的传代能力仅为HSC的1/2,且次级分化的粒系单核系祖细胞(GMP)和红系巨核系祖细胞(MEP)的生成活性更弱,其传代次数为零.结论 通过多色流式细胞术实验方案可以分析纯化HSC和髓系定向分化祖细胞的表达,并精确计数HSC和祖细胞.     

造血干/祖细胞体外大规模定向诱导分化及其临床应用前景

体外利用细胞培养技术和不同的细胞因子组合可将造血干细胞定向分化为中性粒细胞、红细胞、巨核细胞以及树突状细胞等细胞成分,利用这一特性可望在体外开发可应用于临床的造血细胞工程产品。本文就造血干/祖细胞体外定向诱导分化的细胞产品及其临床应用的前景进行综述。     

造血干／祖细胞体外大规模定向诱导分化及其临床应用前景

体外利用细胞培养技术和不同的细胞因子组合可将造血干细胞定向分化为中性粒细胞、红细胞、巨核细胞以及树突状细胞等细胞成分，利用这一特性可望在体外开发可应用于临床的造血细胞工程产品。本文就造血干／祖细胞体外定向诱导分化的细胞产品及其临床应用的前景进行综述。     

microRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达

为进一步探讨microRNA（miRNA）在造血调控中的作用奠定基础,比较了miRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达。从人脐血中分离单个核细胞（MNC）,应用FACSVantage分选流式细胞仪分选CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞;抽提miRNA后与miRNA芯片杂交,应用生物信息学技术分析miRNA芯片的表达结果。结果发现,miRNA在人脐血CD34^＋CD38^＋细胞的表达水平比在CD34^＋CD38^-细胞的表达水平降低至1／2以下者共11个,表达水平升高至2倍以上者共73个,以上84个miRNA被称为“干细胞性”miRNA。经比较Georgantas等和芯片表达结果,发现有12个（14、29％,12／84）相同的miRNA。部分miRNA经历了类似于CD34在造血细胞表面的发展历程。应用生物信息学技术可寻找到新的与造血调控相关的miRNA簇及miRNA的下游靶基因。结论：“干细胞性”miRNA在正常造血中发挥着重要作用,即miRNA的系统表达模式一造血干／祖细胞基因表达谱一造血干／祖细胞的自我更新和系列定向分化。     

脐血干细胞向巨核细胞分化后信号转导基因的表达

背景:造血干细胞具有多向分化的潜能,在合适的造血生长因子和系特异性生长因子的诱导下,可分化成巨核细胞。在体外诱导CD34~ 造血干细胞向巨核细胞分化可导致许多基因尤其是信号转导基因表达的变化。目的:观察脐血干细胞向巨核细胞分化后信号转导基因的表达,拟从基因水平验证其对巨核细胞分化发育的调控。设计:开放性实验。单位:福建省肿瘤医院肿瘤免疫学研究室。材料:无菌条件下应用血袋采集法收集足月正常分娩的胎儿脐带血60～145 mL,产妇及家属自愿捐献。VarioMACS免疫磁性吸附柱分离装置,CD34 Isolation Kit;SCGM无血清培养基;CD单抗;细胞因子。人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片V2.0;LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪。实验经医院伦理委员会批准。方法:实验于2005-07/2006-06在福建省肿瘤医院肿瘤免疫研究室及北京博奥生物芯片有限公司完成。分别收集同一份脐血分化培养前CD34~ 细胞和培养后CD41~ 细胞,提取总RNA。逆转录合成和纯化cDNA探针,以Cy3-dCTP标记培养前CD34~ 细胞,以Cy5-dCTP标记培养后CD41~ 细胞标记的DNA溶于30μL杂交液中,42℃过夜。主要观察指标:应用基因芯片技术比较造血干细胞与分化的巨核细胞信号转导相关的基因表达差异。根据基因芯片结果,选定17个表达差异基因用RT-PCR作进一步验证。结果:芯片分析结果显示,共筛选出3522个差异基因,其中上调基因1705个,下调基因1817个。3522个差异基因中,与细胞信号相关的基因有343个,与转录调节相关的有150个,与分化相关的有21个。其中,CD61基因的表达增加了369.83倍,CD41基因的表达增加27.38倍,PF4基因的表达增加24.06倍;促分裂原活化蛋白澈酶s、G蛋白偶联受体、RAS家族相关的基因多数表达上调;与STAT通路相关的基因中,SOCS1、JANUS激酶表达上调,STAT5A表达下调。对选定的17个表达差异基因用RT-PCR作进一步验证,以GAPDH为内对照,结果与芯片检测完全一致。结论:血小板生成素等造血生长因子可能主要通过G蛋白偶联受体-Ras-促分裂原活化蛋白激酶途径,促进脐血干细胞向巨核细胞系增殖、分化。     

