瘢痕疙瘩RUNX3基因RH120480片段突变的研究

目的 探讨瘢痕疙瘩患者RUNX3基因RH120480片段突变的情况.方法 收集瘢痕疙瘩标本20例,设患者自身静脉血标本为正常对照,提取基因组DNA,PCR扩增RUNX3基因RH120480片段,采用变性高效液相色谱法对扩增片断进行基因变异检测,将不同类型的PCR片断进行全序列测定,测序结果与GeneBank比较.结果 DHPLC筛查血液样品均为单个色谱峰显示为纯合链;瘢痕疙瘩组织样品95%(19/20)为双峰显示有突变的异源双链存在.基因序列分析发现20例瘢痕组织DNA样本中,有19例突变,突变率为95%,发现2个突变位点,其中96位碱基A的缺失率为90%(18/20),对照组缺失率为10%(2/20);第279位碱基的C的插入突变率为95%(19/20),对照组缺失率为0%(0/20);两个突变位点的差异均具有统计学意义(P＜0.01).结论 RUNX3基因RH120480片段突变与瘢痕疙瘩的发生有关,RUNX3基因可能为一瘢痕抑制基因.     

瘢痕疙瘩人亚甲基四氢叶酸还原酶基因677及1298位点的突变

目的 探讨瘢痕疙瘩人亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因677及1298位点的突变,以及对瘢痕疙瘩形成的作用.方法 收集瘢痕疙瘩标本20例,设患者自身静脉血标本为正常对照,提取基因组DNA,PCR扩增MTHFR基因677及1298位点片段,DNA测序,将测序结果与人类基因库(GenBank)比较.结果 20例瘢痕疙瘩标本中有17例被检测出677位点基因突变,突变率为85.0 % ( 17 /20),有13例被检测出1298位点基因突变,突变率为65.0 % ( 13/20 ).突变类型主要为点突变、插入、缺失,为多位点、多类型,呈多态性.正常对照静脉血标本中均未检出突变.结论 MTHFR基因677及1298位点突变与瘢痕疙瘩的发生有关.     

瘢痕疙瘩TNF受体Ⅱ基因1573位点突变的研究

目的 探讨瘢痕疙瘩患者TNF受体Ⅱ(TNF receptor Ⅱ,TNFR-Ⅱ)基因1573位点突变的情况. 方法收集22例自愿捐献的经临床及病理确诊的瘢痕疙瘩标本,其中男6例,女16例;年龄18～53岁.设患者自身外周静脉血标本为正常对照.提取基因组DNA,PCR扩增TNFR-Ⅱ基因1573位点片段,DNA测序,将测序结果 与GeneBank比较.结果 实验提取DNA浓度均＞0.5 μg/μL,纯度(A260/A280)均＞1.5,经琼脂糖凝胶电泳检测,与所设计DNA片段大小相近,符合实验要求.13例瘢痕疙瘩标本检测示不同程度突变,突变率为59.1%;9例1663编码子发生点突变,,占总数的40.9%.与外周静脉血比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).突变类型主要为点突变、插入、缺失,为多位点、多类型,呈多态性. 结论 TNFR-Ⅱ基因1573位点突变与瘢痕疙瘩的发生有关.     

FEN1基因突变在狼疮性肾炎发病机制中的作用

目的 探讨FEN1基因突变在狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)患者发病机制中的作用.方法 收集43例LN患者和26例健康者的外周血标本,采用全血基因组DNA柱式试剂盒提取DNA,直接PCR方法扩增FEN1基因片段,扩增后PCR产物应用基因测序方法检测FEN1基因序列,并对测序结果与基因数据库中FEN1基因进行比较,搜索可能的突变位点.chi-square检验比较LN患者及健康者FEN1基因突变情况.结果 LN患者正向测序中存在946位碱基C缺失突变(p=0.046).结论 LN患者FEN1基因存在946位碱基C缺失突变.     

