人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定

为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70（HSP70）的基因，以质粒为模板，采用PCR方法进行扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1.96kb的片段；回收片段经T－A克隆法克隆到pUCm-T载体上，并进行DNA测序；将目的基因片段从pUCm-T载体上酶切后，亚克隆到表达载体pET-21a( )上，将重组质粒pET-21a( )/HSP转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，收集细菌，菌体裂解后进行SDS－PAGE及Western blot检测。结果表明，应用PCR方法扩增出约1.96kb的目的片段，序列测定结果证实，扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70 cDNA序列一致；经EcoR I Xho I酶切及PCR鉴定证实，HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-21a( )上，转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，进行SDS－PAGE，发现在分子量为72000处有表达量明显增多的蛋白条带，Western blot证实其为目的的条带。表明在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70基因。     

人自噬相关基因LC3 B原核表达载体的构建及活性检测

目的：构建带GST标签的人LC3B基因原核表达载体,得到GST-LC3B重组质粒并纯化出GST-LC3B融合蛋白,体外检测并证实该蛋白的生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出LC3B基因的编码序列,将该序列插入到pGEX-KG载体中,得到GST-LC3B重组质粒,转化大肠杆菌Rossate,经小量诱导后利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化GST-LC3B融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western印迹方法进行检测,GST pull-down技术证实其生物学活性。结果利用PCR技术从人乳腺文库中成功扩增得到大小约400 bp的目的基因片段,插入pGEX-KG载体中得到GST-LC3B质粒,经双酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量（ Mr）约为40×103的目的蛋白;GST pull-down技术检测出GST-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白在体外作用,具有较好的生物学活性。结论成功构建了人自噬相关基因LC3B的原核表达产物,为进一步研究LC3 B在自噬中的作用机制奠定了基础。     

PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达

目的：构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体（hscFv)原核表达载体，对其产物作初步鉴定，为肝癌的导向治疗奠定基础。方法：采用分子克隆技术，PCR法扩增PE38基因片段，克隆人GST－融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-hscFv中，重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确，受IPTG诱导表达后，SDS－PAGE及Westem blot分析GST融合蛋白结果。结果：成功构建免疫毒素表达载体pGEX-4T-1-hscFv-PE38（以下简称pGEXh-PE38);SDS-PAGE清晰显示Mr为90000的目的蛋白条带，光密度薄层扫描提示表达量为11％，Western blot在相同位置显示蛋白印迹，证实载体构建及表达均正确。结论：利用基因重组技术，在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv-PE38，为尝试肝癌治疗试验的一条有效途径。     

微丝相关蛋白hHBRK1突变体的构建、表达及纯化

目的：构建微丝相关蛋白hHBRK1截短体和突变体原核表达载体，并表达及纯化融合蛋白。方法：采用常规PCR并结合定点突变技术，对hHBrkl基因进行缺失和点突变；利用限制性内切酶将PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-4T；IPTG诱导融合蛋白表达，通过谷胱甘肽一琼脂糖纯化技术分离纯化GST融合蛋白。结果与结论：构建了包括氨基端缺失截短体hHBRK1-AN、羧基端缺失截短体hHBRK1-AC和点突变蛋白hHBRKl-S^56G^57在内的原核表达质粒，分离获得较高纯度的重组hHBRKl突变体融合蛋白，Western杂交证实纯化蛋白为GST融合蛋白。本实验为进一步研究hHBRK1的相互作用蛋白及其可能的结合位点提供了基础。     

一种新的血管生成抑制因子-TSF的设计及表达

目的 选择PF4和TSP1的高活性片段设计融合基因－TSF，在大肠肝菌表达，细胞水平上检测表达产物的生物学活性。方法 PF4的C－末端13肽和TSP1的429－459片断31肽通过Gly-Pro-Gly肽桥设计为融合蛋白－TSF。采用pGEX-2T载体在E.coli JM109中表达TSF蛋白。采用MTT方法测定TSF及其相关性GST－TSF，PF4（58－70），TSP1（429－459）等对血管内皮细胞，平滑肌细胞，QGY7721人肝癌细胞，HLF人肺成纤维细胞等生长的抑制效应。结果 合成的TSF融合基因，克隆到pGEX-2T载体，转化E .coli JM109，获得了TSF蛋白的高效表达。建立了TSF蛋白的纯化复性方法，获得了GST－TSF融合蛋白及TSF蛋白。TSF，GST－TSF，PF4（58－70）和TSP1（429－59）均特异抑制血管内皮细胞的生长，其中TSF的活性最强，活性大小次序为TSF＞GST－TSF＞PF4（58－70）＞TSP1（429－459）。结论 融合表达蛋白－TSF在细胞水平上能高效特异抑制血管内皮细胞的生长。     

