豚鼠心室肌细胞的分离及其基本电生理特性的观察

目的 分离豚鼠单个心室肌细胞,并观察其基本电生理特性.方法 Langendorff灌流,胶原酶法分离心室肌细胞;应用膜片钳全细胞模式记录心室肌细胞的动作电位和L型钙通道电流.结果 酶法分离得到存活杆状细胞达50%以上.全细胞电流钳模式下记录,细胞静息电位为(-69.9±3.4)mV,复位到95%时的动作电位时程(APD95)为(313.1±38.9)ms.全细胞电压钳模式下记录到典型L型钙通道电流.结论 该方法能够简单有效地获得性能稳定的心室肌细胞,尤其适用于膜片钳心电生理学的研究.     

适于膜片钳实验的心肌细胞分离方法及维拉帕米对钙电流的作用

目的：建立适应于膜片钳实验的大鼠单个心室肌细胞的分离方法,探讨L-型钙通道在大鼠心肌电活动中的作用.方法：采用改进Langendorff装置,酶解法分离单个心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞L-型钙电流及维拉帕米的作用.结果：该法分离到的心肌细胞存活率达80％～90％,高倍镜下细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰;成功记录到典型L-型钙电流（Ica-L）,给予维拉帕米（0.3、3、30 μmol/L）后呈浓度依赖性抑制钙电流,其抑制率分别为（44.35±5.52）％,（61.06±2.99）％,（71.88±4.45）％.结论：改进心肌细胞的分离方法可获得大量耐钙心室肌细胞,这些细胞具有正常的电生理特性.     

耐钙心肌细胞的分离及基本电生理特性

目的　探讨分离单个心肌细胞的方法并进行基本电生理指标测定 .方法　改进的 L angendorff灌流法及膜片钳全细胞记录法 .结果　单个心室肌细胞静息电位为 (- 85±2 .3) m V(n=1 0 ) ,记录到单个心室肌细胞典型的 L 型钙电流特性 .结论　用该方法分离的细胞具有耐钙性和正常电生理特性     

大鼠肥厚心肌细胞分离方法的探讨

目的探讨适用于膜片钳实验急性分离肥厚耐钙SD大鼠心室肌细胞的方法。方法利用自制Lan-gendorff灌流装置,采用四步法获得单个耐钙心肌细胞,以适用于膜片钳离子电流的记录。结果稳定获得30%~40%肥厚耐钙心肌细胞。结论按照本方法在心肌细胞分离过程中的介绍,能获得30%~40%肥厚耐钙心肌细胞。     

肾上腺髓质素对脓毒性休克大鼠心肌细胞外向钾电流的影响

目的 研究肾上腺髓质素(ADM)对脓毒性休克大鼠心肌细胞外向钾电流的影响.方法 成年大鼠腹腔注射脂多糖(LPS,10 mg/kg)4 h后,分离心室肌细胞.用全细胞膜片钳的方法 记录瞬时外向钾电流(I_(to)),稳态钾电流(I_(ss))和ATP敏感钾电流(I_(K,ATP)).结果 LPS处理对I_(to)和I_(ss)无影响.休克心肌细胞I_(K,ATP)密度[(2.66 ± 0.56)pA/pF(n=12)]较正常心肌细胞值[(0.27 ± 0.08)pA/pF(n=14)]明显增加(P＜0.01).ADM受体拮抗剂ADM-(22-52)可使增加的I_(K,ATP)得到明显的恢复[(0.69 ± 0.21)pA/pF(n=11),P＜0.01 vs LPS 组].而ADM-(22-52)与100 μmol/L氨基胍联合处理几乎可完全取消I_(K,ATP)的增加.结论 脓毒性休克大鼠心肌细胞I_(K,ATP)被激活.ADM 与NO共同参与了脓毒性休克大鼠心肌细胞I_(K,ATP)的激活.     

