豚鼠环磷酰胺预处理后再免疫对其ABR阈值的影响

目的建制一高阳性率、可供圆窗给药治疗内耳病研究用的自身免疫性内耳病动物模型。方法采用270—370g重的白色红目豚鼠97只作为实验对象，其中32只用于制备粗制内耳抗原，47只经环磷酰胺腹腔注射预处理2d后，再用粗制内耳抗原行皮内多点接种。动物于接种后4、6、8、10、12、14、20d(分别为6、7、7、6、9,6、6只)接受听性脑干反应(ABR)检测。正常对照18只，组1(12只动物)不行任何处理，组2(6只动物)仅行环磷酰胺预处理，不行粗制内耳抗原接种。结果实验组动物接种后4d时ABR阈值升高10dB以上者为67％，8d时为86％．14d时仍为58％，接种后20d时所有动物ABR阈值恢复正常。结论将豚鼠用环磷酰胺预处理后，用粗制同种异体内耳抗原只需单次接种即可建立听力损害发生率高的自身免疫性内耳病动物模型。     

同种异体内耳组织免疫后豚鼠内耳形态学变化

目的建立一高阳性率、可供圆窗给药治疗内耳病研究用的自身免疫性内耳病动物模型。方法实验动物为86只豚鼠,其中32只用于制备粗制内耳抗原。其余动物随机分为实验组42只,对照组1、2各6只。将实验组动物腹腔注射环磷酰胺进行预处理,2d后用粗制内耳抗原行皮下多点接种,分别于接种后4、6、8、10、12、14、20d时用光镜观察动物内耳形态学变化,并检测其血清中IgG、IgM、C3、CH50、循环免疫复合物(CIC)水平。对照组1不行任何处理,对照组2不接种内耳抗原,余同试验组。结果接种后豚鼠耳蜗、前庭、内淋巴囊等部位出现以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,尤以前庭阶、鼓阶、螺旋神经节区域及耳蜗底圈等部位为重。接种后4d时,67%动物内耳有炎性细胞浸润;8~12d时,100%动物出现炎性细胞浸润;接种14d后,炎性细胞浸润明显减少。接种6~14d时,内耳尚有血管周围炎、螺旋神经节细胞变性、内淋巴积水等改变。结论将豚鼠采用环磷酰胺预处理及同种异体内耳抗原接种,可建立一高阳性率的自身免疫性内耳病动物模型。     

环磷酰胺对豚鼠自身免疫性感音神经性聋听功能的影响

目的探讨环磷酰胺在制备豚鼠自身免疫性耳聋动物模型中的作用。方法白色红目豚鼠30只,配对设计分成3组各10只。实验组豚鼠腹腔注射环磷酰胺(150mg/kg)进行预处理,2 d后,每只豚鼠将粗制内耳抗原(crude in-ner ear antigens,CIEAgs)400μg·(0.2ml)-1加等量完全弗氏佐剂进行后足垫、背部皮内多点注射免疫;对照1组用CIEAgs 400μg·(0.2ml)-1加等量完全弗氏佐剂免疫动物;对照2组仅行环磷酰胺预处理。所有动物免疫前、免疫后7、14、21d,接受听性脑干诱发电位(auditory brain-stem response,ABR)检测。结果免疫前所有豚鼠ABR反应阈均值为29.50±5.56dBSPL,免疫后7天实验组、对照1及对照2组ABR反应阈分别为52.50±12.72、36.50±11.25、31.50±3.37;免疫后14天时三组反应域分别为58.50±14.79、33.25±8.93、30.50±3.69 dBSPL;免疫后21天分别为46.25±12.45、30.00±4.29、30.00±3.33 dBSPL。免疫后,实验组动物各时间段反应阈高于对照1,2组(P<0.01)。免疫前后组内比较,实验组免疫后7天、14天、21天反应域高于实验前(P<0.01);对照1组仅免疫后7天高于免疫前(P<0.05),14天、21天与免疫前相比差异无显著性,对照2组各时间段与免疫前相比差异均无显著性。结论将豚鼠用环磷酰胺进行预处理,可以显著提高粗制内耳抗原建立自身免疫性耳聋动物模型的成功率,并显著提高其ABR阈值,而环磷酰胺本身对豚鼠内耳听力没有显著影响。     

