重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs).方法从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI=10^2,10^3,10^4,10^5,10^6,10^7)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况.结果转染后10～14 d,eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%～2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率.在MOI=105的条件下转染后观察了61 d,eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5～0.6)%,33～61 d一直维持在这一水平.结论rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍.     

嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:研究携带35型腺病毒纤毛的嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35能否有效地将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察eGFP基因在大鼠BMSCs内持续表达的时间.方法:贴壁培养法分离、扩增大鼠BMSCs.用带有eGFP基因的Ad5/F35(Ad5/F35-eGFP)分别以1、10、100、1000的感染复数(MOI)转染第2代大鼠BMSCs;荧光倒置显微镜和流式细胞仪(FCM)检测eGFP基因的转染效率与表达水平,观察细胞生长状态以评估病毒对大鼠BMSCs基本生物学特性的影响;对MOI=100的病毒转染的大鼠BMSCs在转染后第2、7、14、21、30天分别用FCM检测大鼠BMSCs内eGFP的表达情况.结果:MOI在1到1000范围内,eGFP基因转染效率和表达水平与Ad5/F35-eGFP的MOI呈正向剂量相关性.MOI=100的病毒可转染90%左右的大鼠BMSCs,且eGFP基因在1个月内均有表达.MOI为1、10、100的病毒不影响大鼠BMSCs的活力和增殖能力.结论:Ad5/F35可以高效地将eGFP基因体外转染大鼠BMSCs,eGFP基因可持续表达1个月.本研究为Ad5/F35作为BMSCs的基因转移和表达载体进行细胞治疗与基因治疗提供了实验依据.     

改良腺病毒AdF35-eGFP转染人 及大鼠骨髓间充质干细胞的效率对比研究

目的：比较改良腺病毒AdF35-增强绿荧光蛋白（eGFP）转染人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）和大鼠骨髓间充质干细胞(rat BMSCs, rBMSCs)的效率。方法：分别从人体、大鼠骨髓中分离出BMSCs,成骨、成脂诱导培养以鉴定BMSCs。构建含eGFP的AdF35重组腺病毒载体AdF35-eGFP,以不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别转染BMSCs后,MTT检测AdF35-eGFP对2种BMSCs的毒性作用,荧光显微镜观察eGFP的表达,流式细胞仪检测转染效率,实时定量PCR检测2种BMSCs表达柯萨奇腺病毒受体(CAR)和CD46 mRNA的水平。结果：hBMSCs和rBMSCs从骨髓中分离出来后,分别成功诱导分化成骨和成脂。当MOI为1 000 PFU/mL时,AdF35-EGFP对2种BMSCs的活性均有明显抑制作用（P<0.001）。AdF35-eGFP感染hBMSCs 48 h后,荧光显微镜下可见发强烈绿色荧光的细胞,流式细胞仪检测其转染效率可达(84.8±7.1)％;Ad5-eGFP感染rBMSCs后,荧光显微镜下仅见少量发绿色荧光的细胞,48 h转染效率为(3.1±1.1)％。hBMSCs高表达CD46 mRNA,低表达CAR mRNA;而rBMSCs则高表达CAR mRNA,低表达CD46 mRNA,2种基因的表达差异有统计学意义（P<0.01）。结论：AdF35可作为理想载体携带目的基因转染hBMSCs,但不适合作为转染rBMSCs的载体。     

携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞示踪方法

目的本实验研究旨在研究使用携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP的慢病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cell,BMSCs)的方法,用于解决组织工程骨研究中种子细胞分化、增殖过程中的示踪问题。方法用携带eGFP的慢病毒转染第3代BMSCs,用流式细胞仪检测转染率,获得稳定表达eGFP的BMSCs,并通过描绘生长曲线来判定对BMSCs增殖性能的影响。结果当MOI值为70时,经eGFP慢病毒转染后的BMSCs能够得到活性较好、转染率高的eGFP-BMSCs;转染后各细胞生长曲线呈"S"形,MOI=70与MOI=0时细胞增殖最好,MOI=100会对BMSCs增殖造成影响。结论 MOI=70时携载eGFP基因慢病毒转染BMSC效果最好。     