家兔左心房后壁心肌细胞瞬时外向钾电流和L-型钙电流的特征及哇巴因对其影响

目的 探讨家兔左心房后壁(LAPW)和左心耳底部组织(LAA)心肌细胞瞬时外向钾电流(I_(to))及L-型钙电流(I_(Ca-L))的特征以及哇巴因对其影响,提供LAPW和哇巴因在引起家兔左心房电不均一性和离子通道重构的电生理基础.方法 使用离体心脏灌流系统灌注心脏,酶解法分离家兔LAPW和LAA心肌细胞.全细胞膜片钳技术记录两个部位心肌细胞I_(to)和I_(Ca-L)观察哇巴因作用前后I_(to)和I_(Ca-L)的变化,及其拟合后电流-电压(I-V)曲线改变.结果 (1)根据记录I_(to)电压钳制方案,当电位为+50 mV时,在正常对照组,LAPW心肌细胞I_(to)与LAA心房肌细胞I_(to)相比差异无统计学意义(P>0.05).但经哇巴因作用后,LAPW心肌细胞I_(to)的电流密度为(10.97±0.58)pA/pF(P<0.01),LAA心房肌细胞I_(to)的电流密度为(9.39±0.83)pA/pF(与正常对照组和LAPW心肌细胞I_(to)相比,P<0.05).LAPW心肌细胞I_(to)的I-V曲线在原来最底部移到最上部.所有I-V曲线方向没有发生改变.(2)在记录I_(Ca-L)钳制方式下,正常对照组的LAPW心肌细胞I_(Ca-L)的最大电流密度明显小于LAA心房肌细胞I_(Ca-L)的最大电流密度(P<0.05).但经哇巴因作用后,LAPW心肌细胞I_(Ca-L)最大电流密度为(-11.13±0.99)pA/pF,LAA心房肌细胞I_(Ca-L)为(-8.86±0.51)pA/pF(P<0.01).在正常对照组,LAPW心肌细胞I_(Ca-L)的I-V曲线位于最底部,经哇巴因作用后,LAPW心肌细胞I_(Ca-L)的I-V曲线上移到其他I-V曲线的最上部.每组I_(Ca-L)的I-V曲线整个形态没有发生明显变化,峰值的方向没有发生改变.结论 LAPW心肌细胞存在离子流特异性差异,哇巴因加重LAPW心肌细胞I_(to)和I_(Ca-L)大小异质性和重新分配,这可能成为心房颤动易发性的启动因素和维持条件.     

β1肾上腺素能受体抗体对小鼠心室肌细胞钾离子通道的作用

目的 采用β1,肾上腺素能受体抗体(anti-ADRβ1)模拟自身抗体,研究其对小鼠心室肌细胞钾离子通道的作用.方法 酶解法分离小鼠心室肌细胞,以不同稀释比例anti-ADRβ1.灌流心肌细胞,膜片钳电生理技术记录钾离子通道电流的变化.结果 不同稀释比例anti-ADRβ1 1/500、1/100、1/50的细胞外液灌...     

改良Langendorff主动脉逆行灌流法分离不同大鼠心肌细胞的效率探讨

目的 比较分析Langendorff主动脉逆行灌流联合酶消化传统4步法和改良2步法急性分离普通远交群大鼠(SD)心肌细胞的优缺点。同时探讨改良2步法分离普通SD大鼠、自发性高血压大鼠(SHR)及wistar-京都大鼠(WKY)心肌细胞数量和质量的差异。方法 同时运用传统4步法和改良2步法急性分离SD大鼠心肌细胞，在倒置显微镜下观察心肌细胞形态及存活细胞比率。随后用改良2步法分离SD、WKY和SHR的心肌细胞，比较三种大鼠心肌细胞数量和质量差异，探讨改良2步法在不同大鼠心肌细胞急性分离的价值。结果 两种方法分离SD大鼠心肌所得杆状细胞横纹清晰、棱角分明，均为可供膜片钳实验顺利进行的存活细胞，改良2步法分离所得杆状细胞数、总细胞数较传统4步法显著增加，差异有统计学意义(P<0.05);改良2步法分离3组大鼠杆状细胞数、总细胞数差异有统计学意义(P<0.05),3组大鼠杆状细胞比率、覆钙后杆状细胞数和细胞总数均没有差异(P>0.05);3组大鼠心脏重量、消化时间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 心肌细胞急性分离的Langendorff主动脉逆行灌流联合酶消化...     

