我国登革2型病毒43株PrM—E基因的构建及其在哺乳动 …

目的：构建我国登革２型病毒４３株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法;采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术的构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ的信号肽序列,完整的ＰｒＭ蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％,Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。     

我国两株登革2型病毒分离株结构蛋白C,PrM（M）,E和非结构…

对我国两株登革２型病毒分离株的结构蛋白Ｃ，ＰｒＭ（Ｍ），Ｅ和非结构蛋白ＮＳ１基因的核苷酸及相应的氨基酸序列进行分析，并与国外登革２型毒株的核苷酸序列同源性、碱基组成、糖基化位点、半胱氨酸残基、蛋白裂解位点和疏水剖面图等进行了比较分析。结果发现Ｄ２－４３和Ｄ２－０４株Ｃ－ＮＳ１基因的读码框架基本相同，均由３３８１个核苷酸组成，编码氨基酸总数为１１２７，糖基化位点和保守的半胱氨酸残基的数目和位置均相同     

我国两株登革2型病毒分离株结构蛋白C，PrM（M），E和非结构蛋白NS1基因变化的研究

对我国两株登革２型病毒分离株的结构蛋白Ｃ，ＰｒＭ（Ｍ），Ｅ和非结构公白ＮＳ１基目的核苷酸及相应的氯基酸序列进行分析，并与国外登革２型毒株的核苷酸序列同源性、碱基组成、糖基化位点、半胱氨酸残基、蛋白裂解位点和疏水剖面图等进行了比较分析。结果发现Ｄ２－４３和Ｄ２－０４株Ｃ—ＮＳ１基因的读码柜架基本相同，均由３３８１个核苷酸组成，编码氧基酸总为为１１２７，糖基化位点和保守的半胱氯酸残基的数目和位置均相同，但也发现两株之间存在一定的差异，它们的核苷酸序列同源性只有９３名％，氨基酸列的类似性为９１．３％。进一步对两个毒株各个蛋白的基囚分别进行比较，发现Ｃ和Ｅ基因同源性为９５％—９７％，ＮＳ１基因同源性为９２．２％，唯有ＰｒＭ（Ｍ）基目差异较大，同源性只有８６．７％。两株之间的主要差别在于ＰｒＭ（Ｍ）基目的变化。当与国外其他登革２型毒株比较时，发现存在两个可变序列，其中１５１—２９４位恰好是ＰｒＭ（Ｍ）区，与两株之间比较的结果一致。     

我国登革2型病毒株E蛋白B抗原区基因的表达与鉴定

目的和方法：通过对登革２型病毒Ｅ蛋白Ｂ区基因片段的表达,研究Ｂ区蛋白的抗原性。首先采用ＰＣＲ方法扩增了编码Ｂ区蛋白的基因片段,并将其插入到ｐＭａｌ－Ｃ２原核载体进行融合表达。采用蛋白质印迹法和ＥＬＩＳＡ法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：在构建的重组质粒Ｂ１６５－ｐＭａｌ中,Ｅ蛋白Ｂ区与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因以融合形式高效表达。该融合蛋白可与登革１￣４型病毒的鼠腹水抗体起特异反     

我国三株登革2型病毒基因组全序列的测定及系统发生树分析

目的：测定我国３株登革２型病毒（ｄｅｎｇｕｅ２ｖｉｒｕｓ,ＤＥＮ２）流行株的全序列并确定其基因型。方法：运用ＲＴ－ＰＣＲ和５′,３′ＲＡＣＥ法测定我国３株登革 全序列,采用邻结法绘制系统发生树。：ＤＥＮ２－０４、４３、４４株的核苷酸及氨基酸差异分布于整个序列之中,ＤＥＮ２－０４与ＤＥＮ２－４３、４４共有２１个氨基酸位点的差异引起极性或电荷变化。ＤＥＮ２－０４株与ＪＡＭ株、越南分离株和泰国分离株同为     

我国登革2型病毒prM-E基因与SFV病毒载体重组RNA的构建

目的：构建我国登革２型病毒４３株ｐｒＭ－Ｅ基因的甲病毒（Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ,ＳＦＶ）重组ＲＮＡ,为登革新型疫苗的研究奠定基础。方法：首先将含有多种稀有限制酶位点的接头插入ｐＳＦＶ载体的多克隆位点,再把ｐｒＭ－Ｅ基因克隆至该载体中。将获得的重组质粒ＤＮＡ经体外转录后,通过电穿孔法将其转录的ＲＮＡ产物导入宿主细胞,并采用间接免疫荧光法检测ｐｒＭ－Ｅ基因的表达。结果：已获得含多种酶位点的ｐＳＦＶ病毒载体,并且所构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ,在宿主细胞中的表达产物可与登革２型病毒特异抗体起反应。结论：构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ可表达我国登革２型病毒株的特异蛋白。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合基因,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ 技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ 片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３ 中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－ ）中,转染细胞经选择培养基筛选,并采用ＭＴＸ加压扩增培养。结果：得到了高效表达融合蛋白的细胞株,表达水平为３００ Ｕ／（１０６ 细胞·ｄ）。通过ＥＬＩＳＡ 和溶解圈方法鉴定,该融合蛋白可与Ｄ－二聚体结合,并具有激活纤溶酶原溶解纤维蛋白的活性。结论：成功构建并获得高效表达双功能融合蛋白的细胞株,为进一步研究这一双功能融合蛋白的体内外特异溶栓活性以及评价其作为新型导向溶栓制剂奠定了基础。     