血管内皮细胞生长因子体外修饰骨髓基质干细胞关节镜下回植治疗兔股骨头坏死的研究

目的 检测rAAV-2-hVEGF-165转染骨髓基质干细胞后的基因表达,研究髓芯减压关节镜监视下hVEGF基因转染骨髓基质干细胞在治疗股骨头缺血性坏死中的作用及价值.方法 制备rAAV-2-hVEGF-165,将病毒以感染被率(MOI)为1×10~5v.g./cell转染兔骨髓基质干细胞,应用腺相关病毒介导绿荧光蛋白转染兔骨髓基质干细胞检测转染情况.应用RT-PCR和免疫印迹检测转染BMSCs外源hVEGF基因的转录与表达,得出最佳的转染时间.关节镜监视并对坏死骨清除后植入骨髓基质干细胞,术后2、4、8周分别对各组兔股骨头行X线分析,生物力学分析,切片血管计数并行免疫组化检查,观察疗效.结果 rAAV-2-hVEGF-165转染的兔骨髓基质干细胞可有效表达hVEGF-165,RT-PCR和免疫印迹检测可见转染MSCs中外源hVEGF基因的转录与表达.转染后48 h即可有表达,10 d时表达最强.免疫组化检测发现植入转染的骨髓基质干细胞2周后出现阳性表达,8周后强阳性表达.生物力学分析显示植入转染细胞组股骨头强度接近正常股骨头.结论 hVEGF-165基因转染的兔骨髓基质干细胞可有效表达具有生物活性的hVEGF-165蛋白.通过关节镜监视可以彻底清除死骨,使hVEGF-165基因修饰的骨髓基质干细胞准确的回植入股骨头坏死处,可使股骨头缺血性坏死的修复加强.回植入兔股骨头的hVEGF-165基因可有效表达.     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒标记小鼠脐带间充质干细胞示踪方法

目的 探讨慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein,eGFP)转染小鼠脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)。方法 通过组织贴壁法得到mUCMSCs;用生长增殖曲线、成骨、成软骨及成脂分化进行鉴定;以MOI为50、100、150、200携载eGFP的慢病毒载体介导转染mUCMSC,倒置显微镜下观察荧光表达,确定荧光表达率最高的MOI组。结果 eGFP慢病毒以MOI=150转染mUCMSC,效率较高,可直接用于体内示踪。结论 用小鼠脐带可以分离出mUCMSCs,MOI=150时携载eGFP的慢病毒传染mUCMSCs效果最好。     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法 应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果 成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论 KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联?     

姜黄素促进炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化

目的 研究姜黄素对炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法 分离、培养大鼠BMSCs,以10 ng/mL的肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱发细胞炎症反应,用不同浓度姜黄素处理细胞,CCK-8检测细胞增殖以便筛选出实验所需姜黄素适宜浓度;实验分组为正常组、炎症组和炎症+姜黄素组;碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测成骨分化,实时荧光定量PCR检测骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)的表达。结果 成功分离培养BMSCs;低浓度的姜黄素无细胞毒性,1μmol/L为适宜浓度;炎症降低大鼠BMSCs成骨相关基因BSP、Runx2表达,且ALP染色变浅、矿化结节减少;而姜黄素则可以逆转这种趋势,促进炎症状态下成骨相关基因 BSP、Runx2的表达(P＜0.05),较炎症组ALP染色加深,矿化结节增多。结论 姜黄素可以促进炎症微环境下BMSCs成骨分化。     

