自体骨髓CD34+干细胞移植治疗严重肢体缺血的实验研究

目的探讨自体骨髓干细胞移植是否能增加缺血肢体的新生血管形成。方法抽取5只犬骨髓20ml,经Ficoll分离单核细胞,免疫磁珠分离CD34+细胞,在体外经血管内皮细胞生长因子诱导分化为内皮细胞,并经vWF抗染色鉴定。建立犬双侧肢体缺血动物模型,将Dil荧光标记的内皮细胞植入缺血肢体中。结果CD34+干细胞移植4周后,激光共聚焦显微镜证实缺血肢体中移植的自体骨髓干细胞参与了新生血管形成;动脉造影见干细胞移植的肢体侧枝循环明显增加,微血管密度检测移植组也明显高于对照组(12.0±2.8vs.5.0±1.6/每高倍镜视野,t=4.17,P<0.05);干细胞移植的肢体ABI平均为0.58±0.14,对照肢体ABI平均为0.32±0.11,差异有统计学意义(t=2.95,P<0.05)。结论自体骨髓干细胞移植能有效的促进缺血组织内的新生血管形成。     

骨髓CD34+细胞体外分化为血管内皮细胞的研究

目的 研究骨髓CD34^ 细胞体外分化为内皮细胞的能力，并初步探讨其分化条件。方法 利用免疫磁珠法从骨髓中提取CD34^ 细胞，体外经血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维生长因子(bFGF)及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等诱导分化后，观察细胞生长及形态变化，并通过检测细胞血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和摄取乙酰化-低密度脂蛋白(Ac-LDL)情况等对分化细胞进行鉴定。结果 用免疫磁珠法从骨髓中可以提取高纯度CD34^ 细胞，定向诱导后细胞呈卵石形，透射电镜显示细胞内具有特征性的W—P小体，免疫荧光染色检测细胞相关抗原VEGFR-2、Ⅷ／vWF呈阳性，同时细胞摄取Ac—LDL。结论 骨髓CD34^ 细胞是具有多向分化潜能的干细胞，经VEGF、bFGF、IGF-1等诱导，可以分化为血管内皮细胞，是理想的组织工程种子细胞。     

骨髓CD34+干细胞与单核细胞应用于组织工程小血管内皮化的比较

目的 探讨骨髓CD34+干细胞与骨髓单核细胞(MNCs)应用于组织工程小血管内皮化的效果,并作比较.方法 采集犬骨髓,经免疫磁珠分离出CD34+细胞,内皮细胞生长因子(VEGF)诱导分化为内皮细胞并扩增,行细胞免疫荧光、免疫组织化学和体外成血管实验鉴定;将培养后的细胞和未经分离的MNCs分别种植于人工小血管支架,扫描电镜观察,比较两组组织工程小血管的内皮化.结果 经流式细胞仪测定,分离后的细胞中CD34+细胞含量为(78.46±6.37)％.CD34+细胞培养2周后细胞基本铺满培养瓶底面,细胞呈“铺路石”状排列,CD31和Ⅷ因子免疫细胞化学染色均为阳性,体外成血管实验显示6h后CD34+细胞组出现较多毛细血管样网状结构.CD34+细胞组人工血管内膜化面积为(68.4±2.3)％,明显高于MNCs组人工血管内膜化面积(41.3±3.4)％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 通过免疫磁珠方法可分离得到高纯度的骨髓CD34+细胞,经体外培养VEGF诱导后可定向分化为内皮细胞,种植于人工血管内表面,较MNCs组内皮化效果理想.     

血管内皮细胞生长因子基因转染血管内皮祖细胞移植提高移植脂肪存活率的实验研究

目的探讨血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因转染血管内皮祖细胞(EPCs)移植促进游离移植的脂肪组织的血管新生,提高移植脂肪组织存活率。方法体外分离、培养人脐血中EPCs,利用脂质体介导VEGF165基因体外转染EPCs,然后与来自人体的脂肪组织混合移植于裸鼠背部,裸鼠随机分为3组:VEGF165基因转染组、EPCs组及M199培养基对照组。结果脐血中分离培养的EPCs表达CD34、血管内皮细胞生长因子受体及CD133;VEGF165基因转染EPCs体外及体内检测均有VEGF165蛋白的表达。VEGF165基因转染组、EPCs组中,EPCs整合到缺血部位新生血管中,与对照组的脂肪组织存活率分别为(96.2±8.6)%、(75.3±6.8)%和(40.2±2.5)%(P<0.05),VEGF165基因转染组与EPCs组脂肪组织周边区毛细血管密度有显著差异(P<0.05),均高于对照组(P<0.05)。术后3个月时3组脂肪组织周边区的EPCs密度分别为(196±16)个/mm2、(95±11)个/mm2、0个/mm2(P<0.05)。结论脐血中的EPCs体外培养后移植体内可促进游离移植的脂肪组织的血管新生,提高存活率,而转染VEGF165基因的EPCs具有更强的促血管新生的作用。     