DNA错配修复基因MutS的克隆和表达

目的：克隆ＭｕｔＳ基因并构建高效表达菌株，为建立ＤＮＡ错配突变检测系统和应用于临床肿瘤的检测等打下重要的基础。方法与结果：通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组中扩增得到ＭｕｔＳ基因（２．６ｋｂ），克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，构建了重组质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ／ＭｕｔＳ，核酸序列分析表明所克隆的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ的ＭｕｔＳ一致。然后亚克隆到原核表达载体ｐＢＶ２２０上，构建了重组菌株ＤＨ５α／ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ，４２℃热诱导表达ＭｕｔＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在相对分子质量９７×１０３左右处出现一条表达量高达３０％以上的表达蛋白带，而对照菌株表达量很低。将重组质粒ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ转化到ＭｕｔＳ缺陷菌株ＥＳ１３０１互补了该菌株ＭｕｔＳ的缺陷，使其链霉素、利福平抗性（Ｓｔｒｒ，Ｒｉｆｒ）的突变频率分别降低９９％、９６％。结论：克隆得到ＭｕｔＳ基因并在大肠杆菌中得到高效表达，表达的ＭｕｔＳ蛋白在菌体内具有生物学功能     

登革2型病毒NS3基因的扩增及序列测定

采用热酚法从登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２ ４３） 感染的Ｃ６／３６ 细胞中提取了病毒ＲＮＡ,以病毒ＲＮＡ 为模板,进行Ｄ２ ４３ 株ＮＳ３ 基因ｃＤＮＡ 片段的反转录 ＰＣＲ 扩增,片段长度为１１７６ ｂｐ。将扩增的ｃＤＮＡ 片段克隆到Ｔ 载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｋｓⅡ（ ＋ ） 中。通过双脱氧法测定了ｃＤＮＡ片段序列,与国际标准株ＮＧＣ株序列一致。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体—低分子量尿激酶融合蛋白在？…

目的;构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合蛋白,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质中粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株中,转染细胞经选择培养基筛选。     

炭疽保护性抗原第四结构域基因在重组SFV复制子载体中的表达

目的：构建炭疽毒素保护性抗原第四结构域PA4基因的重组Semliki森林病毒（Semliki forest virus，SFV）复制子载体，并观察PA4抗原在重组SFV复制子载体中的表达。方法：将PA4基因克隆到基于RNA和DNA的SFV复制子表达载体中，获得的重组SFV复制子载体直接转染．BHK21细胞，通过间接免疫荧光和Western印迹试验检测PA4在细胞中的表达；与辅助病毒载体共转染制备重组病毒颗粒，通过间接免疫荧光和Western印迹检测PA4在重组病毒颗粒感染细胞中的表达。结果与结论：成功地构建了基于RNA和DNA的PA4重组SFV复制子载体，并且在体外基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体能够在细胞中有效地表达非分泌型和分泌型的PA4抗原，制备了具有感染能力并能表达PA4抗原的重组病毒颗粒，为进一步以SFV复制子作疫苗载体观察炭疽新型复制子疫苗的免疫原性奠定了基础。     

登革2型病毒PrM基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用

目的 :将我国登革 2型病毒PrM(D2 _PrM)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒。再将经激活的重组病毒感染宿主细胞 ,分别用不同型登革病毒攻击 ,然后通过免疫荧光法 ,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用。结果 :含登革 2型正、反义PrM基因的重组甲病毒 ,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制 ,而且对其他 3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用。含反义PrM基因的重组病毒对 4个型登革病毒复制的抑制作用最强。结论 :登革 2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒 ,可介导对登革 1～ 4型病毒复制的特异抑制作用     

人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定

为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70（HSP70）的基因，以质粒为模板，采用PCR方法进行扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1.96kb的片段；回收片段经T－A克隆法克隆到pUCm-T载体上，并进行DNA测序；将目的基因片段从pUCm-T载体上酶切后，亚克隆到表达载体pET-21a( )上，将重组质粒pET-21a( )/HSP转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，收集细菌，菌体裂解后进行SDS－PAGE及Western blot检测。结果表明，应用PCR方法扩增出约1.96kb的目的片段，序列测定结果证实，扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70 cDNA序列一致；经EcoR I Xho I酶切及PCR鉴定证实，HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-21a( )上，转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，进行SDS－PAGE，发现在分子量为72000处有表达量明显增多的蛋白条带，Western blot证实其为目的的条带。表明在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70基因。     

