NK-1受体拮抗剂对Ishikawa细胞抑制作用的研究

目的:探讨NK-1受体拮抗剂对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡、细胞周期及侵袭影响。方法:体外培养子宫内膜腺癌Ishikawa细胞,将不同浓度NK-1受体拮抗剂与其共培养48h后,采用MTT法检测Ishikawa细胞增殖情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期分布;利用Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果:NK-1受体拮抗剂可明显抑制Ishikawa细胞增殖(P0.05);促进细胞凋亡,使细胞周期中G0/G1期比例增加,S期及G2/M期比例降低(P均0.05);抑制细胞侵袭,并且其对Ishikawa细胞的这些作用均呈剂量依赖性。结论:NK-1受体拮抗剂可明显抑制子宫内膜癌细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导凋亡及抑制侵袭,有望成为子宫内膜细胞治疗的新途径。     

GPER抑制剂PTX对雌激素作用下子宫内膜癌细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨G蛋白偶联雌激素受体(GPER)抑制剂百日咳毒素(PTX)对17β-雌二醇(E2)作用下子宫内膜癌系ER阳性的Ishikawa及ER低表达的HEC-1A的细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,初步探讨阻断GPER介导的信号传导通路治疗子宫内膜癌的可行性。方法:选取对数生长的细胞随机分为空白对照组(不加任何试剂)、阴性对照组(加10-6mol/L E2)和实验组(10-6mol/L E2+PTX)。应用四甲基亚唑蓝(MTT)法、流式细胞术观察PTX对E2作用下的子宫内膜癌的细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果:(1)随着E2浓度的增加和作用时间的延长,子宫内膜癌Ishikawa细胞在490nm处光密度值增大。E2对Ishikawa细胞具有促增殖作用,且呈时间和浓度依赖性(P均<0.001),而对HEC-1A的细胞增殖作用不显著(P=0.393),各浓度之间差异均无统计学意义(P=0.137)。不同浓度E2作用48h后,Ishikawa细胞G0～G1期比例减少(P=0.001),S期比例增多(P=0.002),HEC-1A变化不显著。(2)随着PTX浓度增加及时间延长,两种细胞增殖能力逐渐下降并呈时间和浓度依赖性(P均<0.001);不同浓度PTX作用48h后,两种细胞的凋亡率、G0～G1比例均升高(P<0.001,P<0.05),S期比例在Ishikawa细胞无显著变化,在HEC-1A细胞降低,G2～M期比例在Ishikawa细胞降低,在HEC-1A细胞无显著变化。结论:PTX可以抑制E2对子宫内膜癌细胞的促增殖作用,促使其发生凋亡,抑制细胞周期进展。GPER介导的信号传导通路可能成为治疗子宫内膜癌的新靶点。     

吉非替尼对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Gefitinib)对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其内在作用机制。方法:MTT法检测不同浓度吉非替尼作用后细胞的增殖抑制率。采用流式细胞术检测吉非替尼作用48h后的细胞凋亡率及细胞周期分布,并用倒置显微镜对细胞进行形态学观察。Western blot法检测不同浓度吉非替尼作用细胞48h后细胞内p-Akt、CyclinD1蛋白水平表达的变化。结果:吉非替尼能显著抑制Ishikawa细胞的增殖,促进细胞凋亡,且呈时间-剂量依赖性(P0.05),并使细胞周期中G0/G1期比例升高(P0.05),而对S期和G2/M期比例无明显影响(P0.05)。吉非替尼作用48h后,Ishikawa细胞中p-Akt、CyclinD1蛋白表达随着吉非替尼浓度的增加逐渐下降(P0.05)。结论:吉非替尼对人子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外生长具有明显的抑制作用,并能诱导Ishikawa的凋亡,导致G0/G1期细胞阻滞,其分子机制可能与吉非替尼下调p-Akt蛋白及CyclinD1蛋白的表达有关。     