人bFGF重组慢病毒转染BMSCs的实验研究

目的探讨携带人bFGF和GFP基因慢病毒（1enti—bFGF—GFP）转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）及不同MOI（multiplicity of infection）的转染效率。方法实验组：带有bFGF和GFP基因慢病毒感染的BMSCs（bFGF—GFP—BMSCs）。空载体组：带GFP基因慢病毒感染的BMSCs（GFP—BMSCs）。空白组：未经感染的BMSCs;ELISA、RT—PCR检测各组细胞培养72h后bFGF的表达。MOI分别为10、30、50转染BMSCs的转染率。结果bFGF—GFP—BMSCs组表达bFGF蛋白量经ELISA、RT—PCR检测均明显高于GFP—BMSCs组和BMSCs组。MOI为10、30、50、的转染效率分别为36．6％、84．2％、98．5％。结论带有bFGF和GFP基因慢病毒成功转染骨髓间质干细胞并表达,为bFGF基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤奠定了基础。MOI为50时,BMSCs的转染率超过85．0％。     

β-catenin慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

【目的】构建β—catenin慢病毒载体,转染骨髓间充质干细胞并予以鉴定。【方法】β—catenin曼病毒载体转染骨髓间充质干细胞,在倒置荧光显微镜下观察转染效率,并进行RNA提取及PCR扩增,检测目的基因表达情况,进行CCK—8实验检测转染后细胞的增殖活性。【结果】当感染复数为25时,感染后96 h观察干细胞的感染效率大约为80%。PCR检测到β—eatenin的mRNA在骨髓间充质干细胞中过表达。慢病毒对细胞的增殖有一定的抑制作用,但β—catenin对细胞增殖有促进作用。【结论】β—catenin慢病毒载体成功转染大鼠骨髓间充质干细胞,为进一步研究β—catenin在MSCs中的作用奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

目的:研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况. 方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞,持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况,并计算转染效率. 应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定,50 mL/L胎牛血清诱导细胞分化后,应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力. 结果:荧光显微镜观察显示转染后24 h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达,转染后72 h,大部分细胞表达绿色荧光蛋白,转染效率可达90%. 经传代培养8 wk后,表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70%～75%. 免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性,50 mL/L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞. 结论:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞,并可在细胞中长期稳定地表达,绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植.     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞

目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据。方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1 、3 、5 、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率。MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持。MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义。结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响。     

携带hHCN4基因重组腺病毒载体体外转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建重组腺病毒载体Ad-hHCN4-IRES/eGFP在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）,检测目的基因在BMSCs中mRNA和蛋白水平是否有表达。方法采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs;将携带hHCN4基因的重组腺病毒转染大鼠BMSCs,用荧光显微镜观察转染后BMSCs绿色荧光蛋白的表达,用RT-PCR和Western Blot法检测转染后hHCN4基因mRNA和蛋白水平的表达情况。结果 BMSCs成功贴壁分离传代。转染目的基因24 h后荧光显微镜下即观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测到有hHCN4 mRNA的表达,Western blot法检测到有其蛋白水平的表达。结论重组腺病毒载体转染的BMSCs能够表达hHCN4基因。     

绿色荧光蛋白标记骨髓基质干细胞在恒河猴体内构建组织工程骨的示踪作用

目的 用绿色荧光蛋白(GFP)标记恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC),以示踪其在体内参与组织工程骨形成的情况.方法 用OBI-293A细胞对腺病毒Ad5.CMV-GFP进行扩增,用Ad5.CMV-GFP转染rBMSc,将转染成功的第三代BMSc在转染后48 h消化制成细胞悬液,接种至块状可吸收HA上,体外培养3 d后,将其植入恒河猴(同体移植)背阔肌的肌袋内,以未转染GFP的BMSC用同样的方法接种块状可吸收HA上,作为对照,术后6周取材,4%的中性多聚甲醛固定,塑料包埋,制作骨磨片PI染色在激光共聚焦显微镜下进行观测.结果 转染GFP后,rBMSc仍贴壁生长,呈梭形或多角形,仍分裂增殖,但增殖速度有所降低.48 h可见细胞发出强烈的荧光,呈全细胞分布,计数转染率达80%.在激光共聚焦显微镜下观察骨磨片,可见材料内有发出较强荧光的细胞结构,能同时被PI染液着色.结论 绿色荧光蛋白能有效示踪组织工程骨种子细胞,种人体内的BMSC是组织工程骨骨组织形成的主要细胞来源.     

两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.