含抗内耳抗原特异性抗体的体液转移免疫致豚鼠先天性感音神经性聋的实验研究

目的：证实针对内耳组织抗原特异性抗体通过胎盘可造成子鼠先天性自身免疫性感音神经性聋。方法：同种粗制内耳抗原（CIEAgs）免疫豚鼠，造成自身免疫性感音神经性聋（ASNHL）动物模型。ELISA法测定示其血清抗体水平升高，耳蜗电图（ECochG）示其听神经复合动作电位和（或）耳蜗微音器电位阈值或伪阈升高。取其血清（含特异性抗内耳组织抗原抗体）持续转移免疫妊娠豚鼠，采用ECochG测试被动免疫妊娠母鼠和子鼠的听觉功能，再采用颞骨火棉胶切片和苏木精一伊红染色，光镜观察内耳组织形态学改变。结果：各组出现听觉损伤的动物是：采用ASNHL模型动物血清被动免疫的8只妊娠母鼠中有5只（7耳）和其所产子鼠8只中有6只（10耳），采用非ASNHL模型动物血清免疫的妊娠豚鼠所产子鼠5只中有1只（2耳）。出现听力损失的被动免疫母鼠和子鼠内耳病理形态学改变主要为螺旋神经节细胞变性和Rosenthal管中炎性细胞（以单个核细胞为主）浸润，部分动物出现膜迷路积水。结论：同种体液转移免疫可造成自身免疫性内耳病变，子鼠产生听觉功能障碍主要是由于母鼠所产生的特异性抗内耳组织抗原抗体经胎盘到达子鼠体内所致。     

Math1基因内耳导入后噪声性聋豚鼠听功能改变观察

目的观察Math1基因内耳导入对噪声性聋豚鼠听功能的影响,探讨Math1基因过表达对噪声损伤耳蜗的生物学效应,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法经脉冲噪声致聋的豚鼠45只（各频率ABR阈值均≥95dB SPL）,雌雄不限,实验开始时体草250～300g。随机分为3组：Ad—Math1-EGFP组（30只）;Ad—EGFP组（5只）;空白组（10只）。各组豚鼠在基因转导后4周、8周分别测试双耳ABR。测试完毕后处死动物,观察听泡及耳蜗尤炎性病变者记录听阈结果。结果Math1导入后4周,导入耳各频率ABR阈值低于对照耳（右耳）,也低于Ad—EGFP组及空内组,平均达到85dBSPL。Math1导入后8周,导入耳各频率ABR阂值低于对照耳（右耳）,也低于Ad—EGFP组及空白组,与4周时比较,进一步好转,平均达到75dB SPL。结论Math1基因内耳导入可使噪声导致全聋的豚鼠听功能部分恢复,为噪声性聋的治疗打开了新的思路和手段。     

实验性自身免疫性内耳疾病

取体重250～350克、耳廓反射正常的缝康、年轻豚鼠25只,分成两组,试验组15只,对照组10只。应用粗制、同种豚鼠的内耳抗原得到内淋巴积水、血管炎及内淋巴囊轻度细胞浸润等很明确的自身免疫性内耳疾病的动物模型。通过电生理、组织学和免疫荧光检查来研究内耳在功能、解剖和免疫学方面的变化。结果发现:在电生理方面,听阈提高10dB以上者有5耳(5/25)占20％,听诱发反应的阈     

电钻噪声对豚鼠内耳功能和形态影响的实验研究

目的：观察耳科电钻噪声对豚鼠内耳功能的形态的影响,并探讨电钻噪声对内耳的损伤机制。方法：应用听性脑干反应（ABR）记录技术评价电钻噪声在不同时间暴露前后豚鼠听功能的变化。电钻噪声对豚鼠Corti器超微结构及组织化学的影响,采用定量组织化学技术测定豚鼠耳蜗外毛细胞（OHC）的琥珀酸脱氢酶（SDH）显色的灰度值,比较电钻噪声暴露前、暴露后6小时、1天、7天和15天时OHC的SDH的活性变化,并在光镜下观察耳蜗改变的情况。应用扫描电镜观察电钻噪声暴露后即刻(2h内）、1天、7天和15天豚鼠Corti器的超微结构改变。将豚鼠耳后切口置于电钻噪声连续暴露30分钟和60分。结果：听功能检测结果显示电钻噪声暴露后各组动物ABR值、潜伏期和波间期较正常时略有升高,但无明显差异（P＞0．05）。组织化学观察显示：电钻噪声连续60分钟暴露后各组动物耳蜗OHC和SDH显色灰度值与正常对照组和空白对照组无明显差异（P＞0．05）。扫描电镜观察发现各组动物耳蜗受损区域分布于外毛细胞第三排,尤以底转区和第二转明显,主要的病理变化有OHE纤毛轻蔗散乱,倒伏、融合及个别脱落。结论：说明耳科电钻就当前临床应用的强度,应用时间范围内来说,电钻噪声还未达到使其内耳超微结构损失的程度而造成内耳功能的改变。     

