PCR和毛细管电泳技术检测沙门氏菌等5种病原菌的方法研究

目的采用多重PCR技术检测结合毛细管电泳成像技术建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的方法。方法根据沙门氏菌hilA基因、志贺氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌TDH基因、金黄色葡萄球菌的pSa-442 Sau3AI fragment基因及大肠杆菌O157的rfbE基因设计异性特PCR引物,被检样品经4 h振荡培养后金属浴裂解制备DNA模板,使用全自动毛细管电泳核酸检测系统分析PCR扩增产物。结果在580 bp、423bp、257 bp、245 bp和194 bp处分别出现预期的特异性DNA条带,且无非特异扩增条带出现。敏感性试验显示在模拟标本中的检测灵敏度,沙门氏菌为101-2cfu/ml、志贺氏菌为101cfu/ml、副溶血性弧菌为102cfu/ml、金黄色葡萄球菌为102cfu/ml、大肠杆菌O157为101cfu/ml。结论该方法操作方便、特异性和灵敏度高、分辨率高,可同时完成5种病原菌的检测,在公共卫生突发事件中具有实用价值。     

实时荧光PCR方法检测多种食源性致病菌的研究

目的：应用实时荧光PCR技术（real time PCR）联合检测小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。方法：针对小肠结肠炎耶尔森菌foxA基因、霍乱弧菌ompW基因、肠出血性大肠杆菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌TLH基因、沙门氏菌ssaR基因、志贺氏菌ipaH基因、空肠弯曲菌hipo基因和结肠弯曲菌glyA基因,在其保守区域设计特异性引物和探针,检测多种病原菌的特异性和灵敏度,并对临床样本和模拟样本进行检测,联合鉴别多种食源性致病菌。结果：该方法特异性强,与单核细胞增生李斯特菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、轮状病毒A组、轮状病毒B组、轮状病毒C组、诺如病毒GⅡ、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒核酸无交叉反应;灵敏度高,检测阳性样品均可达102 copies/mL;检测30份临床样本和50份模拟样本,准确性100%。结论：多种食源性致病菌实时荧光PCR检测方法准确、可靠、操作简单,今后可以大规模加速多种食源性致病菌的检测。     

3种食源性致病菌的多重PCR检测方法研究

目的建立一种快速、经济、实用的多重PCR方法,期望能同时检测3种常见致病菌。方法根据沙门氏菌的侵袭蛋白A（invasion protein A,invA）、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H基因（invasion plasmid antigen,ipaH）、副溶血性弧菌的不耐热肠毒素基因（thermolabile hemolysin,tlh）分别设计了3对引物,预计PCR扩增的目的片段依次为284、450、606bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系,建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的单管多重PCR方法。结果含沙门氏菌：42cfu/g,志贺氏菌：36cfu/g,副溶血性弧菌：116cfu/g的肉陷样品经过增菌、DNA提取、扩增、电泳,在16～18h内应用多重PCR体系能够检出。通过对10株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高。结论初步建立能快速,灵敏,特异地检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的多重PCR体系,可以作为食物中毒病原菌检测的有效方法。     

变性高效液相色谱法同时检测5种食源性致病菌

[目的]建立变性高效液相色谱方法(DHPLC),同时检测5种食源性致病菌(包括沙门菌、副溶血弧菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希菌O157:H7和单核细胞增生李斯特氏菌).[方法]针对5种食源性致病菌特异毒力基因设计引物,进行多重PCR扩增,扩增产物用高效变性液相色谱仪检测.[结果]柱温50%时,5种致病菌PCR扩增产物分别呈现特异DHPLC色谱图,并可充分分离.本方法检测灵敏度小于5 cfu/ml,对目的分离株的正确检出率大于98%,(82/83),38株非目的分离株检测均为阴性;对人工污染食品中的5种致病菌均可正确检测.[结论]该DHPLC方法具有较高的灵敏度和特异性,可同时检测5种食源性致病菌,适合于大批样品的快速筛检.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7多重PCR快速检测研究