17β-雌二醇对人子宫内膜癌细胞的增殖及P21ras和p-Erk表达的研究

目的:探讨17β-雌二醇(E2)对人子宫内膜腺癌雌激素受体(ER)阳性的Ishikawa和ER阴性的HEC-1A细胞增殖,细胞周期及其对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路相关蛋白P21ras和p-Erk表达的影响及意义。方法:用MTT法,流式细胞技术检测不同浓度E2作用Ishikawa和HEC-1A细胞不同时间的细胞吸光度值及细胞周期,用免疫细胞化学法检测上述细胞中P21ras和p-Erk的表达。结果:随E2浓度增加,Ishikawa细胞吸光度值上升并呈时间依赖性(P<0.01),G0～G1期比例下降(P<0.01),S期比例升高(P<0.01);HEC-1A细胞吸光度值及细胞周期无明显变化(P>0.05);10-6mol/LE2作用于Ishikawa细胞30min时,P21ras和p-Erk活化表达最强,作用于HEC-1A细胞15min时,P21ras和p-Erk即有明显表达而且达高峰,随着E2浓度增加两种细胞中P21ras和p-Erk表达均逐渐增加,呈浓度依赖性。结论:E2可促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖和周期进展,而且可以促进Ishikawa和HEC-1A中P21ras和p-Erk表达增加。     

子宫内膜癌细胞雌激素受体亚型的调控和功能的初步研究

目的初步建立子宫内膜癌雌激素受体（ER）亚型α或β弱表达的细胞模型,研究雌激素及他莫昔芬（TAM）与ER亚型的关系。方法分别设计针对ERα和ERβ的反义寡脱氧核苷酸（ODN）、正义ODN、错义ODN,并转染子宫内膜癌细胞株Ishikawa,将Ishikawa细胞分为4组,即未转染组、反义ODN组、正义ODN组及错义ODN组。蛋白印迹法测定转染后细胞ERα和ERβ蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染ODN后,17β雌二醇和TAM对Ishikawa细胞生长的影响。结果（1）分别针对ERα及ERβ的反义ODN可以选择性下调转染的Ishikawa细胞中ERα及ERβ蛋白的表达（分别下调45％和54％）。（2）17β雌二醇及TAM可以促进未转染组Ishikawa细胞的生长。转染ERα反义ODN后,可抑制17β雌二醇及TAM对Ishikawa细胞的促生长作用,以转染后的24、48及72h为著,反义ODN组各时间点分别与未转染、正义ODN、错义ODN组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（3）转染ERβ反义ODN后,17β雌二醇对Ishikawa细胞的促生长作用的改变不明显。转染ERβ反义ODN可抑制TAM对Ishikawa细胞的促生长作用,以转染后72h为著,反义ODN组分别与未转染、正义ODN、错义ODN组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论（1）反义核酸技术能够特异性地有效下调Ishikawa细胞中ERα和ERβ蛋白的表达,其可作为子宫内膜癌细胞中ER调控的一种有效的实验手段。（2）17β雌二醇促进子宫内膜癌细胞生长的作用主要通过ERβ介导;ERβ和ERβ均参与TAM促进子宫内膜癌细胞生长的作用。     

雌、孕激素对子宫内膜癌细胞株Ishikawa体外生长的影响

目的探讨雌激素(17β-雌二醇,E2)、孕激素(P)及其不同配伍对子宫内膜癌Ishikawa细胞体外生长的影响,为临床子宫内膜癌患者术后激素补充治疗(HRT)提供理论依据。方法体外培养人子宫内膜癌Ishikawa细胞株。实验组分别加入不同浓度E2(E2组)、P(P组)及二者不同浓度配伍(E2+P组);对照组加入0.01%乙醇。观察细胞形态变化;测定细胞的增殖、凋亡和细胞周期变化。结果 Ishikawa细胞吸光度(A值)及增殖促进率均随E2浓度的增加呈逐渐上升趋势。E2浓度增至10-8～10-6mol/L,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。相反,P和E2+P两组均随P浓度的增加,对Ishikawa细胞增殖抑制率逐渐升高(P0.05,P0.01)。E2终浓度增至10-6mol/L,P终浓度10-5及0.5×10-4mol/L时,差异有统计学意义(P0.05)。对照组Ishikawa细胞大多处于G0/G1期。经E2、P作用后,细胞周期发生改变,E2组S期细胞比例上升,凋亡率下降(P0.01);P组和E2+P组G0/G1期细胞比例上升,S期比例下降,凋亡率上升。E2组Ishikawa细胞数量增多,核分裂相多见。P组和E2+P组则见Ishikawa细胞数目减少,细胞明显皱缩,体积变小,凋亡小体多见。结论 E2对Ishikawa细胞有促增殖、抗凋亡作用;P则抑制Ishikawa细胞增殖,并诱导其凋亡;E2+P是否具有抑制细胞增殖并诱导凋亡的作用与E2和P具体配伍浓度有关;合理的E2+P配伍不促进Ishikawa细胞的增殖。     