具有造血能力的肌源性干细胞的研究进展

肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSC)是具有多胚层分化潜能和自我更新能力的成体干细胞群,在造血微环境的诱导下可分化为造血细胞,其造血能力是骨髓造血干细胞的10-14倍,有望成为替代造血干细胞治疗某些骨髓疾患或肿瘤的备选干细胞之一,但在造血微环境下MDSC向造血细胞转化的机制还不十分清晰。MDSC与造血干细胞在生物学特性、蛋白表达和细胞增殖方面有明显差别。此外,MDSC中存在不同分化潜能的干细胞群,但其中具有造血分化潜能较少,而且与造血干细胞起源是否相同还有待进一步研究。本文主要就MDSC中有造血分化潜能的细胞群的分子表型、MDSC与造血干细胞区别、MDSC的起源及其应用前景做一综述。     

转录因子GATA-3在T细胞发育过程中的作用

脊椎动物的造血是一个极其复杂的过程。机体内多能造血干细胞的相关基因在各种不同转录因子的参与下通过诱导或沉默其表达从而促使造血干细胞向各系细胞分化与成熟。GATA-3属Ⅳ型锌指蛋白GATA家族,是辅助性T细胞(Th2)特异性转录因子,它不但直接参与T淋巴细胞的分化调控,诱导Th2细胞的生成,亦可通过直接或间接作用参与红细胞、巨核细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞的分化调控,同时对CD8+T淋巴细胞分化成熟产生抑制作用。     

造血干细胞与造血相关调控信号通路

人体内所有的血细胞都来自造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)的定向分化.HSC又称多能干细胞,是存在于造血组织中的一群原始造血细胞,有两个重要特性:1)高度的自我更新或自我复制能力;(2)可定向分化、增殖为不同的血细胞系,并进一步生成血细胞.     

转录因子GATA-3在T细胞发育过程中的作用

脊椎动物的造血是一个极其复杂的过程。机体内多能造血干细胞的相关基因在各种不同转录因子的参与下通过诱导或沉默其表达从而促使造血干细胞向各系细胞分化与成熟。GATA-3属Ⅳ型锌指蛋白GATA家族，是辅助性T细胞(Th2)特异性转录因子，它不但直接参与T淋巴细胞的分化调控，诱导Th2细胞的生成，亦可通过直接或间接作用参与红细胞、巨核细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞的分化调控，同时对CD8 T淋巴细胞分化成熟产生抑制作用。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。②S组：基质细胞＋单个核细胞。③SF组：基质细胞＋干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞数以及集落形成单位数。结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133＋细胞/有核细胞、CD34＋细胞/有核细胞、CD133＋CD34＋细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及对脐血CD34~＋细胞的扩增作用

背景：Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3配体）是一种重要的生长因子,通过激活特定的酪氨酸激酶受体,调控造血细胞的生长、生存和/或分化,具有促进造血干细胞体外扩增的应用潜力。目的：构建pET32a（＋）-hFLext原核表达载体,表达、纯化hFLext蛋白,观察其对脐血CD34＋细胞的扩增作用。方法：克隆hFLext,构建pET32a（＋）-hFLext重组表达载体。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白。磁珠分选脐血CD34＋细胞,单独加入hFLext或联合干细胞因子、血小板生成素孵育1周,观察体外扩增作用。结果与结论：成功克隆hFLext,并构建了pET32a（＋）-hFLext重组表达载体。在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hFLext融合蛋白,经8mol/L尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白。Trx-hFLext融合蛋白不仅具有维持及轻度刺激CD34＋细胞体外扩增的作用,并且与干细胞因子及血小板生成素具有协同作用,为造血干/祖细胞体外扩增研究奠定了基础。     