转化生长因子-β_1Ⅱ型受体基因在瘢痕疙瘩中改变的实验研究

目的通过检测瘢痕疙瘩中的转化生长因子-β1Ⅱ型受体(TβRⅡ)PolyA与CA重复序列两个基因突变热点的改变情况,论证瘢痕疙瘩是否与肿瘤具有相同的基因改变。方法选取瘢痕疙瘩标本20例、正常皮肤标本8例,提取标本中的DNA;在TβRⅡ基因PolyA位点和CA重复序列两个突变热点两侧设计并合成引物,利用PCR仪扩增,对PCR产物进行单链构象多态性分析(PCR-SSCP),PCR产物纯化后自动测序仪鉴定基因突变的位点和类型。结果PCR-SSCP显示,20例瘢痕疙瘩标本的TβRⅡPolyA位点有4例、CA重复序列有1例显示泳动条带较正常加快,且均缺失了1bp;基因测序发现,4例SSCP阳性的瘢痕疙瘩标本TβRⅡPolyA位点均出现一个A的缺失突变,正常皮肤基因序列正常;CA重复序列基因测序未见异常。结论瘢痕疙瘩组织中的TβRⅡPolyA和CA重复序列位点表现出类似肿瘤中所发现的基因缺失突变。     

转化生长因子-β1Ⅱ型受体基因在瘢痕疙瘩中改变的实验研究

目的通过检测瘢痕疙瘩中的转化生长因子-β1Ⅱ型受体（TβRⅡ）PolyA与CA重复序列两个基因突变热点的改变情况，论证瘢痕疙瘩是否与肿瘤具有相同的基因改变。方法选取瘢痕疙瘩标本20例、正常皮肤标本8例，提取标本中的DNA；在TβRⅡ基因PolyA位点和CA重复序列两个突变热点两侧设计并合成引物，利用PCR仪扩增，对PCR产物进行单链构象多态性分析（PCR—SSCP），PCR产物纯化后自动测序仪鉴定基因突变的位点和类型。结果PCR—SSCP显示，20例瘢痕疙瘩标本的TβRⅡPolyA位点有4例、CA重复序列有1例显示泳动条带较正常加快，且均缺失了1bp；基因测序发现，4例SSCP阳性的瘢痕疙瘩标本TβRⅡ PolyA位．点均出现一个A的缺失突变，正常皮肤基因序列正常；CA重复序列基因测序未见异常。结论瘢痕疙瘩组织中的TβRⅡ PolyA和CA重复序列位点表现出类似肿瘤中所发现的基因缺失突变。     

K-ras基因突变与结直肠癌临床病理因素的关系

目的 建立K-ras基因简单、快捷、经济的检测方法,并将检测结果与临床病理因素进行相关性分析.方法 采用PCR-直接测序法和聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性测序法(PCR-RFLP)同时检测40例结直肠癌肿瘤组织标本K-ras基因第12、13密码子突变情况;另113例患者仅用PCR-RFLP-测序法检测K-ras基因第12、13密码子突变情况.将K-ras基因突变检测结果与临床病理因素进行相关性分析.结果 40例结直肠癌患者的肿瘤组织经常规PCR扩增后直接测序无一例发现K-ras基因第12、13密码子的突变;而这40例标本经PCR-RFLP-测序法检测发现:8例含有K-ras基因第12密码子突变,3例含有K-ras基因第13密码子突变,总突变检出率为27.5%(11/40).153例结直肠癌肿瘤组织标本经PCR-RFLP-测序法检测共发现突变58例,突变率为37.9%(58/153),其中第12密码子突变46例,第13密码子突变12例.G→A是K-ras基因突变最常见的突变形式(25/58,43.1%).K-ras基因第12和13密码子突变与患者性别、肿瘤浸润深度、分化程度、与淋巴结转移、远处转移及分期无明显相关性(P＞0.05),与年龄、肿瘤发生部位密切相关(P＜0.05),年龄越大突变概率越低,突变最常发生的肿瘤部位为升结肠.结论 PCR-RFLP-测序法能够快捷、灵敏地检测出肿瘤组织中K-ras基因的突变,适合作为K-ras基因突变常规检测方法.K-ras基因第12和13密码子突变是结直肠癌中一个常见的分子事件,与患者年龄、肿瘤发生部位有相关性.     