[目的]建立能快速、特异检测肠出血性大肠杆菌O157︰H7的多重PCR技术。[方法]选用针对大肠杆菌O157志贺样毒素1、2(slt1/slt2)基因、溶血素(hlyA)基因、和O157特异性基因(rfbE)的4对引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了猪肉模拟样品检测。[结果]该方法扩增目的基因片段分别为348,584,250bp和497bp,特异性和灵敏度均高。细菌纯培养物的检测灵敏度为103cfu/ml,猪肉模拟样品37℃预增菌4h后检测灵敏度能达到100cfu/ml。[结论]初步建立了快速、灵敏、特异地测定肠出血性大肠杆菌EHECO157︰H7的多重PCR检测技术。     

2010～2011年莱州市腹泻症候群监测情况分析

[目的]了解莱州市腹泻症候群的细菌性病原谱构成情况。[方法]2010年9月至2011年12月,选择我市部分城区医院、镇(街道)医院以及村卫生室为腹泻症候群监测点,对送检标本按照"腹泻病原细菌检测标准程序"进行细菌培养。[结果]共监测110例腹泻病人标本,分离阳性菌株24株。其中致泻性大肠杆菌8株、志贺氏菌6株、副溶血弧菌4株、沙门氏菌2株、嗜水气单胞菌、阪崎肠杆菌、类志贺氏菌、类志贺氏邻单胞菌各1株。[结论]莱州市感染性腹泻病原体感染谱种类较多,但以致泻性大肠杆菌、志贺氏菌和副溶血弧菌为主。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌

[目的]建立荧光PCR检测副溶血性弧菌的快速方法。[方法]根据基因库公布的副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因（TDH）的保守序列,设计一对引物,用FAM荧光剂标记探针的5＇,进行特异性和灵敏性分析,使用于食物中毒样品的快速检测。[结果]检测灵敏度为170.8fg/μl,菌液的灵敏度为30~70cfu/ml。用此反应体系检测53株副溶血性弧菌均出现特异的荧光信号,未见与其它试验种属细菌交叉。对3起食物中毒样品45份用荧光PCR法和国标法检测副溶血性弧菌,荧光PCR检测阳性22份,国标法阳性20份。荧光PCR检测从样品处理到结果只需8h。[结论]荧光PCR检测副溶血性弧菌灵敏度高、特异性强、简便快速,可用于副溶血性弧菌引起食物中毒的快速诊断和海产品副溶血性弧菌的快速检测。     

应用液相芯片技术快速检测常见食源性致病菌的研究

目的建立一种基于多重PCR技术联合液相芯片技术快速、准确同时检测沙门菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌的方法。方法针对5种食源性致病菌的目标基因设计特异性的引物探针,建立5种食源性致病菌的多重PCR检测方法,将PCR产品与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,利用液相芯片检测仪来检测杂交结果,并对检测方法的重复性、灵敏度、特异性进行评价,以及使用实际样本对该方法进行初步验证。结果该方法检测5种食源性致病菌,重复性良好,变异系数均2%;沙门菌inv A与霍乱弧菌hly A的检测灵敏度为50 cfu/ml,单核细胞增生李斯特菌Hly、金黄色葡萄球菌Sa442、副溶血性弧菌toxR的检测灵敏度为100 cfu/ml;检测的特异度为100%。结论本研究建立的液相芯片检测方法能快速、准确、特异地同时检测沙门菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌5种常见的食源性致病菌。     

类志贺毗邻单胞菌与传染性腹泻

细菌性传染性腹泻可由多种致病菌引起。志贺氏菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜杆菌等,都是早经公认的传染性腹泻致病因素。近十余年来,由于细菌分离鉴定技术的改进和广谱抗生素的大量使     