犬心室肌3层细胞的分离定位方法

随着膜片钳技术的逐渐推广和心肌电异质性等研究领域的发展,对犬等大型动物的应用越来越多,往往也需要对犬心室肌心外膜下细胞(Epi细胞)、中间层细胞(M细胞)和心内膜下细胞(Endo细胞)进行准确的定位和分离。成功分离犬心肌细胞并使其保持良好状态是决定整个实验成败的核心环节。现将我们近3年来分离定位犬心室肌细胞的经验简介如下。     

α1-肾上腺素受体对正常大鼠心室肌细胞瞬间外向钾电流的调控作用

【目的】研究α_1-肾上腺素受体激活对正常大鼠左心室肌细胞瞬间外向钾电流(I_(to))的作用及其信号调节途径,探讨α_1-肾上腺素受体激活引起室性心律失常的细胞离子机制。【方法】用酶解法分离Wistar大鼠单个左心室肌细胞,应用膜片钳全细胞记录方法记录I_(to)。观察0、10、100和1000μmol/L苯肾上腺素(n=10个细胞)对心室肌细胞I_(to)的作用,并观察α_1-肾上腺素受体拮抗剂哌唑嗪(n=10个细胞)和磷脂酶C(PLC)拮抗剂U-73122(n=8个细胞)对其作用的影响。【结果】苯肾上腺素明显抑制I_(to),其作用呈浓度依赖性,分别为(12.6±6.2)pA/pF、(11.1±5.0)pA/pF、(8.6±3.8)pA/pF和(7.9±5.1)pA/pF,分别较0浓度时减少14％、32％和37％,而对电流特性无明显影响。哌唑嗪和U-73122均能完全抑制苯肾上腺素对I_(to)的作用。【结论】α1-肾上腺素受体的激活抑制了心室肌细胞的I_(to),其作用是通过PLC途径调节的。     

雷诺嗪对兔心室肌细胞快钠电流的影响

目的 研究雷诺嗪对兔心室肌细胞快钠电流的影响.方法 运用全细胞膜片钳记录方法了解雷诺嗪对兔心室肌细胞快钠电流的作用,并了解其是否存在使用依赖性阻滞作用.结果 30μmol/L雷诺嗪对兔心室肌细胞快钠电流有明显的抑制作用,其IC50为(39.3±2.0)μmol/L,并且随着刺激频率的增加其作用加强,存在使用依赖性.结论 雷诺嗪对兔心室肌细胞快钠电流有一定的抑制作用,其存在使用依赖性阻滞作用.     

单个人心房肌细胞急性分离技术及其细胞膜瞬时外向钾电流的记录

目的建立单个人心房肌细胞的急性分离技术,以满足检测人心肌细胞离子通道的需要。方法两步酶解法消化分离人心房肌细胞,采用膜片钳全细胞技术记录瞬时外向钾电流（I_to）。结果根据患者的性别、年龄及组织块的大小,选择适当的消化时间,分离得到结构清晰,横纹清楚,边缘整齐,少颗粒,舒展伸直,呈长杆状的单个心肌细胞：采用全细胞膜片钳技术能记录到瞬时外向钾电流。结论该方法能分离到形态和状态均良好的细胞,有利于进行单个人心房肌细胞膜片钳实验的研究。     

心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞心肌化时电生理特性研究

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌细胞分化过程中离子通道电流的表达情况,为临床BM-SCs移植的安全性提供参考。方法分离培养BMSCs及乳鼠心肌细胞(NRVM s),并以1∶10的比例共培养,应用全细胞膜片钳技术记录共培养的BMSCs上离子通道电流的表达情况。结果成功分离培养BMSCs和NRVM s并建立了共培养模型,共培养1周后,BMSCs形态发生了明显变化;在心肌微环境诱导下,向心肌分化的BMSCs平均膜电位为-(40.37±3.68)mV,平均膜电容为(35.18±4.96)pF;共培养的BMSCs上可记录到IK1、Ito、IKsus,未记录到INa和ICa,也未记录到KCa。结论BMSCs和NRVM s共培养1周后,BMSCs上记录到IK1、Ito及IKsus,但未记录到INa和ICa。     

膜片钳技术研究中钙耐受的心室肌细胞分离方法

目的：探索并建立适合于膜片技术研究的心室肌细胞急性酶分离方法。方法：采用改进的自制的Langendorff心脏灌流系统,用无钙Tyrode液和酶解液逆行主动脉灌流之后,分次剪取心肌组织置于细胞保存液（KB液）中保存以供全细胞膜片钳方式记录膜电位和膜电流。结果：分离所得80%-90%的细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰,可记录到典型的动作电位。结论：控制好分离心室肌细胞的实验条件以及熟练掌握实验操作的方法,是分离出适合于膜片钳实验的心室肌细胞的重要因素。     