胆固醇结石患者固醇携带蛋白2基因单核苷酸多态性的检测

目的:检测胆固醇结石患者和非胆石患者固醇携带蛋白2(SCP2)基因单核苷酸多态性(SNP),并探讨SNP与胆固醇结石的关系.方法:应用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染技术并结合DNA直接测序,检测了58例散发胆固醇结石病人和50例非胆石病人SCP2基因的部分启动子区、全部编码区及部分3,未翻译区序列.结果:SCP2基因第14外显子检出变异DNA单链泳动条带.58例散发胆固醇结石病人中共有31例检测出变异DNA单链泳动带,突变率为53.45%;而50例非胆石病人仅有7例检测到变异泳动带,突变率为14.00%;两组突变率差异有显著性(x2=20.123,P＜0.001).部分病例pCR产物直接测序发现G284→A碱基颠换,为同义突变.结论:SCP2基因 284位点突变不影响SCP2蛋白的结构和功能,但G284→A的基因型频率在胆固醇结石患者较非胆固醇结石病人为高,有一定的诊断参考价值.     

HBV基本核心启动子和前C区变异的深度测序分析

目的利用Ion Torrent PGM深度测序技术,探讨乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）阳性慢性乙型肝炎（CHB）患者乙型肝炎病毒（HBV）基本核心启动子和前C区突变特征。 方法收集HBeAg阳性CHB患者血清样本25例,提取HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV基本核心启动子和前C区片段,构建深度测序文库,基于Ion Torrent PGM平台深度测序,生物信息学分析突变位点及其突变率;构建HBV基本核心启动子和前C区突变型和野生型参考质粒,作为深度测序质控品。 结果在25例HBeAg阳性CHB患者HBV基本核心启动子和前C区检出流行率达20%的突变位点10个：G1746A、A1752G/T、T1753C/G、A1762T、G1764A、C1817G/A、T1825C/A、A1846T、G1896A、G1899A;G1746A和T1825C/A的流行率分别达92%和100%。突变位点在HBV B基因型和C基因型感染者的分布情况显示,A1752G/T和G1896A主要流行于B基因型感染者（63.6% vs 0.0%,χ² = 12.374、P = 0.0007;72.7% vs 28.6%,χ² = 4.812、P = 0.0472）,A1762T和G1764A主要流行于C基因型感染者（27.3% vs 78.6%,χ² = 6.579,P = 0.0172）;C基因型感染者A1762T/G1764A突变率显著高于B基因型感染者,但差异无统计学意义（25.7% ± 28.4% vs 68.4% ± 42.7%,t = 1.614、P = 0.1326）。25例HBeAg阳性CHB患者中,32.0%患者仅有A1762T/G1764A突变,24.0%患者仅有G1896A突变,24.0%患者同时携带A1762T/G1764A和G1896A突变。 结论深度测序分析可用于定量检测HBV基本核心启动子和前C区突变,为HBV突变研究的临床应用提供了技术平台。     

pSIREN-survivin/shRNA表达载体的构建与鉴定

目的：构建pSIREN-survivin/shRNA重组质粒并鉴定, 为探索瘢痕疙瘩基因治疗的RNA干扰（RNAi）途径奠定基础。 方法：根据基因库survivin cDNA序列及Reynolds设计原则, 设计并合成两端有酶切位点的65个碱基的寡核苷酸链, 退火成互补双链后用T4DNA酶克隆至线性化的RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中; 转化大肠杆菌DH-5a菌株, 提取质粒行酶切鉴定, 测序分析。 结果：PCR扩增片断出现465 bp大小的目的基因条带与预期结果相符; 双酶切见约65 bp目的基因条带; 插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。 结论：成功构建重组质粒pSIREN-survivin/shRNA, 为下一步用脂质体转染瘢痕或肿瘤细胞的研究奠定基础。     

单发性与多发性瘢痕疙瘩转化生长因子-β1Ⅱ型受体Poly A位点基因突变研究

目的 检测瘢痕疙瘩组织转化生长因子-β1 Ⅱ型受体（transforming growth factor-β1 receptorⅡ，TβR Ⅱ）PolyA位点基因突变情况，探讨单发性与多发性瘢痕疙瘩发病机制差异。方法 瘢痕疙瘩标本20例，单发性14例，多发性6例，提取组织中DNA；在TβR Ⅱ基因PolyA位点两侧设计并合成引物，利用PCR仪扩增-TβRⅡ DNA；对PCR产物进行单链构象多态性分析（PCR—SSCP）；PCR产物纯化后，利用自动测序仪鉴定基因突变的类型。结果 瘢痕疙瘩组织中TβR ⅡR PolyA位点表现出基因缺失突变，其阳性率多发性瘢痕疙瘩为50％（3／6），单发性瘢痕疙瘩为7．1％（1／14），二者差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 多发性与单发性瘢痕疙瘩发病机制可能不同。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变的研究