模拟风洞噪声对豚鼠听功能及内耳细胞凋亡的影响

目的探讨模拟风洞噪声对豚鼠听功能及其内耳毛细胞、螺旋神经节细胞凋亡的影响。方法 24只豚鼠随机分为对照组(6只)及实验组(18只),实验组豚鼠暴露于模拟风洞噪声环境中,分别于模拟风洞噪声暴露前(Pr)、暴露1天(E1)、3天(E3)、7天(E7)、暴露后3天(R3)、7天(R7)检测其双耳听性脑干反应(ABR)阈值,并于噪声暴露3天(E3)、7天(E7)及暴露后7天(R7)取实验动物耳蜗行连续冰冻切片,免疫组织化学染色观察Caspase-3在内耳毛细胞及螺旋神经节细胞中的表达。结果实验组动物各时间点ABR阈值:噪声暴露1天(E1)(35.73±8.11dB SPL)、3天(E3)(43.91±6.32dB SPL)、7天(E7)(53.18±6.28dB SPL)的ABR反应阈较噪声暴露前(22.50±5.98dB SPL)明显增高(P<0.01),且暴露时间越长增高越明显。噪声暴露后3天(R3)(46.40±11.59dBSPL)ABR反应阈较噪声暴露7天(E7)(53.18±6.28dB SPL)有降低(P<0.05),噪声暴露后7天(R7)(35.38±11.63dB SPL)ABR反应阈较噪声暴露后3天(R3)(46.40±11.59dB SPL)进一步降低(P<0.01)。豚鼠内耳免疫组织化学观察凋亡标志物Caspase-3结果显示,模拟风洞噪声暴露引起豚鼠内耳螺旋神经节细胞及毛细胞中Caspase-3表达较正常对照组明显增高,且于噪声暴露7天(E7)达最高,暴露后7天(R7)后豚鼠内耳Caspase-3的表达较前明显减少。结论模拟风洞噪声可致豚鼠听功能的损伤,损伤程度在一段时间内与噪声暴露累积量呈正相关。噪声暴露结束后,听功能可部分恢复。同时,内耳凋亡标志物Caspase-3的表达和听功能呈现相同趋势。     

急性次声波暴露后豚鼠位听功能及内耳超微结构的变化

目的观察次声波对豚鼠位听功能和内耳超微结构的影响。方法将豚鼠置于频率8Hz、声压级135dBSPL的次声声场中连续暴露90min。应用正弦摆动试验(sinusoidalpendulartest,SPT)、听性脑干反应（auditorybrainstemresponse,ABR）和畸变产物耳声发射(distortionproductionotoacousticemission,DPOAE)评价次声波暴露前后豚鼠前庭功能和听功能的变化,扫描电镜观察豚鼠内耳各结构表面超微形态的变化。结果次声波暴露后不同时间正弦摆动诱发的豚鼠前庭性眼震的最大慢相速度(slow-phasevelocity,SPV)和频率较次声暴露前轻微降低,但无显著性意义(P>0.05)。次声波暴露后各组动物ABR阈值较正常时略有升高,亦无统计学差异(P>0.05),各组动物ABR各波潜伏期和波间期与次声暴露前比较差异均无显著性(P>0.05);DPOAE的幅度值在各个频率段均有明显的降低(P<0.01)。扫描电镜下见各实验组动物内耳半规管壶腹嵴两囊斑及Corti器感觉毛细胞纤毛缺失、散乱、倒伏及融合,表皮板等结构均有不同程度的损伤。结论次声波对豚鼠前庭末梢感受器兴奋性可能有一过性的轻微抑制作用,但SPT无有意义改变。次声波可引起豚鼠内耳毛细胞超微结构的损伤,可导致豚鼠耳蜗外毛细胞功能明显减退,这种功能减退尚不足以引起听力的明显改变。     

