猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18在乳球菌中的表达

目的观察猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中的表达情况。方法将胞内型表达载体pMG36e-TSOL18和分泌型表达载体pMG36e-SP-TSOL18电穿孔转化至L.lactis MG1363,PCR鉴定阳性克隆,经热诱导后采用SDS-PAGE和Western blot分析表达情况。结果 PCR鉴定重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18成功转入L.lactis MG1363。SDS-PAGE检测重组质粒pMG36eTSOL18转化菌仅在胞内表达相对分子质量(Mr)约为15×103的TSOL18目的蛋白,pMG36e-SP--TSOL18转化菌胞内和胞外均表达相应的TSOL18目的蛋白,其相对分子质量(Mr)为15×10~3,与预期相符;Western blot分析重组pMG36e-TSOL18/L.lactis胞内表达的TSOL18重组蛋白以及pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis胞内和胞外表达的TSOL18重组蛋白均能被相应兔抗血清识别。结论猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18转化L.lactis MG1363后仅在胞内表达TSOL18蛋白,pMG36e-SP-TSOL18转化L.lactis MG1363后胞内胞外均有TSOL18蛋白表达,但产量较低,表达的重组蛋白均具有免疫反应性。     

猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建及其表达

目的 构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,研究TSOL18基因在BCG中的表达情况。方法 通过酶切的方法 从重组质粒pGEX-TSOL18获取猪带绦虫TSOL18基因,将其定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV261中,构建猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18,进行酶切、PCR和测序鉴定;再将其电穿孔转化入BCG,构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,进行PCR鉴定;SDS-PAGE和Western blot分析TSOL18基因在BCG中的表达情况。结果 通过酶切成功获得了393 bp的TSOL18基因片段;酶切、PCR和测序鉴定证明成功构建了猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18;PCR鉴定证实猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18成功转入BCG中,提示猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建成功;SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约为14.7 kD处有明显的TSOL18目的蛋白条带,Western blot证实表达的TSOL18目的蛋白能被兔抗血清和囊虫病猪血清所识别。结论 成功构建了猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,TSOL18基因能够在BCG中成功表达,表达的TSOL18重组蛋白具有特异的抗原性,为该疫苗的进一步研究奠定了基础。     

猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及其表达

目的构建猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,分析猪带绦虫TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。方法采用PCR方法从重组质粒pGEX-TSOL18中扩增TSOL18基因,克隆入pMV361载体,构建pMV361-TSOL18穿梭质粒,经酶切和测序鉴定后电穿孔法转化入耻垢分枝杆菌,进行单克隆菌落筛选及PCR鉴定。构建的猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗经热诱导后,以SDS-PAGE分析及Western blot分析TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。结果成功扩增出TSOL18目的基因,大小约为393 bp,与预期值相符;经酶切验证,pMV361-TSOL18穿梭质粒构建成功;PCR鉴定猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗构建成功。SDS-PAGE电泳检测重组菌表达的目的蛋白TSOL18,相对分子质量为15×10~3与预期相符;Western blot分析该蛋白能被TSOL18兔抗血清识别。结论成功构建了猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,猪带绦虫TSOL18基因在耻垢分枝杆菌中成功表达,表达蛋白具有反应原性,其免疫原性有待进一步研究。     

猪带绦虫TSOL18基因的表达、纯化和兔抗血清的制备

目的 构建猪带绦虫重组质粒pGEX-TSOL18,表达纯化TSOL18重组蛋白,制备兔抗重组蛋白血清。方法 全基因合成猪带绦虫TSOL18抗原编码基因,定向克隆到pGEX-1λT表达载体,构建重组质粒pGEX-TSOL18;转化大肠埃希菌ArcticExpress(DE3), IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况;亲和层析纯化获得重组蛋白,免疫兔制备抗血清;ELISA测定抗血清的效价,Western blot鉴定抗血清的特异性。结果 全基因扩增出393 bp的TSOL18抗原编码基因,酶切和测序鉴定证实TSOL18基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达重组蛋白相对分子质量(Mr)约为41 kDa,经亲和层析后可获得纯度为75%的重组蛋白;ELISA测定抗血清的效价为1∶256 000,Western blot证实该抗血清能与重组蛋白发生特异性反应。结论 猪带绦虫TSOL18基因能在大肠埃希菌中高效表达,成功制备了高纯度的TSOL18重组蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清,为猪带绦虫的疫苗研制奠定了基础。     

猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定猪带绦虫重组双歧杆菌(Bb)(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗。方法用疏水甘氨酸接头连接TSO45W-4B和TSOL18编码基因,通过全基因合成方法合成猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因。将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18。电穿孔法将该质粒导入Bb,构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。结果全基因合成789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段。从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切得到4 944bp的pGEX-1λT载体片段和789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,与预期结果相符;以该重组质粒为模板进行PCR扩增得到789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,经测序基因片段为789bp,与预期大小相符。结论成功构建了猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,为该疫苗的表达及免疫原性研究奠定了基础。     

结核分支杆菌热休克蛋白65kD在大肠杆菌中表达

目的　构建能表达结核分支杆菌热休克蛋白65kD的工程菌。方法 设计引物并PCR扩增,目的基因克隆并转化,重组子经酶切和自动测序鉴定,阳性重组子转化表达宿主菌并受化学诱导后表达重组65kD蛋白。结果 65kD蛋白编码基因约1.6kb,重组子单酶切和双酶切证明目的基因插入载体,3个测序反应覆盖99.1%目的基因;大肠杆菌表达重组65kD蛋白。结论 大肠杆菌表达系统是一种快速、简便获得单一结核分支杆菌抗原的途径。     

金黄色葡萄球菌凝固酶coa基因的克隆、表达及其生物活性分析

目的 体外表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)凝固酶Coa,评价其生物学活性。方法 根据GenBank中金黄色葡萄球菌凝固酶coa基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从S. aureus USA300 CA-MRSA 923 株基因组中扩增coa基因片段,将其克隆至pET-24b(+)表达载体,构建重组表达质粒pET-24b-coa;将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化感受态细胞E.coli BL21(DE3) 中进行IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE和Western blot对表达的重组Coa(rCoa)进行鉴定,测定rCoa对人血液和兔血浆的凝固活性;最后用纯化的重组蛋白rCoa免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和Western blot分析其免疫原性。结果 构建的重组质粒pET-24b-coa在E.coli BL21(DE3) 中以包涵体形式表达rCoa,分子量约74.8 ku,与预期蛋白大小相符;rCoa在体外具有凝固人全血和兔血浆活性,能刺激小鼠产生高效价的抗Coa特异性抗体。结论 成功地获得了具有良好凝固酶活性和抗原性的金黄色葡萄球菌凝固酶重组蛋白rCoa,为进一步深入研究S. aureus凝固酶Coa的功能及以Coa为靶点的抗金黄色葡萄球菌抑制剂和疫苗的研制奠定基础。     

猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗人工传代后的稳定性研究

目的研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌(Bb)疫苗人工传代后的稳定性。方法分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转入长双歧杆菌(Bifidobacteria longum),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/Bl、pGEX-TSOL18/Bl和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/Bl,分别经人工传代10次后抽提质粒,进行PCR鉴定和稳定性分析。结果经PCR鉴定,从第7代开始,pGEX-TSOL18/Bl菌株出现质粒丢失的现象,随着培养时间的延长,质粒丢失现象越来越严重,第8代,第9代均出现丢失现象。而pGEX-TSO45W-4B/Bl菌株从第8代开始出现质粒丢失现象,随后的第9代,第10代也陆续出现丢失现象。pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/Bl菌株相对稳定,但从第10代开始,开始出现了质粒丢失现象。结论重组质粒转化菌pGEX-TSO45W-4B/Bl、pGEX-TSOL18/Bl和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/Bl人工培养时分别从人工传代培养第8代、第7代和第10代开始出现质粒丢失现象,可稳定遗传7代、6代和9代,显示具有不同程度的遗传稳定性,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础。     