华蟾素对子宫内膜癌Ishikawa细胞RRM2表达的影响和意义

目的:探讨华蟾素对体外培养的子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、侵袭力及其对RRM2表达的影响和意义。方法:体外培养Ishikawa细胞,经不同浓度华蟾素干预后,用RT-PCR及Western blot分别检测RRM2在mRNA及蛋白水平上的表达,用MTT法检测处理前后细胞的增殖,transwell小室分析细胞体外的侵袭力。结果:华蟾素能显著减少RRM2在mRNA及蛋白水平的表达,有效地抑制Ishikawa细胞增殖,降低侵袭力,研究证实华蟾素终浓度3.0mg/ml是最佳抑制浓度,对照组Ishikawa细胞组则无上述效应。结论:华蟾素可明显降低Ishikawa细胞中RRM2表达,抑制细胞增殖,降低细胞侵袭力。     

半枝莲体外抗子宫内膜癌活性的研究

目的:研究半枝莲不同极性部位体外抗子宫内膜癌细胞Ishikawa的活性作用。方法:采用MTT法检测半枝莲不同极性部位对子宫内膜癌细胞Ishikawa的增殖抑制作用;采用平板克隆形成实验检测活性最强部位对Ishikawa细胞克隆形成能力的影响;应用流式细胞仪检测活性最强部位对Ishikawa细胞周期分布的影响。结果:半枝莲不同极性部位对子宫内膜癌细胞Ishikawa均有不同程度的抑制作用,其中氯仿部位的抑制作用最强(IC50=146.494μg/ml)。随着供试药物浓度的升高,细胞克隆形成能力降低;半枝莲氯仿部位对Ishikawa细胞表现为S期、G2/M期阻滞作用。结论:半枝莲氯仿部位是半枝莲抗子宫内膜癌细胞Ishikawa的最主要有效部位。     

EGFR抑制剂AG1478对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化的影响

目的:研究表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂AG1478对子宫内膜癌细胞增殖和上皮-间质转化的影响。方法:蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白E-cadherin、α-catenin,间质标记蛋白N-cadherin、vimentin及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平。MTT法检测不同浓度AG1478对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。蛋白印迹法检测AG1478对子宫内膜癌细胞E-cadherin、α-catenin,N-cadherin、vimentin及MMP-9、MMP-2蛋白表达水平的影响。体外迁移实验检测AG1478对子宫内膜癌细胞迁移能力的影响。结果:(1)EGFR过表达可下调子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白并上调间质标记蛋白及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平(P<0.05)。(2)AG1478对两种子宫内膜癌细胞均有增殖抑制作用,以经转染稳定过表达EGFR的Ishikawa细胞更为敏感(P<0.05)。(3)AG1478上调子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白并下调间质标记蛋白及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平,以转染EGFR的Ishikawa细胞变化更为显著(P<0.05)。(4)AG1478可减弱子宫内膜癌细胞的迁移能力,以过表达EGFR的Ishikawa细胞更为明显(P<0.05)。结论:EGFR抑制剂AG1478可有效地抑制子宫内膜癌细胞增殖和上皮-间质转化。     

他莫昔芬对人子宫内膜癌细胞增殖及细胞内钙的影响

目的探讨他莫昔芬（Tamoxifen,TAM）对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞周期及细胞内Ca^2＋的影响。方法利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定TAM对细胞增殖量效的影响;采用流式细胞仪检测TAM对Ishikawa细胞周期的影响;应用激光共聚焦显微镜动态检测TAM作用后细胞内Ca^2＋的变化。结果TAM浓度为1×10^-9～1×10^-6mol/L时,呈剂量依赖性促进Ishikawa细胞的增殖,TAM浓度为1×10^-7mol/L时,作用最显著;TAM（10^-7mol/L）可促进细胞周期由G0/G1期进入S期,G0/G1期的DNA含量由51.58%下降到44.85%,S期的DNA含量由34.73%上升到43.64%;TAM使细胞内钙的荧光强度快速升高,约在20 s后开始增高,90 s左右到达峰值,约为静息状态的2.52倍,持续约120 s。结论TAM通过调节细胞周期和介导细胞内Ca2＋浓度的快速增高来促进Ishikawa细胞增殖。     