预判急性白血病患者Auto—PBSCT动员、采集效果影响因素的临床研究

目的：探讨急性白血病患者外周血干细胞动员、采集的效率及影响因素。方法对37例急性白血病患者经化疗＋生长因子动员,动员第5～10天,当外周血WBC＞5×109/L,CD34＋＞20个/μl时,使用CS-3000 Plus血细胞分离机（Baxter公司）进行外周血干细胞采集;采集前外周血WBC分类单个核细胞（MNC,包括幼稚细胞、淋巴细胞及单核细胞）,计算MNC%×WBC计数＞（4～6）×109/L预计需要采集循环血容量。分析不同化疗动员时机、疾病、年龄、性别的动员采集,并对采集前外周血进行白细胞计数、分类以及干细胞采集物进行WBC计数、分类和CD34＋检测。结果所有患者均成功动员和采集到了外周血干细胞（MNC＞6×108/kg,CD34＋＞2×106/kg）,并成功造血重建。急性髓细胞白血病患者采集所获得的 MNC 与急性淋巴细胞白血病患者采集获得无明显差异;但急性淋巴细胞白血病患者采集获得CD34＋细胞明显较多（P＝0.015）;动员时机的化疗病程与采集物的CD34＋细胞呈负相关,动员时机≤3个疗程与≥6个疗程比较,前者CD34＋细胞明显较好,具有统计学差异（P＝0.028）;外周血MNC数值与采集物MNC及CD34＋细胞具有相关性（r＝0.600,P＝0.00;r＝0.510,P＝0.001）。结论根据不同的疾病、性别、年龄,采用不同的动员采集方案,一般可以成功采集。外周血 MNC 数值对采集物中 CD34＋细胞的总量具有一定预测意义。     

肝癌干细胞分离及其细胞生物学特性

背景：正常干细胞和肿瘤干细胞在基因表达和依赖的细胞信号通路上应该存在不同,如何发现能选择性杀伤肿瘤干细胞的治疗手段是一个仍然需要大量研究的课题。目的：分离人肝癌细胞系肿瘤干细胞MHCC97,分析其细胞生物学特性。方法：采用流式细胞技术在人高转移肝癌细胞系 MHCC97中筛选肿瘤干细胞,分离正常人肝脏干细胞CD133-CD34-MHCC97和人肝癌细胞系肿瘤干细胞CD133＋CD34＋MHCC97,分别检测其表型、生长曲线、细胞周期和多系分化能力。结果与结论：人肝癌细胞系 CD133＋CD34＋ MHCC97肿瘤干细胞的表型为 CD133＋CD34＋,人肝癌细胞系CD133＋CD34＋ MHCC97具有与CD133-CD34- MHCC97相似的细胞曲线和生长周期,可以向上皮和内皮细胞分化,并表达相应特异性的分子标志。提示人肝癌细胞系中 CD133＋CD34＋MHCC97细胞具有肿瘤干细胞的特性,可以向内皮和上皮细胞分化,同时具有肿瘤干细胞的生物学特性,是肿瘤复发转移的根源,也是临床治疗的靶点。     

CD271和CD133果真能用于脐血间充质干细胞阳性分选吗?

众多研究表明,脐血中存在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC),且脐血获得过程简单,对供者没有损伤,因此可以作为MSC的另一个来源,但脐血间充质干细胞含量极少。本研究探讨CD271和CD133免疫磁珠阳性分选是否也能富集脐血中数量极少的MSC。采用免疫磁珠阳性分选方法从脐血单个核细胞(UCB-MNC)中分离得到CD271+、CD271-、CD133+和CD133-4种细胞;将得到的细胞分别进行培养,以未分选的UCB-MNC为对照,观察各组细胞成纤维细胞集落(CFU-F)形成能力;利用流式细胞术、成骨及成脂肪定向诱导分化对MSC进行鉴定。结果表明:CD271和CD133阳性细胞纯度均达85%,但是CD271+细胞中(99.76±0.08)%表达CD45,(6.24±0.03)%表达CD34,而CD133+细胞99%以上都表达CD34和CD45。阳性细胞培养可见单个成纤维样细胞贴壁生长,但不能形成集落并融合,两种阴性细胞中部分标本(约27%)可形成集落,并能融合传代,与对照组(UCB-MNC)培养成功率相似。将两种阴性细胞培养得到的MSC培养至第3代,表型测定基本一致,即CD34-、CD45-、CD14-、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+,而且具有成骨、成脂肪分化潜能。结论:CD271和CD133不是完全重合的一群细胞,但绝大多数为造血细胞,不能有效的用以扩增MSC。阴性细胞培养成功率与传统贴壁法相似,说明MSC多存在于CD271和CD133阴性细胞中。     

