ALDH2基因导入对K562细胞增殖和抗氧化损伤的影响

目的 克隆人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因,研究ALDH2基因导入慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞后对其增殖和抗氧化损伤的影响.方法 从肝细胞中克隆人ALDH2基因,构建真核表达载体,用脂质体法将其导入K562细胞中,用RT-PCR和Western blot法检测ALD-H2基因的表达,锥虫蓝拒染法和MTT法检测转基因组细胞的增殖水平及对氧自由基引起的氧化损伤的反应;在此基础上,利用RT-PCR以及荧光分光光度法进一步检测氧自由基诱导后转基因组细胞中血红素加氧酶-1(HO-1)的表达和细胞内活性氧类(ROS)的产生.结果 成功克隆人ALDH2基因并将构建的真核表达载体转染K562细胞,RT-PCR和Western blot法检测到ALDH2的高表达.锥虫蓝拒染法和MTT结果显示转基因组细胞增殖水平明显高于对照组(P＜0.05),经基因修饰的细胞对H2O2耐受性增高,H2O2的IC50值提高了7.8倍(IC50值分别为12.3μnol/L和1.4 μmol/L,P＜0.01).HO-1的表达和ROS的产生随H2O2浓度的增大而增加,而一定浓度H2O2诱导后HO-1的表达和ROS的产生在转基因组中显著低于对照组(P＜0.05).结论 ALDH2基因导人K562细胞后可增加对氧自由基引起的细胞损伤的耐受性,起到保护作用,该过程伴随着ROS水平以及HO-1表达的降低.     

HO-1基因表达对伊马替尼耐药的慢性髓系白血病细胞增殖的影响

目的 通过氯高血红素(Hemin)诱导伊马替尼耐药慢性髓系白血病(CML)细胞株K562/A02-IM 中血红素加氧酶-1(HO-1)基因表达,探讨HO-1基因对伊马替尼耐药CML细胞增殖的影响,为治疗CML多药耐药及新药的开发提供思路和实验依据.方法 采用RT-PCR法检测20例CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞中HO-1基因的表达,半定量RT-PCR法和Western blot法分别检测不同剂量Hemin处理K562/A02-IM细胞不同时间后HO-1的表达,通过Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况,采用MTT法检测Hemin诱导及锌原卟啉抑制HO-1表达与细胞存活率的关系.结果 RT-PCR结果显示耐药患者骨髓细胞中HO-1基因阳性表达,半定量RT-PCR和Western blot法显示,不同浓度的Hemin(0、10、20及40 μmol/L)处理K562/A02-IM细胞16 h后,HO-1的表达量随Hemin浓度的升高而增加,存在剂量依赖关系,而20 μmol/L Hemin分别处理K562/A02-IM细胞0、8、16、24 h后,HO-1的表达肇在处理16 h组最高.Annexin V/PI法检测显示,0、10、20及40 μmol/L Hemin作用于K562/A02-IM细胞16 h后细胞凋亡率分别为(17.61±0.01)%、(12.13±0.11)%、(7.94±0.03)%和(4.62±0.15)%,其抗凋亡的作用呈剂量依赖性;20 μmol/L Hemin作用K562/A02-IM细胞8、16及24 h的细胞凋亡率分别为(14.72±0.05)%、(8.15±0.07)%和(16.37±0.13)%.MTT法检测显示与对照组相比,Hemin诱导K562/A02-IM细胞HO-1基因表达促进了细胞的增殖,且作用存在剂量依赖关系;而锌原卟啉抑制HO-1的表达,促进了细胞的凋亡(P<0.05).结论 CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞HO-1基因阳性表达,HO-1 是一种可诱导表达型基因,具有抗细胞凋亡及促进细胞增殖的作用,抑制HO-1 表达可能成为治疗CML耐药的新方法.