红色荧光-VEGF_(165)融合蛋白载体在细胞内的定位和表达

目的　构建在哺乳动物细胞中表达人VEGF1 65(hVEGF1 65)红色荧光蛋白 (RFP)的融合表达载体。方法　根据已知的人VEGF1 65序列 ,用PCR方法 ,从质粒pUC1 8/VEGF1 65中扩增出去除终止密码子的VEGF1 65片段 ,定向克隆至pDsRed1 N1质粒中。重组质粒经限制性内切酶和DNA序列测定鉴定。以DOTAP为介导 ,将pDsVEGF1 65Red1 N1转染 2 93 T细胞 ,4 8小时后用RT PCR、激光共聚焦显微镜检测VEGF1 65在细胞内表达和分布情况。结果　重组的融合蛋白表达载体经酶切、PCR和DNA序列测定证明构建正确 ,并在2 93 T细胞中表达。报告基因 -红色荧光蛋白在细胞质、细胞核中都有一定的分布。结论　成功构建了pDsVEGF1 65Red1 N1红色荧光蛋白融合表达载体 ,该载体能在哺乳动物细胞中表达 ,为研究VEGF的细胞内定位提供了一个重要而方便的工具     

青霉素结合蛋白2a C-末端在大肠杆菌M15中的表达、纯化及鉴定

目的构建含目的基因mecA C末端的重组子并在大肠杆菌M15中进行蛋白表达。方法采用PCR方法扩增mecA C末端DNA，将其与表达载体pQE30连接；再通过PCR及双酶切鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒转化大肠杆菌M15后，用1mmol／L的IPTG进行诱导表达。应用Ni-NTA琼脂糖进行亲和层析纯化目的蛋白，并用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pQE30-mecA重组表达质粒，转化大肠杆菌M15，经IPTG诱导表达，亲和层析纯化获得分子量为39．7kDa的蛋白；Western blotting和肽指纹图谱证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。结论在大肠杆菌内成功表达具有活性的PBP2a，为后期研究和开发抗MRSA药物奠定了基础。     

E4F1真核表达载体的构建及与p53的相互作用

目的：构建E4 F1野生型及缺失32～81位氨基酸的真核表达载体,检测其与p53的相互作用及对下游基因p53的调节。方法分别用普通PCR和重组PCR方法从乳腺文库中扩增E4F1野生型编码序列及缺失32～81位氨基酸的突变型序列,分别将其以正确相位构建到pXJ40-MYC载体中,得到重组质粒MYC-E4F1和MYC-E4F1（Δ32-81）,分别转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经酶切鉴定并转染293 T细胞, Western印迹检测蛋白的表达。将MYC-E4F1和MYC-E4F1（Δ32-81）质粒与FLAG-p53质粒共转染293T 细胞,免疫共沉淀实验检测其相互作用,野生型及缺失突变型表达载体共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测其对下游基因p53的调节。结果 E4F1重组质粒及其突变型构建成功,在293 T细胞中鉴定表达正确,野生型及突变型E4 F1均与p53存在相互作用,突变型的结合能力增强,野生型E4F1升高p21蛋白表达水平,而突变型不改变p21蛋白水平。结论成功构建E4F1野生型及缺失32～81位氨基酸的突变型真核表达载体,二者都能与p53相互作用且突变型结合能力更强,野生型E4F1升高基因p53的靶基因p21的蛋白表达水平,而突变型不改变靶基因p21的蛋白水平。该研究为进一步研究E4 F1对p53的调节及其机制奠定了基础。     