2002-2004年广西食源性致病菌监测研究

目的 监测了解主要食品中致病菌污染状况，构建广西食品致病菌污染数据库，为有效防治食源性疾病提供科学依据。方法 在南宁、桂林等6个市采集6大类食品，按国家标准或国际标准方法对食品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌（L．m）、大肠杆菌0157：H7、志贺氏菌以及海产品中的副溶血弧菌进行分离与鉴定。结果2002～2004年在6市5类食品中检出沙门氏菌54株，检出率4．49％；其次为检出单增细胞李斯特菌51株，检出率为4．24％，志贺氏菌为1．64％、大肠杆菌O157：H7为0．25％；而另1类食品海产品中副溶血检出率高达20．00％（41／205）。结论 广西主要食品均遭受食源性致病菌不同程度的污染；其中以生肉污染最为严重，受到了沙门氏菌、L．m、0157：H7、志贺氏菌的污染，熟肉、水产品、生食蔬菜也遭受L．m污染；而海产品副溶血弧菌污染严重。有针对性防范和控制各类食品致病菌的污染，是防止食源性疾病暴发的重要措施。     

三种食源性致病菌多重PCR检测技术建立及应用研究

目的建立多重PCR方法同时检测水产品中沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特菌。方法分别以沙门菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和单核细胞增生性李斯特菌iap基因为靶基因,建立并优化了同时检测水产品中这3种致病菌的多重PCR体系,扩增产物分别为495bp(invA)、368bp(toxR)和660bp(iap)。结果建立的多重PCR方法可以简便、快速、灵敏地实现水产品中沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特菌的同时检测,人工污染水产品检测限为10cfu/ml。结论为无公害水产品食源性致病菌的快速检测提供了理想手段,有良好的应用前景。     

多重荧光定量PCR同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法研究

目的:利用多重荧光定量PCR技术检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌。方法:以溶藻弧菌等17种相关试验菌株做特异性检测;并将标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。结果:与传统的检测方法相比,该方法有很好的特异性且灵敏度高,检测时间短并可节省人力,具有快速方便等优点。结论:适用于样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的快速检测。检测限分别为:霍乱弧菌为280 cfu/ml;副溶血性弧菌为:100 cfu/ml;创伤弧菌为:450 cfu/ml。     

10种食源性疾病病原体高通量LAMP分子鉴别检测体系的建立及应用

目的建立一种LAMP分子鉴别检测体系,应用于10种食源性疾病病原体的分子鉴别检测。方法针对8种细菌（沙门菌属、志贺菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、EHEC O157：H7、奇异变形杆菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌）和2种病毒（Norwalk病毒和轮状病毒）分别建立LAMP和RT-LAMP方法,分别对25种常见肠道细菌和病毒进行LAMP扩增,水浴箱内65℃扩增60 min（LAMP）或120 min（RT-LAMP）,扩增完成后利用电泳和肉眼进行结果判断。对365份食源性疾病患者呕吐物、肛拭子和食品等标本进行10种食源性疾病病原体LAMP分子检测。结果 10种食源性疾病病原体LAMP或RT-LAMP方法均只对靶病原体出现阳性结果,电泳显示为LAMP特异性梯状条带,加SYBRGreen I后肉眼观察反应液变为绿色;8种细菌性病原体LAMP检测方法的敏感度为3×100~1.2×102cfu/ml,其中6种LAMP方法敏感度高于PCR方法,其他病原体（霍乱弧菌、EHEC O157：H7、Norwalk病毒和轮状病毒）敏感度与PCR方法相同。从365份标本中检出沙门菌属11份、志贺菌属6份、金黄色葡萄球菌13份、EHEC O157：H7 2份、副溶血性弧菌2份、单增李斯特菌2份、Norwalk病毒12份和轮状病毒7份。结论建立了一个较为完整的LAMP分子鉴别检测体系,可以在一台水浴箱内同时对10种食源性疾病病原体进行高通量的分子鉴别检测,具有快速、不需要特殊仪器和肉眼判断结果的优势,适合基层单位的实验室开展食源性疾病的分子鉴别诊断。     