犬自体骨髓干细胞在缺血肢体中新生血管形成中的作用

目的:探讨犬自体骨髓干细胞在缺血组织的新生血管形成中的作用.方法:抽取犬骨髓,经免疫磁珠系统分离出CD 34细胞,体外扩增并向血管内皮细胞诱导分化;建立犬双下肢缺血动物模型,将诱导分化细胞移植入一侧缺血肢体中作为实验组,另一侧缺血肢体植入等体积的生理盐水作为自体对照组.移植后6周,检测缺血肢体中新生血管的形成.结果:细胞移植后6周,动脉造影显示实验组缺血肢体侧枝循环增加,明显多于对照组.微血管密度检测实验组为(14±2.3)个/高倍镜视野,明显高于对照组(6±2.1)个/高倍镜视野(P<0.05).激光共聚焦显微镜证实缺血肢体中移植的自体骨髓干细胞参与了新生血管形成.结论:自体骨髓干细胞移植可以促进缺血肢体组织中的新生血管形成.     

自体骨髓CD34+干细胞移植治疗严重肢体缺血的实验研究

目的探讨自体骨髓干细胞移植是否能增加缺血肢体的新生血管形成.方法抽取5只犬骨髓20 ml,经Ficoll分离单核细胞,免疫磁珠分离CD34+细胞,在体外经血管内皮细胞生长因子诱导分化为内皮细胞,并经vWF抗染色鉴定.建立犬双侧肢体缺血动物模型,将Dil荧光标记的内皮细胞植入缺血肢体中.结果 CD34+干细胞移植4周后,激光共聚焦显微镜证实缺血肢体中移植的自体骨髓干细胞参与了新生血管形成;动脉造影见干细胞移植的肢体侧枝循环明显增加,微血管密度检测移植组也明显高于对照组(12.0±2.8 vs. 5.0±1.6/每高倍镜视野,t=4.17, P<0.05);干细胞移植的肢体ABI平均为0.58±0.14,对照肢体ABI平均为0.32±0.11,差异有统计学意义(t=2.95, P<0.05).结论自体骨髓干细胞移植能有效的促进缺血组织内的新生血管形成.     

血管内皮祖细胞促进游离移植脂肪颗粒组织存活的实验

目的探讨血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）移植促进游离移植的脂肪颗粒组织的血管新生，提高移植脂肪颗粒组织存活率。方法体外分离、培养人脐血中EPCs，然后与来自人体的脂肪颗粒组织混合移植于裸鼠背部。结果脐血中分离培养的EPCs表达血管内皮细胞生长因子受体（KDR）及细胞表面标记CD34、CD133，EPCs与脂肪颗粒组织混合移植到裸鼠3个月后，EPCs整合到缺血部位新生血管中，与对照组的脂肪颗粒组织存活率分别为（89．3±6．8）％、（42．2±2．5）％（P〈0．05），而且实验组与对照组脂肪颗粒组织周边区毛细血管密度差异有统计学意义（P〈0．05）。术后3个月2组脂肪颗粒组织周边区的EPCs密度分别为（95．2±10．5）个／mm^2、0个／mm^2（P％O．05）。结论体外培养的脐血EPCs移植体内可促进游离移植的脂肪颗粒组织的血管新生，提高存活率。     

胚胎干细胞在转化生长因子-β1诱导下表达vWF、CD34的研究

目的　探讨胚胎干 (ES)细胞在转化生长因子 β1(TGF β1)诱导条件下的分化表现 ,为组织工程种子细胞来源提供诱导方法。方法　小鼠ES细胞 ,以 1× 10 - 9mol L维甲酸 (RA)和 3μg LTGF β1进行诱导分化。应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)及免疫组织化学验证细胞性质。结果　证实ES细胞经RA和TGF β1的诱导 ,3～ 4d出现圆形前体细胞 ,6d形成管状血管样结构。分化细胞可表达内皮细胞的标志vWF、CD34。结论　ES细胞在特定的条件下可分化为血管内皮细胞 ,有可能为构建组织工程化血管及其他人工血管的内皮化提供种子细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化成平滑肌细胞