嵌合分子CblN/Grb2构建及其原核表达

目的 构建CblN／Grb2嵌合分子,表达和纯化GST-CblN／Grb2融合蛋白,并考察嵌合分子CblN／Grb2在体外是否具有泛素连接酶活性。方法 提取SKBR-3细胞的总RNA并反转录为cDNA,作为模板用PCR扩增Grb2基因的SH2片段;含有人全长CblcDNA的质粒pEFHACbl作为模板扩增Cbl基因№端（cblN）;用重叠延伸PCR方法,在CblN内部SH2两端引入BamHⅠ和EcoRⅤ酶切位点并克隆入pcDNA3．1（＋）。再以Grb2基因的SH2置换CblN的SH2即成为pcDNA3．1（＋）-CblN／Grb2;以其为模板,通过PCR方法扩增CblN／Grb2并将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达GST-CblN／Grb2融合蛋白并用Glutathione Sephamse 4B进行纯化;通过体外泛素化实验检测GST-CblN／Grb2是否具有泛素连接酶活性。结果 成功构建了pGEX-4T-2-CblN／Grb2融合表达载体;在大肠杆菌DH5α中表达了GST-CblN／Grb2融合蛋白并获得了纯化蛋白;体外泛素化实验表明GST-CblN／Grb2具有泛素连接酶活性。结论 GST-CblN／Grb2的表达、纯化及其体外活性的鉴定为进一步研究该嵌合泛素连接酶对HER2阳性肿瘤细胞生长的影响奠定了基础。     

人CDK7基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建带Myc标签的细胞周期蛋白依赖性激酶7（cyclin－dependent kinase 7, CDK7）的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶与已知相互作用蛋白P53之间的相互作用。方法应用PCR技术从人乳腺文库中扩增出CDK7全长编码区基因,将其克隆到pXJ－40载体中;继而重组质粒转染人胚肾293 T细胞,以SDS－PAGE和Western印迹鉴定表达情况;免疫共沉淀检测Myc－CDK7与FLAG－p53的相互作用。结果双酶切和基因测序鉴定显示,Myc－CDK7真核表达质粒克隆构建成功;SDS－PAGE和Western印迹结果表明,Myc－CDK7转染人胚肾293T细胞后成功表达;免疫共沉淀显示,重组Myc－CDK7与已知相互作用蛋白P53在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论成功构建Myc－CDK7的真核表达载体,为进一步探讨Myc－CDK7对细胞周期的调控奠定了实验基础。     

UROC28基因cDNA的克隆及其原核表达

目的：克隆人UROC28基因cDNA并在原核细胞中表达。方法：用RT-PCR从前列腺癌PC-3细胞系中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中。经测序证实后,用HindⅢ/EcoRI双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,并转化E.coliDH5α菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果：①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人UROC28基因cDNA;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX-4T-UROC28表达出相对分子质量（Mr）约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符。结论：成功克隆到人UROC28基因cDNA,并在E.coliDH5α中表达出GST-UROC28融合蛋白。     

二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达

目的：构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体(hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素(hEnS)融合基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法：利用RCR的方法扩增hEDN基因，克隆人含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS后，以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PACE及Westen-blot分析及鉴定。结果：成功构建了抗肝癌HdsFv-hEDN融合基因原核表达载体；SDS-PACE和wbsten—blot分析显示，诱导表达产物出现一条Mr约为45．0KD的新生蛋白带，表达量占菌体总蛋白量的x％，主要以包涵体形式存在。结论：抗肝癌hdsFv—hEDN重组免疫毒素融合基因的成功构建及表达，为其进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。     

蛋白酶体激活因子REGγ的重组表达及其体外功能的初步探讨

目的蛋白酶体激活因子11S调节蛋白复合物γ亚单位（11S regulator complex gamma subunit,REGγ）的重组表达,初步探讨其与骨形成负调控分子酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1（caseinkinase-2interactingprotein-1,CK-IP-1）的相互作用。方法首先以质粒pCMV-Myc-REGγ为模板,通过聚合酶链反应（PCR）扩增出765bp的REGγcDNA片段,然后亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-2并转化入大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,表达产物超声破碎后进行SDS-PAGE和Western印迹鉴定,进而通过GSTPull-down实验验证REGγ是否与CKIP-1存在相互作用。结果通过测序证实原核表达载体pGEX-4T-2-REGγ构建成功,进一步表达鉴定发现GST-REGγ蛋白主要以可溶性的形式存在于裂解上清中;GSTPull-down实验表明REGγ与CKIP-1存在明显的相互作用。结论REGγ与CKIP-1在体外存在相互作用,为进一步深入研究REGγ对CKIP-1的调控作用奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定