目的　探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞中 p5 3基因第 4～ 8外显子的突变规律及其意义。　方法　取瘢痕患者手术切除的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕标本各 12例 ,并设患者自身正常皮肤标本及血标本为对照。体外分离、培养上述组织标本的成纤维细胞。采用聚合酶链式反应 单链构象多态性(PCR SSCP)分析方法和基因测序法 ,检测各种组织成纤维细胞中p5 3基因的突变情况。　 结果　 12例瘢痕疙瘩标本中有 9例p5 3基因外显子 4、5、6、7出现点突变和移码突变 ,增生性瘢痕标本、正常皮肤标本及血标本中均未检出突变。　结论　p5 3基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。     

肾透明细胞癌中VHL基因突变与缺氧诱导因子-1α表达的研究

目的　探讨肾透明细胞癌VHL基因突变与缺氧诱导因子 1α(HIF 1α)表达的关系及意义。方法　应用聚合酶链反应 (PCR)、变性高效液相色谱 (DHPLC)、基因测序及免疫组织化学方法检测 32例肾透明细胞癌患者手术切除癌组织及远离肿瘤的正常肾脏组织中VHL基因突变及HIF 1α的表达。结果　 32例患者中 17例 (5 3 1% )癌组织术前有VHL基因突变 ,32例远离肿瘤的正常肾脏组织均无HIF 1α表达 ;17例VHL突变的癌组织中 12例 (70 6 % )有HIF 1α表达 ,15例无VHL突变的癌组织中 4例 (2 6 7% )有HIF 1α表达 ,二者相比差异有显著意义 (P <0 0 5 )。结论　VHL基因在肾透明细胞癌中具有高频突变率 ,HIF 1α在癌组织中的表达与VHL基因突变相关     

中国汉族深静脉血栓形成患者与组织因子途径抑制物基因多态性的关系

目的探讨组织因子途径抑制物(TFPI)基因变异与中国汉族深静脉血栓形成(DVT)患者的相关性。方法采用聚合酶链反应单链构象多态性分析及DNA测序,对62例DVT患者和50例正常汉族人进行TFPI基因序列分析。结果8号内含子中发现一个C/T多态位点,等位基因频率为86.6%和13.4%,病例组与对照组比较无统计学差异;5号内含子41位发现一个单碱基“G”插入,病例组中有4例(6.5%)与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论TFPI基因可能不是中国汉族人DVT的主易感基因;5号内含子中单核苷酸“G”插入有深入研究价值。     

瘢痕疙瘩Fas基因外显子6,8,9的突变分析

目的：研究瘢痕疙瘩Fas基因中外显子6，8，9的突变情况，了解该基因突变与瘢痕疙瘩形成之间的关系。方法：实验分正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织三组，采用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性)方法筛选突变，然后进行序列分析以确定突变。结果：经银染SSCP分析，在23例瘢痕疙瘩标本中，出现异常电泳带的有18例，经测序，外显子6，8，9突变分别有8例、12例和7例，6和8同时存在突变的有2例，6和9同时存在突变的有3例，8和9同时存在突变的有2例，三个外显子同时有突变的有l例，而且发现了新的突变，在正常皮肤组织和增生性瘢痕组织中均未检出突变。结论：瘢痕疙瘩组织中Fas基因的突变可能与该病的发生有密切关系；PCR-SSCP是检测基因点突变的一种快速、敏感、有效的方法。     