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并体外定向诱导分化成平滑肌细胞,为BMSCs移植治疗勃起功能障碍(ED)大鼠模型提供种子细胞。方法分离培养大鼠BMSCs,取第3~4代细胞,流式细胞术检测BMSCs表面分子CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106、造血干细胞表面分子CD34和CD45、血管内皮细胞特异性表面分子CD31表达情况,采用平滑肌细胞诱导培养基诱导分化,通过免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白(Desmin)进行鉴定细胞分化。结果培养细胞阳性表达BMSCs表面分子CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106,同时造血干细胞表面分子CD34和CD45及血管内皮细胞表面分子CD31阴性表达,且经过平滑肌细胞诱导培养基诱导分化后α-SMA和Desmin免疫荧光检测均阳性反应。结论成功从大鼠骨髓中分离培养BMSCs,为BMSCs和基因修饰BMSCs移植治疗ED提供种子细胞。     

骨髓CD34+细胞人工血管内皮化实验研究

目的探讨骨髓CD34^ 细胞种植的人工血管内皮化和通畅性。方法取犬骨髓,经免疫磁珠分离出CD34^ 细胞,内皮细胞生长因子(vascular endothelial grow factor,VEGF)诱导并扩增;种植聚四氟乙烯(polytetra fluoro ethylene,PTFE)人工血管,再植入犬的下腔静脉和腹主动脉。结果骨髓分离的细胞经流式细胞仪鉴定为CD34^ 细胞,CD34^ 细胞经VEGF诱导培养后经免疫细胞化学和透射电镜检测证实为内皮细胞。内皮化人工血管植入动脉闭塞率0,狭窄率12．5％;人工血管植入静脉闭塞率12．5％,狭窄率25．0％。结论骨髓经免疫磁珠可分离出CD34^ 细胞,CD34^% 细胞经VEGF诱导可定向分化为内皮细胞。骨髓CD34^ 细胞经体外培养种植于PTFE人工血管,获得理想的内皮化和通畅率。     

纯化自体CD34+细胞移植治疗下肢重度缺血患者的护理

对7例下肢重度缺血患者采取纯化自体外周血CD34+细胞移植治疗。术前做好心理护理,完善相关检查,预留采血用的肘部血管,精确抽吸外周血单个核细胞,肌内注射纯化的CD34+细胞产物时注意无菌操作,并配合清创,术后注意观察患侧肢体,做好疼痛护理及知识指导。结果术后1个月所有患者患肢疼痛明显缓解,足趾角化、脱屑等皮肤营养不良表现于术后3～6个月明显好转,足部溃疡愈合或明显缩小。提示纯化自体外周血CD34+细胞移植治疗下肢重度缺血安全、有效,完善的术前准备、严密的术中配合及术后仔细观察、评估并给予正确的指导保证了治疗效果。     

骨髓血管内皮祖细胞移植提高缺血皮瓣存活率的研究

目的：探讨大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）移植促进缺血皮瓣的血管新生,从而提高皮瓣存活率的可能性。方法：在Wistar大鼠背部形成2cm×8cm蒂部位于双侧髂棘连线上的随意型超比例皮瓣,建立缺血皮瓣模型。采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在专有的诱导培养基（EG-M2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;对细胞的形态、表型、功能加以鉴定。将EPCs注射移植于iWstar大鼠背部的缺血皮瓣,大体观察皮瓣的存活率,vWF免疫酶染色法检测皮瓣毛细血管密度。以缺血皮瓣单纯注射磷酸盐缓冲液（PBS）的Wistar大鼠作为对照组。结果：骨髓中分离培养的EPCs呈现典型的＂铺路石＂样外观,表达CD34、Flk-1及CDl 33表型,能够摄取DIL-ac-LDL和特异性结合FITC-UEA-1。注射EPCs组的缺血皮瓣存活率以及毛细血管密度显著高于对照组（P〈0.05）。结论：骨髓中的EPCs在体外培养后注射移植于皮瓣内,可以促进缺血性皮瓣的血管新生,提高缺血性皮瓣的存活率。     

Nursing care of patients receiving autologous CD34+ stem cell injection for severe ischemia of lower limbs

对7例下肢重度缺血患者采取纯化自体外周血CD34+细胞移植治疗.术前做好心理护理,完善相关检查,预留采血用的肘部血管,精确抽吸外周血单个核细胞,肌内注射纯化的CD34+细胞产物时注意无菌操作,并配合清创,术后注意观察患侧肢体,做好疼痛护理及知识指导.结果术后1个月所有患者患肢疼痛明显缓解,足趾角化、脱屑等皮肤营养不良表现于术后3～6个月明显好转,足部溃疡愈合或明显缩小.提示纯化自体外周血CD34+细胞移植治疗下肢重度缺血安全、有效,完善的术前准备、严密的术中配合及术后仔细观察、评估并给予正确的指导保证了治疗效果.     