粒细胞集落刺激因子/粒-巨噬细胞集落刺激因子联合动员异基因造血干细胞移植

背景：目前FDA已批准应用于临床外周血造血干细胞移植的动员剂只有粒细胞集落刺激因子和粒-巨噬细胞集落刺激因子,其中粒细胞集落刺激因子单药应用是目前最主要的动员方案,但可引起供者骨骼肌肉酸痛、发热等不良反应。目的：回顾性分析以粒细胞集落刺激因子/粒-巨噬细胞集落刺激因子联合应用为动员方案的异基因造血干细胞移植临床效果。方法：选择2004-01/2009-10河南省人民医院血液科以粒细胞集落刺激因子与粒-巨噬细胞集落刺激因子联合应用为动员方案进行血缘全相合异基因造血干细胞移植51例,分析移植物成分、造血重建及移植物抗宿主病的发生率。结果与结论：动员96h后CD34＋细胞占单个核细胞的比例为（0.97±0.13）%,CD34＋CD38-细胞占CD34＋细胞的比例为（37.49±4.03）%;移植后的快速造血重建与CD34＋细胞、CD34＋CD38-细胞输入量呈负相关。Ⅰ度、Ⅱ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病的发生率分别为25.5%,15.7%;局限性、广泛性慢性移植物抗宿主病的发生率分别为39.2%,21.2%。提示在血缘全相合异基因造血干细胞移植中,粒细胞集落刺激因子/粒-巨噬细胞集落刺激因子联合可有效实现干细胞动员,所获CD34＋细胞完全可以满足快速造血重建的需要;输入较多的CD34＋细胞、CD34＋CD38-细胞可能利于快速造血重建。     

Puma表达下调对人脐血CD34+造血细胞抗放射作用的初步研究

Puma属于BCL-2家族中BH3-only亚家族,动物和细胞研究发现其通过p53依赖和非依赖途径诱导细胞凋亡,并具有抗放射保护不增加肿瘤发生率的作用。本研究检测Puma基因敲降后对人脐血CD34＋造血干祖细胞生物学功能的影响。应用RT-PCR、WesternBlot检测Puma基因在辐射刺激条件下的表达,采用慢病毒感染人脐血CD34＋细胞分选GFP＋细胞,AnnexinV-PE／7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡,Ki67染色检测细胞周期,CCK-8、Brdu标记法检测细胞增殖能力,并进行集落形成实验（colony formig cell assay,CFC）。结果表明：Puma基因表达量随着射线强度的增加而增高,Puma基因表达下调抑制造血祖细胞体外集落形成能力和体外增殖能力。在辐射刺激条件下,抑制Puma基因表达可以减少人脐血CD34＋细胞凋亡,维持细胞周期于G0期。结论：人脐血CD34＋造血干细胞中Puma基因敲降具有-定的抗辐射作用,维持细胞于静息状态。     

-80℃下不同冻存时间对脐血造血干细胞保存效果的影响

目的探讨-80℃下不同冻存时间对脐血造血干细胞保存效果的影响。方法对-80℃下分别冻存1、2、3、4、8、16、32 w的脐血细胞进行复苏,比较各组间有核细胞数、CD34^＋数和台盼蓝拒染率的差异。结果脐血细胞在-80℃下保存1、2、3、4、8 w后,各组的有核细胞数和CD34^＋数的差异无统计学意义,而在冻存16、32 w后较1 w的差异有统计学意义（P〈0.05）。台盼蓝拒染率在8、16、32 w较1 w的差异均有统计学意义（P〈0.05）,1、2、3、4 w各组间的差异无统计学意义。结论-80℃直接冻存对于短期（〈8 w）脐血细胞的活性（有核细胞数、CD34^＋数和台盼蓝拒染率）无明显影响,但对于需要长期保存的脐血细胞的效果有影响。     

人脐血间充质干细胞的体外成骨

背景：用免疫细胞阴性筛选法可以排除造血干细胞对于间充质干细胞生长的影响,较快的获得具有表达间充质干细胞的细胞群。目的：探讨人脐静脉血间充质干细胞向成骨样细胞分化的能力。方法：用免疫磁珠阳性筛选法分离脐血间充质干细胞后进行培养。取P2代细胞行成骨诱导分化。结果与结论：人脐血间充质干细胞贴壁生长,长梭形,3周长满瓶底,传代后细胞增殖迅速。细胞表型为高表达CD44＋,CD29＋和CD166＋。在成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,Von-Kossa染色提示钙化结节形成。提示脐血间充质干细胞能够在体外分化为成骨样细胞。