缓释骨形态发生蛋白-2听泡内植入对豚鼠内耳功能的影响

目的观察缓释骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）植入豚鼠听泡内的成骨诱导情况及对耳蜗功能的影响。方法制备猪小柱状脱细胞松质骨,与BMP-2复合。选择20只豚鼠,耳后进路进入听泡,左耳植入复合BMP-2的脱细胞松质骨,右耳植入单纯脱细胞松质骨作为对照。分别在植入前、植入即刻、植入后3个月对动物进行ABR测试。并在植入3个月后行组织学及耳蜗基底膜铺片硝酸银染色观察,了解BMP-2诱导成骨情况及对听泡、耳蜗大体结构和毛细胞形态的影响。结果术后动物健康状况良好。植入后即刻,实验耳及对照耳ABR反应阈略有下降,3个月时恢复正常。植入3个月后,耳蜗及听泡大体形态正常,组织学检查可见含BMP-2脱细胞松质骨孔隙内有新骨形成,未见耳蜗及听泡骨质异常增生,镫骨底板关节无固定;硝酸银染色示毛细胞形态正常,无毛细胞缺失。结论缓释BMP-2听泡内植入可诱导新生骨形成,但对动物听泡大体形态无影响,不会引起局部骨质异常增生,对动物听功能无影响,有可能应用于听骨链缺损修复重建。     

腺病毒携带的LacZ基因在豚鼠耳蜗中的表达

目的 带有LacZ基因的腺病毒注入豚鼠耳蜗后,观察不同时间段LacZ基因的表达和分布情况及手术操作对听力的影响,为内耳基因治疗提供理论依据。方法 24只白色豚鼠术前及术后行听性脑干反应(ABR)检查。空白对照组经圆窗注入人工外淋巴液,实验组注入带有LacZ基因的腺病毒。分别于2天、l周、2周后取材。耳蜗标本经β-半乳糖苷酶(X-Gal)组织化学染色后做石蜡切片和耳蜗铺片。结果 腺病毒注入耳蜗后对听力影响不大。经X-Gal染色后整个耳蜗被染成蓝色。2天组表达产物最高,l周后逐渐降低。表达产物主要分布于柯蒂器的内外毛细胞、螺旋神经节细胞、基底膜下的间皮细胞。对照组均未着色。结论 通过圆窗注入腺病毒对听力没有影响,单一位点的接种就能使因子通过耳蜗液扩散到整个耳蜗。有效的基因转移在耳蜗是可行的,但表达相对短暂。     

adenoviral-mediated hath1-egfp gene transfer into guinea pig cochlea through intact round window membrane

Objective To study expression of adenovira1-mediated Hathl-EGFP gene in the guinea pig cochlea after transfer through intact round window membrane (RWM), and to assess its effects on hearing. Methods Twenty adult guinea pigs were used, of which: 12 were surgically inoculated with AdHath1-EGFP in the bony groove of round window niche, and 8 with artificial perilymph. Auditory brainstem response(ABR) thresholds were determined in all animals before and 5 days after surgery. On post-surgery day 5 and day 14, animals were sacrificed and whole mounts of cochlea and fro zensections were examined. Results ABR tests showed no significant change of hearing after the surgery.Strong fluorescence staining in the cochleae was seen in Ad-Hathl-EGFP groups. The highest levels of gene expression were seen in the post-surgery day 5 group with tittle decrease on post-surgery day 14.The contralateral cochlea and those in the control groups were free of fluorescence staining. Conclusion The transgenic Hath1-EGFP can be effectively delivered into the inner ear through intact RWM, in an atraumatic manner.     

Expression of heat shock protein 70 in immune response of the guinea pig inner ear]

OBJECTIVE: To explore whether the immune response of the inner ear could induce heat shock protein (hsp) 70 in guinea pig cochlea. METHODS: A model of autoimmune inner ear disease (AIED) was established by systemically immunizing the guinea pig with the homologous crude inner ear antigen (CIEAg). The immunized cochleae and normal control cochleae were examined for the expression of hsp70 with techniques of immunohistochemistry and in situ hybridization. RESULTS: In the control animals, the expression of the hsp70-like protein appeared only in the spiral ganglion, whereas in the cochleae with CIEAg immunization, strong expression of the hsp70-like protein and its mRNA appeared in the spiral ganglion as well as in the stria vascularis and the spiral ligament. The hearing thresholds were significantly increased in 10 out of 28 cochleae (35.7%) with CIEAg immunization. CONCLUSION: The results suggest that the immune response of the inner ear can induce the expression of hsp70 in the guinea pig cochlea.     