二乙酰基莲心碱对心室肌细胞膜钠、钙通道的影响

目的 :探讨二乙酰基莲心碱 (Diacetyl linesinine)对家兔心室肌细胞膜钠、钙离子通道的影响。方法 :选取10只体重 1.5～ 2 .0kg的健康新西兰大耳白兔 ,酶解法分离单个心室肌细胞 ,应用全细胞膜片钳技术观察 10 ,30 ,10 0 μmol·L-1的二乙酰基莲心碱对心室肌细胞膜钠通道和钙通道的作用。结果 :二乙酰基莲心碱浓度依赖性减少钠电流和L 型钙电流 ,10 ,30 ,10 0 μmol·L-1的二乙酰基莲心碱可分别使峰值钠电流降低 4 0 .7% ,78.4 %和 89.4 % ;使峰值L 型钙电流降低 5 6 .6 % ,6 5 .7%和 73.6 %。另外 ,二乙酰基莲心碱可使钠通道灭活曲线左移 ,并可减慢钠通道灭活后的恢复过程。结论 :二乙酰基莲心碱对钠电流及L 型钙电流具有浓度依赖性阻滞作用 ,并可作用于钠通道的失活态 ,这些可以部分解释其抗心律失常作用机制。     

利多卡因对家兔左右心室外膜心肌细胞电不均一性的影响

目的:探讨利多卡因对家兔左、右心室心外膜心肌细胞动作电位和钠电流(INa)的影响,阐明利多卡因引起左、右心室心外膜心肌细胞电不均一性机制。方法:酶解法分离家兔单个左、右心室心外膜心肌细胞,全细胞膜片钳技术记录左、右心室心外膜心肌细胞动作电位和INa在应用利多卡因前后变化。结果:在电流钳制下,对照组中的左、右心室心外膜心肌细胞上记录动作电位都具有典型的0至4期的形态,2相平台期有心外膜心肌细胞特有的穹窿样凸起;但在利多卡因组,左、右心室心外膜心肌细胞动作均明显地失去2相平台期穹窿样凸起和高度,右室心外膜心肌细胞动作电位失去2相平台期立即复极,形似三角形,左、右心室心外膜心肌细胞动作电位的幅度(APA)和复极化50%和90%(APD50和APD90)均明显减少(P<0.05),且右室心外膜心肌细胞的APA和APD50以及APD90受利多卡因影响后减小最为严重(P<0.05或0.01)。通过电压钳制方式,利多卡因使左、右心室心外膜心肌细胞的INa在各个指令电位下明显减小,而且右室心外膜心肌细胞INa减小的幅度要显著强于左室心外膜心肌细胞INa的减小幅度,当钳制电压为-20mV时,左、右心室心外膜心肌细胞的INa分别由(62.1±4.5)和(54.2±2.9)减小为(40.8±3.2)和(26.5±2.1)(P<0.05或0.01)。利多卡因还使左、右心室心外膜心肌细胞INa的I-V曲线明显上抬,尤其是使右室心外膜心肌细胞INa的I-V曲线处在其他曲线最上面,同时引起左、右心室心外膜心肌细胞的INa电流密度的最大峰值由-20mV略向右偏为-10mV。结论:利多卡因可以引起左、右心室心外膜心肌细胞电不均一性,其可能原因是利多卡因对右室心外膜心肌细胞动作电位和INa的影响程度明显强于左室相同情况。     

溶血磷脂酸对豚鼠心肌细胞电压依赖性钾离子通道电流的作用

目的：观察溶血磷脂酸(LPA)对豚鼠心肌细胞电压依赖性钾离子通道电流的作用。方法：用膜片钳实验技术记录胶原酶急性分离的豚鼠心室肌细胞钾通道电流。结果：共记录了33个心室肌细胞的电压依赖性外向K+通道电流发现1.0 μmol•L^-1和10.0 μmol•L^-1 LPA可明显降低K+通道电流的幅值。 结论：LPA可能参与心肌梗塞时心律失常的发生。