Abstract：

Objective To investigate the effect of heme oxygenase-1 (HO-1 ) expression on cell growth and apoptosis in imatinib resistant chronic myeloid leukemia (CML) cells ( K562/A02-IM) , and explore the relationship between HO-1 gene and CML. Methods The expression of HO-1 in 20 drug-resistant CML patients was detected by RT-PCR. Different concentrations of hemin were used to induce HO-1 expression of K562/A02-IM, HO-1 expression at different time was detected by RT-PCR and Western blot analysis. Cell apoptosis was detected by Annexin V/PI staining, and MTT assay was used to detect viability of K562/ A02-IM cells after induction or inhibition of HO-1 gene by hemin and zinc protoporphyrin (ZPP). Results RT-PCR showed that HO-1 was expressed in the bone marrow mononuclear cells (BMMNCs). When treated with hemin at different concentrations (0, 10, 20, 40 μmol/L) for 16 h, the expression of HO-1 in K562/ A02-IM was increased in a dose-dependent manner, and peaked at 20 μmol/L of hemin for 16 h. The apoptosis rates were (17.61 ±0.01)%, (12. 13 ±0.11)%, (7.94 ±0.03)% and (4.62 ±0. 15)% at 0,10, 20 and 40 μmol/L of hemin respectively for 16 h and were (14. 7 ± 0.05) % , (8. 1 ± 0. 07) % and (16. 3 ± 0. 13)% at 20 μmol/L of hemin treatment for 8,16, and 24 h respectively. Hemin induced apoptosis of K562/A02-IM cells in a dose-dependent manner. The expression of HO-1 was induced in K562/A02-IM cells in a dose-dependent manner, and the survival of K562/A02-IM cells was significantly increased as compared to that of control group. When HO-1 was inhibited by ZPP, the cells survival was sharply decreased compared to that of the control group (P<0.05). Conclusion HO-1 was expressed in the BMMNCs. It is a kind of molecules whose expression can be induced and can promote the growth of drug-resistant cells. Inhibition of HO-1 expression probably be used for the treatment of drug-resistant CML.     

小发夹RNA对白血病K562细胞血管内皮生长因子受体Fit-1基因表达的抑制作用

本研究观察小发夹RNA对白血病细胞血管内皮生长N子受体flt-1基因表达的抑制作用并探讨其对白血病细胞侵袭能力的影响及作用机制。采用脂质体介导的方法将构建的人flt-1基N特异性shRNA真核表达载体转染入K562细胞,用（3418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组DNA,用PCR方法验证shRNA基因对K562细胞的转染;以RT—PCR和免疫印迹反应检测flt-1mRNA和蛋白表达量的变化;用Boyden小室体外侵袭实验检测白血病细胞的侵袭能力;RT～PCR方法检测白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达。结果表明,flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入白血病细胞株K562,G418筛选2周获得阳性克隆;PCR检测证实shRNA基因整合入白血病细胞基因DNA;携有shRNA的flt-1基因能明显下调白血病细胞内flt-1基因mRNA表达水平;设计的2种不同flt-1shRNA序列能不同程度干扰flt—1基因和蛋白在细胞中的表达,两纽阳性细胞中flt-1基因表达抑制率分别为46．1％和65．4％;flt—1 shRNA转染白血病细胞系K562细胞后,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平均较转染前明显下降;阳性细胞穿透人工重组基底膜的能力（4．3±1．2）％较对照组（12．7±1．9）％及（9．6±1．7）％明显降低（P〈0．01）。结论：VEGF受体flt-1特异性shRNA的真核表达载体能够高效转染入白血病细胞株K562,有效抑制flt-1基因的表达,并使白血病细胞体外侵袭能力减弱,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平下降。这提示VEGF可能通过与其受体结合调控MMP-2和MMP-9的方式,参与白血病细胞的转移。     