不同动员方案对异基因造血干细胞移植临床疗效的影响

目的 探讨异基因造血干细胞移植中不同动员方案的临床效果.方法 回顾性分析71例异基因外周血造血干细胞移植的临床资料,根据供者采用动员剂的不同分为G-CSF动员组(G组,有24例受者)和G-CSF联合GM-CSF动员组(G+M组,有47例受者).比较两组供者的动员效果及移植物细胞成分,观察受者术后造血功能重建的情况和GVHD的发生情况,观察供者应用动员剂后的不良反应.结果 动员4 d后,G组供者的外周血白细胞计数为(49.6±19.5)×109/L,明显高于G+M组供者的(25.4±10.4)×109/L(P＜0.05).两组间CD34+细胞占单个核细胞比例的差异无统计学意义(P＞0.05),但G+M组CD34+CD38-细胞占CD34+细胞的比例为(37.7±5.7)%,明显高于G组的(31.4±4.5)%(P＜0.05).两组供者经过1～3次采集均能获取足够的CD34+细胞,两组采集的供者淋巴细胞计数及其亚群分布的差异均无统计学意义(P＞0.05).两组受者间CD34+细胞、CD34+CD38-细胞及T淋巴细胞亚群输入量的差异均无统计学意义(P＞0.05).术后所有受者的造血功能均顺利重建.术后对受者进行2～55个月的随访,无论是急性还是慢性GVHD,其发病率和严重程度在两组间的差异均无统计学意义(P＞0.05).术后共有17例受者死于原发病复发,10例死于GVHD和感染等移植相关并发症,G组和G+M组分别有14例(58.3%)和31例(66.0%)受者存活.在使用动员剂后,供者出现的主要不良反应为骨骼肌酸痛和发热,多发生在用药后36 h,给予解热镇痛药后缓解.结论 单用G-CSF与联合应用G-CSF和M-CSF进行动员的临床效果相当,但后者对CD34+CD38-细胞的选择性较强,而在异基因造血干细胞移植输入较多的CD34+细胞和CD34+CD38-细胞有利于受者造血功能的快速重建.     

脐带间充质干细胞分化为内皮细胞促进血管新生

目的 探讨脐带间充质干细胞能否在体内外分化为内皮细胞,参与血管新生.方法 体外实验采用内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对脐带间充质于细胞进行诱导,观察其形态变化.体内实验将脐带间充质干细胞移植到小鼠后肢缺血模型中,采用免疫组织化学鉴定细胞在体内的迁移和分化,激光多普勒血流成像仪鉴定缺血局部血流恢复情况.结果 在体外脐带间充质干细胞能够形成血管网样结构.在体内脐带间充质干细胞能够分化为内皮细胞,表达CD31抗体,参与实验组的动物血管重建.与小鼠的血管网络发生整合,实验组的动物后肢血流灌注明显好于对照组.结论 脐带间充质干细胞能够分化为内皮细胞,参与血管新生,为治疗性血管新生提供新的细胞选择.     

大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞的体外培养和鉴定

目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基（EGM-2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。结果培养3 d,细胞贴壁较为完全,第4天换液后,细胞呈现克隆样生长,第7～8天形成类似成熟血管内皮细胞形态,呈现典型的"铺路石"样外观;诱导培养第7、10天的贴壁细胞CD34、Flk-1及CDl33染色均呈阳性;荧光显微镜下观察,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。结论采用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,在培养液中贴壁培养,可以扩增出具有典型特征的EPCs。     

大鼠脐血来源单个核细胞诱导为内皮祖细胞的免疫荧光检测

目的脐血（umbilical cord blood,UCB）中含有大量内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,内皮祖细胞（EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞,有分化为血管内皮细胞的能力,为骨组织工程血管化带来新的途径。本实验研究大鼠脐血来源的单个核细胞体外诱导为EPCs的可能性。方法分离大鼠脐血单个核细胞,血管内皮诱导液（添加10％胎牛血清,1％青霉素,1％链霉素,VEGF20ug／L,IGF-12ug／L,bFGF2ug／L,EGF20ug／L）培养分化,于3周、6周进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF表面标志。结果培养三周单个核细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF抗体免疫荧光检测均为阳性;六周免疫荧光染色可见CD34、Flk-1、VWF组为阳性,CD133组部分为阳性,阴性对照组未发现阳性细胞。结论大鼠脐血来源的单个核细胞在体外诱导3周可以分化为EPCs,6周部分细胞分化为成熟血管内皮细胞。     