Novel uromodulin mutation in familial juvenile hyperuricemic nephropathy

Background: Familial juvenile hyperuricemic nephropathy (FJHN) is an autosomal dominant disorder characterized by early onset of hyperuricemia, decreased fractional renal urate excretion and progressive interstitial nephropathy. Mutations in the uromodulin (UMOD) gene encoding uromodulin/Tamm-Horsfall, a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein, cause this disease. Methods: One Chinese family with 13 FJHN-affected individuals is described. Clinical data, blood and urine samples of 7 affected members (all alive patients in this family) and 15 unaffected members were collected. Mutation analysis of the UMOD gene was performed by polymerase chain reaction and direct sequencing. Urinary uromodulin from affected or unaffected members of this family and healthy controls was examined by enzyme-linked immunosorbent assay kit. Expression of uromodulin in renal tissue was shown with immunofluorescence. Results: A novel mutation (p.T605G) within the uromodulin GPI anchor signal segment was identified in the affected individuals of this FJHN family. There was a markedly increased expression of uromodulin in renal tissue and significantly decreased urinary excretion of uromodulin in affected patients with an estimated glomerular filtration rate <60 ml/min/1.73 m(2). Conclusions: The present study reported a novel mutation in exon 9 of UMOD in the Chinese Han population, within the GPI anchor signal segment of uromodulin. Since the GPI anchor is linked with the release or secretion of proteins, our finding may provide further evidence for the underlying mechanism of decreased urinary excretion of uromodulin in FJHN.     

Genetic susceptibility to keloid disease: mutation screening of the TGFbeta3 gene.

Keloid disease (KD) is a fibroproliferative dermal tumour of unknown aetiology. The increased familial clustering in KD, its increased prevalence in certain races and its presence in identical twins suggest a strong genetic predisposition to keloid formation. Transforming growth factor beta isoforms (TGFbeta) play a central role in wound healing and fibrosis and have been implicated in KD pathogenesis. Recent data has suggested that TGFbeta(3) has an important role in scar formation. There is little known about the genetic variation present within the TGFbeta(3) gene, which contains seven exons and six introns spanning 43,000 base pairs of the human genome. Exons one to seven and the promoter region (1000 bp upstream from exon 1 in the 5'-flanking regions) were screened in 95 Caucasian KD cases and 95 Caucasian controls for the presence of novel mutations using a high throughput DHPLC mutation detection technology. There were no mutations identified in any of the exonic regions, however, multiple nondisease associated mutations were found in the promoter region of the TGFbeta(3) gene. These data demonstrate that there is no association between the exonic and promoter regions of TGFbeta(3) gene and keloid scarring in our cohort of Caucasian patients.     

Phenotype analysis of 9 cases with mutations in PKHD1 gene

Objective To summarize the clinical features of 9 cases with mutations in PKHD1 gene for a better understanding of its phenotype. Methods Clinical data of nine cases with mutations in PKHD1 gene were summarized from January 2011 to December 2016 in our center, including clinical manifestations, laboratory findings, imaging data and family investigation. Next generation sequencing was used to screen 4000 genes in case 1 to 4 and whole exons in case 5 to 9. Significant variants detected by next generation sequencing were confirmed by conventional Sanger sequencing. Segregation analysis was performed using parental DNA samples. Relevant literature was reviewed. Results Among these 9 cases, 5 are male, 4 are female. The average age of onset was 2.6 years old (ranging from 0.5-5.2 years). Renal ultrasound revealed that all 9 cases had cysts in bilateral kidney, 7 cases with enlarged kidney, 1 case with normal size kidney, 1 case with normal size kidney, and 1 case with bilateral renal atrophy. Two cases with renal artery stenosis, 1 case with focal narrowing in left main branch and 1 case with vesico-ureteral reflux were found. Among the 9 cases, 3 cases had homozygous mutations, and 6 cases had compound heterozygous mutations, including 1 nonsense mutation, 1 frameshift mutation and 15 missense mutations. There were 2 cases with 3 heterozygous mutations, 2 c.5935C＞T mutations and 2 cases with C. 5869G＞A mutations. A total of 10 new mutations were identified. Conclusion Patients with mutations in the PKHD1 gene had normal size kidney, or even atrophic kidney. Renal artery stenosis, vesicoureteral reflux and bronchial stenosis were all first reported in patients with mutations in PKHD1 gene. The novel mutations, c.274C＞T, c.9059T＞C, c.8996delG, c.281C＞T, c.10424T＞A, c.7092T＞G, c.4949T＞C, c.5869G＞A, c.6197A＞G and c.1877A＞G further expanded the mutation spectrum of PKHD1 gene.