遗传性铁粒幼细胞贫血致病的ALAS2基因表达载体的构建

X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)是红系特异性δ-氨基-γ酮戊酸合酶(δ-amionlevulinic acid syntase 2，ALAS2)基因突变造成的，本研究构建ALAS2基因的真核表达载体，观察表达栽体转染真核细胞后蛋白表达的情况。将获自人胎肝的ALAS2基因插入到红色荧光蛋白质粒pDs—red2-N1中，命名为pDs—red2-N1／ALAS2；采用电穿孔方法将质粒转染K562细胞；转染后48小时提取细胞总RNA，进行RT—PCR检测ALAS2基因表达；流式细胞术检测红色荧光蛋白表达。再采用脂质体方法将质粒转染COS7细胞，转染后72小时提取细胞总RNA，RT—PCR检测ALAS2基因表达，荧光显微镜观察COS7细胞红色荧光蛋白表达情况。结果表明：构建了一种pDs—red2-N1／ALAS2真核表达载体，提取质粒DNA经酶切、电泳可以看到在4700bp和1764bp处存在两条电泳条带；全长测序证实构建的栽体序列正确；质粒转染K562和COS7细胞后均出现阳性ALAS2基因转录产物：流式细胞术检测转染后K562细胞红色荧光蛋白表达的阳性细胞百分率为19．2％；荧光显微镜显示转染后COS7细胞红色荧光蛋白，表达高峰出现在转染后第3天，阳性细胞百分率为10．7％，并可持续表达10天左右。红色荧光蛋白的表达可以间接说明ALAS2基因的表达。结论：ALAS2基因的真核表达载体构建成功，可以通过电穿孔和脂质体的方法转染真核细胞中并在其胞浆中表达，有可能用于XLSA患者基因替代治疗。     

MGMT基因导入对真核细胞保护作用的实验研究

目的克隆六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）基因并构建表达载体，导入真核细胞表达，研究MGMT对真核细胞保护作用。方法利用RT—PCR克隆人肝细胞MGMT基因并重组构建真核表达载体。脂质体法导入K562细胞及人外周血单个核细胞（PBMNC），用实时定量PCR法检测目的基因的表达。MTT法检测转基因细胞对烷化剂耐药性的改变。结果成功克隆人MGMT基因，转染K562细胞和PBMNC后，转基因组MGMTmRNA表达水平分别是转染空载体组的13．4倍（P〈0．01）和4倍（P〈0．01）。Western blot结果显示MGMT蛋白表达在转基因组中明显高于转空载体组及对照组。耐药性实验结果显示目的基因导入后，K562稳定转染细胞和PBMNC瞬时转染细胞对烷化剂的半数抑制浓度分别提高到原来的7倍和2倍。结论MGMT基因导入可使真核细胞对烷化剂的耐药性得到不同程度的增强，从而对细胞起到保护作用。     

抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因抑制白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的探讨抗血管内皮生长因子(VEGF)发夹状核酶基因对白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成的影响。方法采用脂质体介导的方法将抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ 转染白血病细胞系 K562,G418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组 DNA,用 PCR 方法验证核酶基因已转入 K562细胞;荧光定量 PCR 和免疫印迹反应检测白血病细胞中 VEGF mRNA 和蛋白表达量的改变;将白血病细胞皮下接种 BALB/c 裸鼠,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况;组织形态学和免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤微血管密度(MVD)。结果抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体 pcDNA-RZ 转入白血病细胞系 K562(K562/RZ),G418筛选两周获得阳性克隆,PCR 检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组 DNA;与 K562及 K562/PC 细胞(转染空质粒的 K562细胞)相比,K562/RZ 细胞 VEGF mRNA 和蛋白的表达量明显降低。接种 K562、K562/PC 和 K562/RZ 细胞组小鼠肿瘤终体积分别为(3.21±0.89)cm~3,(3.42±1.01)cm~3,(1.71±0.94)cm~3;肿瘤重量分别为(4.43±0.87)g,(3.96±0.94)g,(2.24±0.56)g;瘤体内 MVD 分别为4.70±1.25,4.67±1.31和1.80±1.55。以上各组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)。结论转导抗 VEGF 发夹状核酶基因能减少白血病细胞中 VEGF 的合成,细胞裸鼠致瘤能力明显减弱,瘤体内血管形成能力降低。     

稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株的建立

本研究目的是建立稳定表达HLA-A*1101分子的K562细胞株,为研究慢性髓系白血病(CML)HLA-I限制性抗原特异T细胞的细胞毒作用提供靶细胞.利用RT-PCR从CML患者外周血单个细胞中扩增HLA-A*1101基因全长序列;利用重组PCR将2A肽连接子(D-V-E-X-N-P-G-P)基因连接到HLA-A+ 1101的3’端,并将其定向克隆入带有增强型绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N3,构成HLA-A+ 1101-T2A-EGFP转录盒的重组表达载体;利用电穿孔技术将pEGFP-N3或重组质粒转染入K562细胞,利用荧光显微镜监测绿色荧光蛋白的表达,通过G418筛选出有效转染pEGFP-N3或HLA-A* 1101 -T2A-EGFP载体的K 562细胞株;利用RT-PCR和流式细胞术检测HLA-A* 1101基因和蛋白的表述情况.结果表明,成功构建了以2A肽基因为连接子的HLA-A* 1101-T2A-EGFP真核表达载体;重组质粒转染的K562细胞经G418筛选2个月后,获得2株表达绿色荧光蛋白的K562稳定细胞株HLA-A* 1101 +K562和pEGFP-N3+ K562.RT-PCR检测证明,HLA-A* 1101+ K562细胞表达HLA-A* 1101基因,而pEGFP-N3+ K562细胞则不表达HLA-A*1101;流式细胞术分析显示,HLA-A* 1101和GFP蛋白双阳性HLA-A*1101+K562细胞占88.5％,明显高于pEGFP-N3+ K562细胞(0.698％).结论:建立了一个简单有效地筛选HLA-A+ 1101+ K562细胞株的方法,并成功地建立了膜稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株,为进一步研究CML的特异性细胞免疫提供工具细胞.     

WT1基因表达下调对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响

目的 探讨WT1基因表达下调对人红白血病耐药细胞系K562/A02阿霉素敏感性的影响.方法 将WT1mRNA的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA)构建至真核表达载体后转染K562/A02细胞,流式细胞术检测转染效率;荧光定量RT-PCR和Western blot法分析WT1基因在转染前后表达的差异;pWT1shRNA转染K562/A02细胞48 h并经阿霉素作用后,MTT法检测各组细胞阿霉素IC50值;流式细胞术检测细胞阿霉素累积量及细胞凋亡率.结果 与未转染对照组及空载体组相比,转染WT1shRNA质粒的K562/A02细胞WT1mRNA和蛋白水平均明显降低;经阿霉素诱导24 h后,其对阿霉素的敏感性明显增高,相对逆转率为71.5%,细胞内阿霉素的累积量较各对照组明显增高(P值均<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论 靶向WT1shRNA干扰质粒可有效抑制K562/A02细胞WT1基因表达,增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

苦参碱处理的K562细胞中IER3IP1基因表达及其对细胞增殖的影响

目的 研究苦参碱诱导K562细胞分化过程中IER3IP1基因的表达，以明确IER3IP1基因表达与苦参碱作用的量效及时效关系，并初步探讨该基因在K562细胞中的功能。方法 锥虫蓝染色分析苦参碱对K562细胞的生长抑制作用；用RT—PCR半定量方法观察K562细胞在不同时间、不同剂量苦参碱作用下IER3IP1基因的表达情况；对IER3IP1基因重组质粒转染的K562细胞（K562／eYFP—IER3IP1）作细胞形态学及细胞增殖变化的观察，同时进行细胞周期检测以及超微结构观察。结果 苦参碱对K562细胞有增殖抑制作用，在苦参碱作用3h后IER3IP1基因表达可升高3—4倍，并呈剂量依赖性，其后6～48h表达下降，低于非苦参碱处理组。K562／eYFP—IER3IP1细胞的增殖速度显著减缓，G0／G1期细胞数升高（P〈0．05）；且苦参碱作用24h后在光镜和电镜下均可见红系分化细胞增多。结论 苦参碱抑制K562细胞生长，同时使IER3IP1基因表达以剂量依赖的方式瞬时升高，转染了IER3IP1基因的K562细胞对苦参碱敏感性增高，提示该基因可能参与了苦参碱作用于K562细胞的早期反应，并在后续的红系分化中发挥作用。     