促性腺激素释放激素Ⅰ型激动剂和Ⅱ型对不同PTEN基因表达状态子宫内膜癌细胞的作用

目的 探讨促性腺激素释放激素Ⅰ型(GnRH-Ⅰ)激动剂--曲普瑞林和GnRH-Ⅱ对不同PTEN基因表达状态的子宫内膜癌细胞的作用.方法 不同浓度(10-11、10-9、10-7、10-5mol/L)的曲普瑞林和GnRH-Ⅱ分别作用于不同PTEN基因表达状态的3种子宫内膜癌细胞细胞系Ishikawa [PTEN基因表达阴性(-)]、Ishikawa-PTEN[PTEN基因表达阳性(+)]、Ishikawa-neo[PTEN(-)]细胞后,应用四甲基偶氮唑蓝比色法、碘化丙啶染色流式细胞计数法、膜联蛋白染色流式细胞术检测内膜癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化;蛋白印迹法检测内膜癌细胞中蛋白激酶B(Akt)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的活化情况.在曲普瑞林和GnRH-Ⅱ作用的基础上,使用17β雌二醇(17β-E2,10-8mol/L)和雌激素受体拮抗剂--ICI182780(10-6mol/L)分别进行干预,再次检测上述指标的变化.结果 不同浓度(10-11、10-9、10-7、10-5mol/L)的曲普瑞林及GnRH-Ⅱ作用后,3种细胞的增殖明显受到抑制(P<0.01);细胞凋亡率明显增加(P<0.01或P<0.05);细胞生长减慢,G0/G1期细胞比例增多,G2/M期和S期细胞比例减少;上述作用均呈明显浓度依赖关系(P<0.01或P<0.05).曲普瑞林及GnRH-Ⅱ均可明显抑制Ishikawa、Ishikawa-neo细胞中Akt和ERK1/2的活化(P<0.01);而对Ishikawa-PTEN细胞中Akt和ERK1/2的活化无明显抑制作用(P<0.05).17β-E2可明显拮抗曲普瑞林和GnRH-Ⅱ的上述作用(P<0.01或P<0.05).结论 曲普瑞林和GnRH-Ⅱ可通过抑制Akt和ERK1/2的活化,促进子宫内膜癌细胞凋亡,并抑制细胞增殖,此作用呈明显浓度依赖关系,并与PTEN基因表达状态有关,且可被17β-E2拮抗.提示GnRH-Ⅰ激动剂可用于低雌激素表达子宫内膜癌患者的个体化内分泌治疗.     

Aspirin effects on endometrial cancer cell growth

OBJECTIVE: To find whether aspirin (acetylsalicylic acid, ASA) inhibits the growth of endometrial cancer cells in vitro in a way similar to that in colorectal cancer cells and to investigate the mechanisms by which aspirin might lead to growth inhibition. METHODS: Ishikawa human endometrial tumor cells were grown in the presence of ASA (1-5 mM) for 96 hours. Controls were treated with vehicle (absolute ethanol). Cell proliferation was assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. Apoptosis was determined by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling assay. Analysis of cell-cycle distribution and bcl-2 expression was assessed by flow cytometry. RESULTS: Acetylsalicylic acid induced a dose-dependent inhibition of Ishikawa cells in vitro. The percentage of growth inhibition was 21-88% at concentrations of 1-5 mM. It also induced apoptosis and reduced bcl-2 expression in Ishikawa cells in a dose-dependent manner. Control cells and cells treated with the lowest concentration of ASA exhibited 2% apoptosis and more than 60% of the population expressed bcl-2. Apoptosis levels increased as levels of ASA increased from 2 to 5 mM (7-58%) with a concommitant decrease in bcl-2 expression from 46% at 2 mM to 2% at 5 mM. Acetylsalicylic acid concentrations of 3 mM or greater induced a shift from the resting phase (G0/G1) to S phase of the cell cycle. CONCLUSION: Acetylsalicylic acid inhibited Ishikawa cell growth in vitro in a dose-dependent manner. Apoptosis is one of the mechanisms involved in the response, which can be mediated in part by downregulation of bcl-2.     