人脐血来源内皮祖细胞的纯化鉴定及定向分化的研究

目的 检测CD133^＋血管内皮祖细胞（EPC）的细胞表面标志物，鉴定其生物学特性。方法 采用免疫磁珠法分离人脐血EPC，用EGM-2MV培养基[含表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）2等具有诱导分化作用的细胞因子]进行体外培养。应用流式细胞术、免疫组织化学等方法检测CD133^＋细胞的比例、原代EPC的生长曲线及生长特性。透射电镜查找Weibel-Palade小体。同时设计EPC裸鼠成瘤实验，观察瘤体生长及血管增生情况，以鉴定EPC的生物学特性。结果 CD133^＋细胞在免疫磁珠分离前后的比例各为0．91％及85．52％。EPC原代培养时细胞形态正常、密度均匀，前3d为相对抑制期，此后快速增殖，10d后达80％～90％融合。EPC生长曲线显示，接种后5d内细胞数量无明显变化，从第7天开始明显增加，第17天达高峰。光学显微镜下可见，原代EPC贴壁后呈梭形，接种后7d数量明显增加，呈克隆状生长。透射电镜观察到，细胞膜伸出许多伪足丝，基底膜呈多层；细胞质内可见一种短棒状小体，含平行管状的内部结构，即Weibel-Palade小体，确定其为EPC。裸鼠成瘤实验可见EPC组肿瘤瘕体及血管数量大于或多于对照组；抗人血管性假血友病因子（vWF）免疫荧光染色显示，大量EPC参与肿瘤血管生成。结论本实验分离培养的CD133^＋细胞具有分化为成熟血管内皮细胞的能力，即为EPC。裸鼠成瘤实验初步证明EPC参与血管重建，具有促进血管新生、加速缺血组织血管化的作用。     

血管内皮祖细胞移植提高裸鼠缺血皮瓣存活率

目的探讨血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell,EPC)移植促进早期断蒂的缺血皮瓣的血管新生,从而提高皮瓣存活率的可能性。方法体外分离、培养人脐血中EPCs,免疫组织化学进行鉴定,然后移植于裸鼠随意皮瓣,皮瓣早期断蒂,裸鼠分两组:实验组(EPCs移植)、对照组(M199注射),术后皮瓣4d断蒂。观察皮瓣的存活率、激光多普勒血液监测仪监测血流灌注、CD34免疫组织化学检测皮瓣毛细血管密度、激光共聚焦检测EPCs在皮瓣内的密度。结果脐血中分离培养的EPCs表达CD34、KDR及CD133,实验组EPCs移植裸鼠皮瓣后,整合到缺血部位新生血管中,与对照组的皮瓣存活率分别为(60.3±2.1)%、(34.2±1.8)%(P<0.05);而且两组毛细血管密度、血流灌注差异均有统计学意义(P<0.05);实验组术后第7、11天时二组皮瓣中的EPCs密度分别为(75.2±6.5)个/mm2、(305.4±26.5)个/mm2,而对照组均为0个/mm2(P<0.05)。结论脐血中的EPCs体外培养后移植体内可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率。     

犬骨髓CD34＋细胞种植人工血管置换后短期内皮化的实验研究

目的：探讨骨髓CD34＋细胞种植于常用膨体聚四氟乙烯（expanded polytera fluoroethylene，ePTFE）人工血管和涤纶人工血管后二者的内皮化程度。方法：选杂种犬8条，依支架覆膜不同分为ePTFE组和涤纶组，每组实验犬2条，对照犬2条。实验犬采自体骨髓，提取CD34＋细胞种植覆膜支架，对照犬采用单纯自体血预凝覆膜支架。将人工血管植入犬的下腔静脉和腹主动脉。在术后第10、30天观察植入的人工血管通畅情况，采用免疫组织化学方法鉴定内膜细胞来源，在光镜和电镜下观察人工血管新生内膜表面内皮化情况。结果：术后第10天实验组与对照组差异无统计学意义；术后第30天腔面新生内膜内皮细胞自人工血管吻合口向中间逐渐减少（P〈0．05）；而对照组内膜表面第10、30天均无内皮细胞覆盖。结论：经纯化的CD34＋细胞种植于ePTFE和涤纶人工血管，均获得理想的内皮化。