高三尖杉酯碱诱导的白血病耐药细胞基因表达谱的变化

目的 探讨高三尖杉酯碱(HHT)诱导的人白血病细胞耐药相关分子.方法 在前期建立的HHT诱导的人白血病多药耐药细胞株K562/HHT的基础上,采用基因芯片技术比较K562/HHT细胞、其亲本K562细胞以及用耐药逆转剂米非司酮(RU486)作用后的K562/HHT(K562/HHT/RU486)细胞三者基因表达谱的差异,选择在这三种细胞中呈动态变化的骨髓细胞X染色体上酪氨酸激酶(BMX)基因用RT-PCR和Western blot法在转录和翻译水平进行验证,进而转染BMX基因到K562和K562/HHT细胞,观察BMX过表达时这两种细胞内柔红霉素(DNR)含量的变化,确定BMX是否在K562/HHT细胞耐药形成中发挥作用.结果 耐药细胞K562/HHT与其亲本K562细胞相比,共有117个基因表达有显著差异,其中57个基因表达明显上调,60个基因表达明显下调,耐药细胞K562/HHT中多药耐药基因mdr1表达明显上调;K562/HHT/RU486细胞与K562/HHT细胞相比,13个基因表达明显上调,37个基因表达明显下调.这些差异表达的基因涉及耐药、细胞信号传导、细胞分化、细胞增殖、转录调节以及离子转运等.基因NM-001721(BMX)、NM-031459(SESN2)、NM-033642(FGF13)和AL 049309(SFRS12)在两组芯片中的表达均有显著差异.其中BMX基因在K562/HHT细胞中的表达与K562细胞相比,明显上调,在K562/HHT/RU486细胞则较K562/HHT细胞减低.进一步用RT-PCR和Western blot法检测得到了相同的结果.RT-PCR和Western blot证实BMX质粒转染的K562及K562/HHT细胞BMX表达均上调,流式细胞术检测到K562及K562/HHT细胞内DNR含量荧光强度分别为79.28±4.04和29.84±2.67,均较转染前荧光强度158.52±8.08和58.58±6.53显著减低.结论 BMX在高三尖杉酯碱诱导的人白血病多药耐药细胞株K562/HHT耐药性产生中发挥作用.     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）可抑制血管内皮细胞凋亡。目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢（H2O2）诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组（转染pcDNA3.1）、过氧化氢组（转染pcDNA3.1＋H2O2）和bFGF转染＋过氧化氢组（转染pcDNA3.1-bFGF-GFP＋H2O2）,流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加（P〈0.01）,而bFGF转染＋过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低（P〈0.01）。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

shRNA干扰IER3IP1基因表达对K562细胞增殖和红系分化的影响

目的 探讨靶向干扰IER3IP1基因对K562细胞增殖和红系分化的影响.方法 针对IER3IP1基因设计并构建小发夹状(shRNA)真核表达载体,转染K562细胞后用RT-PCR方法鉴定沉默效果.采用MTT实验、联苯胺染色、光镜和电镜观察、流式细胞术以及RT-PCR,观察抑制IER3IP1基因表达后对K562细胞的影响;采用0.2μmoL/L伊屿替尼诱导K562细胞2 d,观察诱导分化过程中IER3IP1基因表达变化情况.抑制IER3IP1基因表达后对红系分化相关基因Gfi-1B、GPA和γ-globin以及细胞表面GPA蛋白表达的影响.结果 成功构建针对IER3IP1基因的shRNA真核表达载体,转染至K562细胞中,该基因mRNA表达水平明显降低,抑制率达76%(P<0.01).与对照组细胞相比,K562-shRNA-IER3IP1组bcr-abl mRNA表达升高(P<0.05);MTT检测结果显示细胞增殖能力增强(P<0.01);流式细胞术检测结果显示S期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少(P<0.05);电镜可见细胞常染色质增加、异染色质减少,内质网部分扩张,囊泡样结构滞留.0.2μmol/L伊马替尼作用48 h后,K562-shRNA-IER3IP1组联苯胺染色阳性率由作用前的(44.7±2.5)%降低至(22.7±1.5)%(P<0.01),且红系分化相关基因Gfi-1B、GPA和γ-globin的mRNA表达水平明显降低,细胞表面GPA蛋白表达水平降低.同时伊马替尼作用过程中IER3IP1基因在作用3 h时表达明显升高,6 h时降低,12～48 h表达水平基本不变.结论 干扰IER3IP1基因表达后,K562细胞增殖加快,红系分化过程受阻,提示该基因可能在K562细胞增殖和向红系分化过程中发挥作用.     