目的克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒（sARSCoV）N蛋白的DNA,构建原核表达质粒pGEX-2T／N,并诱导表达。方法采用RT-PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段。将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌中表达融合蛋白。用表达产物与抗SARS-CoV抗体阳性血清做Western blot。结果获得N基因片段;GST-N融合蛋白以可溶形式表达;Western blot检测表明,其与抗SARS-CoV抗体阳性血清的反应呈阳性。结论成功地构建原核表达质粒pGEX-2T／N,并表达GST-N融合蛋白,为下一步的研究奠定了基础。     

东部马脑炎病毒E2基因的克隆与表达

目的 :克隆表达东部马脑炎病毒 (easternequineencephalomyelitisvirus ,EEEV)E2基因 ,研究重组蛋白的抗原性 ,为研制东部马脑炎病毒基因工程诊断试剂奠定基础。方法 :由病毒感染的鼠脑制备总RNA ,利用RT_PCR技术扩增EEEVE2基因全长序列 ,并将其克隆至pGEM_Teasy载体测序 ,再将E2基因克隆至谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体pGEX_5x_2中表达。采用免疫印迹试验 (Westernblotting)和ELISA法分析表达的重组蛋白的抗原性。结果 :经过RT_PCR扩增和测序 ,证明得到的E2基因片段的序列是正确的 ,并且在原核载体中得到表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白的 2 4 .5 % ,主要以包涵体形式存在。Western印迹分析表明GST_E2蛋白有良好的抗原性 ;包涵体经Tri tonX_10 0 ,1mol L和 2mol L尿素洗涤 ,初步纯化后 ,用表达的E2融合蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA法 ,结果表明与兔抗EEEV血清起特异反应 ,但与兔抗WEEV血清无交叉反应。结论 :东方马脑炎病毒的E2基因在大肠杆菌中得到稳定表达 ,表达的GST_E2蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,为从分子水平上对EEEVE2蛋白的功能性研究和发展EEEV基因工程诊断试剂奠定了基础     

长双歧杆菌NCC2705 ATP结合蛋白BL0034表达与活性检测

目的克隆长双歧杆菌NCC2705中ATP结合蛋白BL0034的基因,利用大肠杆菌表达并纯化GST-BL0034融合蛋白,测定其结合ATP的活性。方法以长双歧杆菌NCC2705基因组为模板PCR扩增BL0034基因,双酶切后连接到pGEX-4T-1表达载体上,转入大肠杆菌BL21中表达;用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂对可溶性的GST-BL0034融合蛋白进行纯化,并用Western印迹验证。结果将BL0034基因克隆至质粒pGEX-4T-1,构建表达载体pGEX-4T-1-BL0034。BL0034经0.05 mmoL/L IPTG诱导,16℃过夜表达,SDS-PAGE可见相对分子质量约为82×103的可溶性表达条带;亲和纯化GST-BL0034,Western印迹结果为阳性。对纯化后的融合BL0033蛋白结合ATP的能力进行了定量测定,每毫克BL0034蛋白能结合约40 nmol/L ATP。结论成功克隆了BL0034蛋白的基因,表达并纯化GST-BL0034蛋白,证实了BL0034与ATP具有较强的结合能力,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705 BL0034蛋白的功能奠定了基础,为阐明其在果糖ABC转运系统中如何通过水解ATP产生能量提供了前提。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

胃癌相关基因GCRG213在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG213,制备高纯度的GCRG213蛋白。方法 采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG213 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102／D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达融合蛋白,凝胶回收目的蛋白。结果 SDS-PAGE证实在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约29．4kD的Thioredoxin,／GCRG213融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白的28．7％。经凝胶回收法得到纯度近1009,5的蛋白产品。结论 在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin,／GCRG213融合蛋白,并制备出高纯度蛋白产品,为后续的功能研究及其抗体研制奠定了基础。