登革病毒C基因突变对病毒RNA复制的影响

目的：分析C基因及其编码蛋白突变对登革病毒RNA复制的影响。方法：利用融合PCR方法在登革病毒复制子中引入C基因相应部位的缺失突变,将复制子RNA转染细胞后,利用报告基因活性分析、间接免疫荧光及实时定量PCR等方法分析其复制水平。结果：获得了含有不同α螺旋缺失突变的C基因的复制子质粒,并发现△α1复制子复制水平明显下降。结论：登革病毒C蛋白α1螺旋或其编码序列对病毒RNA复制具有重要作用。     

我国两株森林脑炎病毒的生物学性质及E蛋白基因核苷酸序列的比较

目的：比较我国1953年从患者脑组织分离的森张株和2001年从患者血清中分离的MDJ01株森林脑炎病毒(TBE)的生物学特性及E蛋白基因核苷酸序列的变化，分析TBE病毒E蛋白基因的变化与功能的关系，从分子水平上探讨我国TBE的传播、流行规律及致病机制。方法：两株病毒同时接种乳鼠和，BHK／21细胞，观察两株病毒对乳鼠和BHK／2l细胞的致病性；从两株病毒感染的BHK／2l细胞中提取病毒的RNA，对E蛋白基因进行RT-PCIR扩增，扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接，分别进行克隆测序。结果：森张株对乳鼠和BHK／21的致病性均比MDJ01株明显；两株病毒E蛋白基因长为l488nt，编码496个氨基酸，核苷酸的变异为33个，导致了2个氨基酸的变化，第一个氨基酸的变异发生在113位(MDJ01株由Ⅰ变成Ⅴ)，第二个氨基酸的变异发生在163位(MDJ01由P变成A)，两株病毒核苷酸序列的同源性为97．8％，推测的氨基酸序列的同源性为99．6％。与国外远东株比较，森张株核苷酸序列的同源性稍高于MDJ01株，与欧洲株、西伯利亚株的同源性基本一致。结论：新分离株MDJ01对细胞和乳鼠的致病性稍低于1953年分离的森张株，E蛋白基因的核苷酸序列分析表明两株病毒同属于远东亚型，推测MDJ01株可能是由森张株在自然界长期演变而来。     

东部马脑炎病毒E2基因的表达及DNA免疫的初步研究

目的：构建东部马脑炎病毒E2基因的重组真核表达载体，对其DNA免疫原性进行观察。方法：采用RT-PCR扩增东部马脑炎病毒全长E2基因，构建真核表达载体pcDNA-E2，以脂质体法转染COS7细胞，经蛋白印迹法和免疫荧光法证明E2基因可以表达后，用庐重组质粒DNA免疫Balb/c小鼠，并用免疫荧光法检测鼠血清中病毒的特异抗体。结果：免疫印迹法、免疫荧光法检测表明E2基因在COS7细胞中获得瞬时表达，pcDNA-E2基因免疫小鼠可产生抗东部脑炎病毒的特异抗体。结论：东部马脑炎病毒E2基因的重组质粒DNA可刺激小鼠产生特异性的抗东部马脑炎病毒体液免疫应答，为基因疫苗的研制奠定了基础。     

登革2型病毒43株NS1基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的：研究含登革2型病毒43株（D2－43）NS1基因的重组质粒DNA在幼地鼠肾细胞BHK－21的表达。方法：将含信号肽的NS1基因片段插入到pcDNA3．1的KpnⅠ位点和EcolRⅠ位点之间,获得重组表达载体pcDNA-NS1。用电穿孔法将其导入BHK－21细胞,G418选择培养。挑取单细胞克隆,RT－PCR及蛋白质印迹法鉴定NS1基因的稳定表达,结果：在随机挑取的5个单细胞克隆中,有4个克隆的RT－PCR鉴定为阳性,蛋白质印迹结果表明NS1基因获表达。结论：构建的pcDNA-NS1质粒在BHK－21细胞中有稳定表达,因此含NS1基因的该重质粒DNA可作作核酸免疫。     

基于N蛋白稳定表达细胞株的SARS-CoV间接免疫荧光检测方法的建立

目的:建立基于SARS-CoV N蛋白稳定表达细胞系的间接免疫荧光法,以在普通实验室对SARS-CoV特异抗体进行检测.方法:将含有SARS-CoV N基因的重组质粒通过脂质体转染BHK-21细胞,筛选稳定表达细胞系并制备间接免疫荧光抗原片,以鼠抗SARS血清进行检测,并以其他呼吸道病毒抗体评估其特异性.结果与结论:建立了可检测SARS-CoV抗体的基于SARS-CoV N蛋白稳定表达重组细胞系的间接免疫荧光法,检测其他呼吸道病毒抗体为阴性,特异性良好.该间接免疫荧光法为SARS-CoV抗体的普通实验室检测提供了快速安全的诊断方法.