逆转录病毒双顺反子策略有效转导和共表达ALDH1基因与mdr1基因的研究

目的研究含内在核糖体进入位点(IRES) 的逆转录病毒双顺反子载体介导的醛脱氢酶基因(ALDH1)与多药耐药基因(mdr1)转导和共表达.方法以携带ALDH1与mdr1基因的重组逆转录病毒双顺反子G1Na-ALDH1-IRES-mdr1(G1Na-AIM)为载体,电穿孔法转导双嗜型包装细胞PA317,长春新碱筛选;所得病毒生产细胞PA317/ AIM与单嗜型包装细胞GP+E86乒乓感染提高病毒滴度;以重组病毒上清转染K562细胞,应用聚合酶链反应(PCR)和Southern blot检测转移基因的整合,流式细胞术(FCM)及MTT分析基因表达,集落培养法测定转导效率.结果双嗜型病毒上清滴度达1.0×105cfu/ml.基因修饰细胞K562/ AIM经PCR 和Southern blot证实双基因稳定整合至基因组,对4-氢过氧化环磷酰胺(4-HC)及长春新碱(VCR)耐药 (提高3～10倍),FCM及集落法检测基因转导效率为62%～70%.结论逆转录病毒IRES双顺反子载体能引导不同类型的耐药基因有效共表达,可用于扩大耐药范围,进行体内显性选择.     

shRNA干扰CIAPIN1基因表达促进K562细胞粒系分化

目的探讨靶向干扰CIAPIN1基因表达对慢性粒细胞白血病（CML）细胞系K562粒系分化的影响。方法针对CIAPIN1基因设计并构建短发卡RNA（shRNA）真核表达载体,转染K562细胞并作为干扰组,以无关序列shRNA处理的K562细胞作为对照组。采用Real-time PCR及Western blot技术鉴定干扰效率;采用瑞氏染色和电镜分别观测K562细胞形态学和超微结构的改变;采用Real-time PCR方法检测粒系分化标志基因中性粒细胞胞浆因子1（NCF1）、血清黏蛋白1（ORM1）以及粒系分化转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）、低氧诱导因子1α（HIF1α）mRNA水平的改变;流式细胞术检测K562细胞表面分化抗原CD11b表达的改变;Western blot技术检测ERK1/2、JNK、p38MAPK及Akt磷酸化水平的改变。结果与对照组相比,干扰组的CIAPIN1基因表达被有效抑制（P〈0.05）;K562细胞的形态和超微结构趋向成熟粒细胞阶段;NCF1、ORM1、C/EBPα及HIF1αmRNA表达水平升高（P〈0.05）;CD11b表达升高（P〈0.01）;ERK1/2磷酸化水平升高（P〈0.05）,而JNK、p38MAPK及Akt磷酸化水平未见明显改变。结论抑制CIAPIN1基因表达能促进K562细胞向成熟的粒细胞阶段分化,ERK1/2磷酸化水平的升高可能参与了该分化过程。     

木香烃内酯通过JAK/STAT通路抑制K562细胞增殖研究

目的:探讨木香烃内酯对慢性髓系白血病细胞系K562细胞的增殖抑制作用及机制。方法:采用CCK-8法检测木香烃内酯对K562细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,Western blot检测相关蛋白的表达。结果:木香烃内酯能够明显抑制K562细胞增殖,其24 h半数有效抑制浓度(IC50)约为(15.70±2.13)μmol/L(P<0.05);15μmol/L木香烃内酯分别作用K562细胞0、24和48 h均能够诱导K562细胞凋亡,凋亡率由(1.77±0.59)%分别增加到(17.68±2.84)%、(30.65±4.54)%(P<0.05);木香烃内酯能够明显增加细胞内ROS的水平,由(3.52±1.08)%分别增加到(23.56±3.52)%,(36.68±4.22)%(P<0.05);木香烃内酯能够显著降低BCL-2、p-JAK2、p-STAT3的表达,上调BAX、细胞色素C、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP的表达水平。结论:木香烃内酯能够通过JAK/STAT信号通路诱导K562细胞凋亡,从而抑制其细胞增殖。     