实验性自身免疫性内耳病耳蜗热休克蛋白70的表达

目的　探讨自身免疫性内耳病模型动物耳蜗热休克蛋白的表达。方法　利用同种异体内耳抗原免疫豚鼠 ,以建立自身免疫性内耳病 (autoimmuneinnereardisease ,AIED)动物模型 ,并应用免疫组织化学及原位杂位技术 ,研究热休克蛋白 (heatshockprotein ,hsp) 70在正常对照组及AIED模型动物实验组耳蜗中的表达情况。结果　对照组豚鼠螺旋神经节细胞中存在hsp70样蛋白基础表达 ;实验组 2 8耳中 10耳 (35 7% )听阈提高≥ 10dB ;此组动物螺旋神经节细胞和血管纹、螺旋韧带hsp70及其mRNA表达明显增强。结论　以粗制膜迷路抗原免疫豚鼠 ,听阈提高动物hsp70在螺旋神经节细胞和血管纹、螺旋韧带合成增加。     

Relationship between three inner ear antigens with different molecular weights and autoimmune inner ear disease

Crude inner ear antigen (CIEAg) can induce autoimmune inner ear disease (AIED) although it is not known which subcomponent of CIEAg is involved. In this study, we investigated the relationship between 3 purified inner ear antigens (31, 42-45 and 60 kD proteins) and AIED, and determined their distribution in normal guinea pig cochlea. Three groups of guinea pigs were immunized with the three inner ear antigens and one group served as a control. The hearing thresholds, serum IgG level and morphological changes in the inner ear were observed. The expression of the three antigens in the cochlea was detected using immunohistochemical techniques. No obvious changes in hearing thresholds or inner ear morphology were observed between the control and 42-45 kD groups. Animals immunized with the 31 or 60 kD proteins showed a significant increase in hearing thresholds (p < 0.05 vs control), accompanied by morphological changes in the inner ear. The serum IgG level was increased significantly (p < 0.05) in all immunized animals. The 31 kD protein was distributed in the cochlear nerve and spiral ganglion, while the 42-45 and 60 kD proteins were distributed widely, being found in the spiral ganglion, organ of Corti, stria vascularis and spiral ligament. These results suggest that two subcomponents of CIEAg (the 31 and 60 kD proteins) may induce AIED independently, that several inner ear antigens may contribute to the pathogenesis of AIED and that the 31 kD protein is of high tissue specificity and may be used as a marker protein for the clinical diagnosis of AIED.     

Spontaneous remission in experimental autoimmune labyrinthitis.

We investigated the time course of hearing impairment and cellular infiltration into the inner ear after systemic sensitization of guinea pigs with a single intradermal injection of bovine inner ear antigen (IEAg) in complete Freund's adjuvant (CFA). Lymphocytes and polymorphonucleocytes appeared mainly in the scala tympani on days 7 to 14, and in addition there was thickening and cellular infiltration of the round window membrane at day 14. These cellular infiltrations resolved after day 28. The auditory brain stem response thresholds from IEAg-sensitized animals were significantly elevated after day 7. Some sensitized animals (n = 5) had spontaneous remissions after day 28; however, the hearing thresholds did not completely recover. These results demonstrate that experimental autoimmune labyrinthitis can be induced by a single inoculation of IEAg-CFA and that remission, as evidenced by clearing of the cochlear cellular infiltration and improved hearing thresholds, can occur spontaneously.     

内耳免疫反应中细胞凋亡及Caspase-3动态表达的研究

目的:研究内耳免疫反应过程中是否存在细胞凋亡,以及细胞凋亡是否与Caspase3信号转导有关。方法:选用雌性白色豚鼠45只,随机分为实验组29只,对照组16只,以钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)全身免疫后,实验组以相同抗原进行内耳免疫,对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),分别在内耳免疫术后1、3、5、7d和14d后处死动物,于免疫前及处死前行双侧听性脑干反应(ABR)测试。取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测内耳凋亡细胞,免疫组织化学检测内耳Caspase3的表达。结果:实验组豚鼠内耳免疫前、后反应阈比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01);对照组给药前、后比较反应阈无明显变化。实验组豚鼠内耳均存在TUNEL染色阳性细胞,并且TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征,而对照组仅在支持细胞、血管纹和螺旋神经节细胞中发现极少数TUNEL染色阳性细胞。Caspase3免疫组织化学染色实验组内耳从内耳免疫后5d开始出现阳性表达,而对照组表达阴性。结论:内耳免疫反应可以诱导细胞凋亡的发生;内耳免疫反应诱导细胞凋亡的发生中有Caspase3的激活。