胰岛素对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨胰岛素对子宫内膜癌细胞系Ishikawa3-H-12细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法 应用免疫细胞化学方法和RT-PCR技术检测Ishikawa3-H-12细胞胰岛素受体（INSR）蛋白和mRNA的表达。以不同浓度胰岛素作用Ishikawa3-H-12细胞不同时间,采用四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡和细胞周期。结果 （1）Ishikawa3-H-12细胞INSR蛋白呈棕黄色阳性表达,并可见INSR基因的表达。（2）胰岛素以浓度和时间依赖的方式促进子宫内膜癌细胞增殖,1×10^-4mol／L胰岛素作用48h时促增殖作用最显著,增殖率为（340．2±15．9）％,与对照细胞（以胰岛素浓度为0作为对照,为100％）比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。（3）胰岛素以浓度和时间依赖的方式使Ishikawa3-H-12细胞中G0／G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,1×10^-4mol／L胰岛素作用72h时最显著,G0／G1期细胞比例为（27．7±2．5）％,S期细胞为（55．2±1．4）％,分别与对照细胞[分别为（67．6±1．5）％、（15．7±1．0）％]比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）;胰岛素对G2／M期细胞无影响（P〉0．05）。（4）随着胰岛素浓度的增加,Ishikawa3-H-12细胞凋亡率逐渐下降。1×10^-4mol／L胰岛素作用最显著,作用24、48、72、96h时的细胞凋亡率分别为（1．76±0．16）％、（1．70±0．15）％、（1．56±0．20）％、（1．31±0．24）％,分别与对照细[分别为（9．81±0．61）％、（9．93±1．44）％、（9．10±0．66）％、（10．30±1．20）％]比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 胰岛素对子宫内膜癌Ishikawa3-H-12细胞具有促进增殖、抑制凋亡的作用。     

雌二醇对子宫内膜癌细胞c-fos、c-Jun表达和细胞凋亡及增殖的影响

目的研究子宫内膜癌细胞雌激素通过膜受体的非基因组效应对AP-1、Bcl-2和细胞增殖的影响。方法 17β雌二醇偶联牛血清白蛋白（E2-BSA）作用于子宫内膜癌Ishikawa细胞系,并采用RT-PCR和荧光实时定量PCR检测AP-1家族成员c-fos和c-JunmRNA表达水平;Western-blot检测抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表达;流式细胞仪检测细胞周期。结果 E2-BSA作用60min时,c-fosmRNA表达上调;E2-BSA作用5min和15min时,c-JunmRNA表达上调;E2作用8h后Bcl-2表达增高,而E2-BSA作用后Bcl-2和Bax表达无变化。E2和E2-BSA不改变细胞的增殖周期。结论雌激素通过细胞膜相应受体发挥非基因组效应,可以影响c-fos和c-Jun的表达,但对细胞凋亡相关蛋白和细胞增殖周期无显著影响。说明雌激素非基因组效应能够影响基因组转录效应,但不足以改变细胞增殖周期。     

17β-雌二醇对子宫内膜癌细胞上皮间质转化诱导作用的研究

目的:研究17β-雌二醇(17β-E2)对子宫内膜癌细胞发生上皮间质转化的诱导作用。方法:用17β-E2处理Ishikawa和HEC-1A细胞后,Western blot法检测两种细胞中E-cad、N-cad和Vimentin蛋白的表达。结果:经10-8mol/L E2作用后,Ishikawa细胞中的E-cad蛋白表达减少(P0.05),N-cad、Vimentin蛋白增加(P0.05);其他浓度作用前后,各蛋白表达无明显变化(P0.05)。经不同浓度E2作用后,HEC-1A细胞中E-cad、Ncad、Vimentin蛋白均无明显变化。结论:17β-E2仅在特定浓度下存在诱导ER阳性子宫内膜癌细胞Ishikawa发生上皮间质转化的作用。