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。     

CIAPIN1基因对K562细胞增殖能力的影响

本研究旨在探讨CIAPIN1基因对慢性髓系白血病（CML）细胞系I（562细胞增殖能力的影响。针对C1APIN1基因构建shRNA真核表达载体并稳定转染K562细胞,用real—timePCR和Westernblot技术验证干扰效率,采用MTT法检测K562细胞的增殖活性的改变,利用甲基纤维素集落形成实验观察K562细胞集落形成大小和数量的变化,通过体内实验观察K562细胞在小鼠体内的成瘤能力。结果表明,与对照组相比,K562细胞的CIAPIN1基因表达被有效抑制;干扰CIAPIN1基因后K562细胞的增殖活性明显下降,集落形成数量减少和集落大小显著减小,小鼠体内成瘤能力明显降低。结论：干扰CIAP删基因表达能抑制K562细胞在体内及体外的增殖能力。     

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p0.01和p0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

K562细胞血管内皮生长因子自分泌链作用的实验研究

目的探讨抗VEGF抗体及抗VEGF发夹状核酶基因对K562细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响及其分子机制。方法将不同浓度的VEGF抗体作用于K562细胞，应用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ转染K562细胞，采用MTT法、甲基纤维素半固体培养法和细胞周期测定分析抗VEGF抗体及发夹状核酶基因对白血病细胞增殖的影响；DNA凝胶电泳和AnnexinⅤ标记法检测白血病细胞的凋亡程度；RT-PCR法测定K562细胞中相关基因表达的变化。结果抗VEGF抗体能抑制K562细胞生长，促进其凋亡，这一作用呈剂量依赖关系。0．165μg／ml VEGF抗体作用于K562细胞72h，DNA凝胶电泳出现梯状条带，当抗体浓度增加到0．825μg／ml时，梯状条带更为清晰；RT-PCR显示，VEGF抗体作用后，K562细胞MRP、TOPOⅡ基因的表达较对照组下调，而GST基因表达无明显改变。与K562及K562／PC细胞（转染空质粒的K562细胞）相比，转染抗VEGF核酶基因的K562／RZ细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量明显降低；生长曲线提示K562／RZ细胞生长缓慢，甲基纤维素集落形成率较对照组明显下降，对照组集落形成率为（30．5±3．3）％，而K562／RZ组为（16．3±2．8）％，细胞周期动力学分析结果显示K562／RZ细胞G1期细胞增多，S期细胞显著减少；在小剂量As2O3作用下，K562／RZ细胞凋亡数量较对照明显增高（凋亡率对照组为13．4％，K562／RZ组为31．5％）。结论抗VEGF抗体阻断K562细胞VEGF自分泌环路或者抗VEGF发夹状核酶减少K562细胞中VEGF的合成，能抑制K562细胞的增殖，促进K562细胞的凋亡，引起部分与细胞凋亡和多药耐药相关的基因表达改变。     

siRNA逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的　研究小分子干扰RNA片段 (smallinterferingRNAs,siRNA)对白血病多药耐药细胞系K5 6 2 A0 2mdr1基因和P 糖蛋白 (P gp)表达及功能的影响。方法　根据mdr1基因已知序列设计 3条含 2 1个碱基的siRNA(si mdr1 1,si mdr1 2 ,si mdr1 3)及阴性对照 (si neg) ,在脂质体的介导下转染K5 6 2 A0 2细胞 ;用RT PCR分析mdr1mRNA的表达 ;流式细胞术检测P gp表达和细胞内柔红霉素积累量 ;MTT法检测阿霉素对K5 6 2 A0 2细胞的半数抑制浓度 (IC50 )。结果　 3条siRNA均能不同程度地逆转K5 6 2 A0 2细胞的多药耐药。第 3条序列能更有效地封闭mdr1基因 ,使mdr1mRNA相对水平下降(5 8.0± 1 5 4 ) % ;P gp表达由处理前的 (76 .0± 1.0 ) %降到处理后的 (19.6± 1.9) % ;对阿霉素药物敏感性的相对逆转效率为 70 .4 % ;同时使K5 6 2 A0 2细胞内柔红霉素积累量增加。结论　siRNA可逆转mdr1基因编码蛋白P gp介导的多药耐药。