利用多重PCR检测食品中副溶血性弧菌的方法研究

目的:建立食品中副溶血性弧菌的简便、快速、准确地检测方法。方法:根据副溶血性弧菌的tl、tdh、trh基因设计引物,多重PCR扩增,进行特异性和标准菌株的验证,并用经典方法做平行试验。结果:本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269、500 bp的片断,而对其它种类的菌无特异性扩增。结论:本实验方法可在增菌后8 h快速、简单、准确的检测出食品中的副溶血性弧菌,灵敏度可达15 cfu/ml。     

荧光PCR和PFGE在副溶血弧菌食物中毒诊断中的应用研究

[目的]探讨荧光PCR和脉冲场电泳（PFGE）在副溶血弧菌食物中毒调查中的应用。[方法]对中毒样品进行荧光PCR检测,副溶血弧菌临床分离株基因组DNA经NotI酶切,通过PFGE获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。[结果]部分样品荧光PCR检测结果呈阳性,同起食物中毒菌株PFGE图谱一致。[结论]荧光PCR可以快速准确的鉴定病原体。PFGE具有很强的菌株同源性分析能力,适用于食物中毒病原菌学鉴定和传染源溯源。荧光PCR和PFGE在食物中毒的快速诊断中可发挥重要作用。     

多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌

目的建立一种能同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR检测方法。方法采用7.5%NaCl肉汤对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行增菌,同时采用GN增菌剂对食品样品中的志贺菌和沙门菌进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应(PCR)反应对食品样品中上述三种病原菌的目标基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果特异性实验表明本方法的特异性良好。对污染金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的牛奶样品进行检测,检出限为1cfu/ml。结论本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点。     

微流体芯片技术检测食源性致病菌的应用研究

[目的] 通过应用微流体芯片(lab-on-chip)技术检测食源性致病菌,包括霍乱弧菌、沙门菌、副溶血性弧菌、志贺菌等细菌的灵敏度和精确度,从而建立突发公共卫生事件现场实验室的解决方案。[方法] 分别采用Lab-on-chip平台食源性病原体微流检测芯片和荧光PCR方法对食源性病原菌样本进行检测,对比分析食源性微流芯片检测方法的特异性、敏感度、准确性和重复性。根据Lab-on-chip说明书以及荧光定量PCP试剂盒操作说明进行操作。[结果] Lab-on-chip方法的霍乱弧菌、沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌检出限为5×10³~10³ DNA Copies/mL。特异性、准确性和重复性都获得了良好的结果。[结论] Lab-on-chip方法具有快速、便捷、高效、准确等优点,可以在突发公共卫生事件中作为良好的检测工具和方法。     

多重荧光PCR结合HANDS系统快速检测4种食源性致病菌

目的建立快速、准确检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的多重荧光PCR方法。方法将多重荧光PCR技术与HANDS系统结合,采用同源加尾的方式,构建四重荧光PCR体系,分析该体系的特异性,并进行模拟实验,该方法与国家标准检测方法进行方法比对实验。结果该系统检测出了4种目标致病菌。初始菌浓度分别为5、9、10、2、50、3cfu/ml的沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和兰氏A群、C群、G群链球菌增菌液,在增菌18h后都被体系检出。该方法与国家标准方法对样品的检测结果一致。结论首次结合HANDS系统构建了同时检测4种致病菌的多重荧光PCR方法,该方法特异性强、灵敏度高,是检测沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的快速、准确方法。     

肠出血性大肠埃希菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立快速、灵敏、特异、有效的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)双重实时荧光PCR检测方法。方法根据GenBank公布的EHEC的stx1和stx2基因序列设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针分别用FAM-BHQ1和HEX-BHQ1标记stx1及stx2,建立双重实时荧光PCR反应体系,并对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。结果显示该方法特异性、重复性好、灵敏度高,最低检出限可达102cfu/ml,117.5fg/μl。结论建立的双重实时荧光PCR方法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。