稳定表达HBx的人肝细胞系7702的建立

目的 构建HBx表达载体,筛选可稳定表达HBx的人肝细胞(HL)-7702细胞系。 方法 采用RT-PCR法扩增HBx 基因片段,并将其连接至pIRES载体,经酶切和测序鉴定pIRES-HBx重组质粒序列。然后,分别采用Real-time PCR和Western blot技术检测验证重组质粒的正确性。最后,应用G418抗生素筛选稳定表达HBx的HL-7702细胞系。结果 经PCR扩增得到正确的HBx片段,成功构建pIRES-HBx质粒,将重组质粒转染HEK 293 细胞和HL-7702细胞均实现了HBx过量表达;经免疫荧光法鉴定,我们获得了稳定大量表达HBx的HL-7702细胞系。结论 成功构建的pIRES-HBx表达载体能在HL-7702细胞稳定表达HBx,为后续研究提供了基础实验工具。     

弓形虫表面抗原SAG1基因自杀性DNA疫苗的构建及免疫原性检测

目的 构建表达弓形虫表面抗原SAG1的自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1并检测其免疫原性。方法 以弓形虫RH株基因组DNA为模板,PCR扩增SAG1基因(GenBank No.HM776940.1),克隆至甲病毒复制子载体pDREP-eGFP中替换原有的eGFP基因,菌液PCR、双酶切及测序鉴定重组质粒。重组的自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1经股四头肌注射并联合瞬时电穿孔免疫BALB/c小鼠,同时以原质粒pDREP-eGFP作为对照组,间隔3周后以相同条件再免疫1次,收集小鼠血清,以弓形虫裂解抗原Western blotting检测其诱导产生的特异性抗体。结果 从弓形虫基因组中PCR扩增得到1 011 bp长度的SAG1基因,成功构建重组质粒pDREP-SAG1。Western blotting结果显示,重组质粒免疫的小鼠血清能特异性地识别虫体抗原中的SAG1抗原。结论 成功构建了弓形虫自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1,能诱导小鼠产生特异性的抗体,具有免疫原性。     

猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗不同保存条件下的稳定性研究

目的 研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组双歧杆菌(Bb)疫苗在不同保存条件下的稳定性。方法 分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转入长双歧杆菌(B.longum),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum,分别置于不同条件下保存,取出菌液,抽提质粒,电泳检测,进行稳定性分析。结果 阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum分别在常温下、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃、-196 ℃(液氮中)分别保存48 h、1周、1月、2月,抽提质粒,电泳发现阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum在液氮中、-80 ℃、-20 ℃中比较稳定,而在普通的室温环境下,很快发生质粒丢失现象。结论 猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组Bb疫苗低温保存最稳定,常温最差,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础。     

Antibody responses and epitope specificities to the Taenia solium cysticercosis vaccines TSOL18 and TSOL45-1A

Taenia solium is a cestode parasite that causes cysticercosis in humans and pigs. This study examined the antibody responses in pigs immunized with the TSOL18 and TSOL45-1A recombinant vaccines against T. solium cysticercosis. Immunization with these proteins induced specific, complement-fixing antibodies against the recombinant antigens that are believed to be associated with vaccine-induced protection against T. solium infection. Sera from immunized pigs were used to define the linear B-cell epitopes of TSOL18 and TSOL45-1A. Prominent reactivity was revealed to one linear epitope on TSOL18 and two linear epitopes on TSOL45-1A. These, and oncosphere antigens from other taeniid cestodes, contain a protein sequence motif suggesting that they may show a tertiary structure similar to the fibronectin type III domain (FnIII). Comparison of the location of linear antigenic epitopes in TSOL18 and TSOL45-1A within the proposed FnIII structure to those within related cestode vaccine antigens reveals conservation in the positioning of the epitopes between oncosphere antigens from different taeniid species.     

Vaccines for prevention of cysticercosis

Neurocysticercosis due to Taenia solium infection is an important cause of human morbidity and mortality. Despite the availability of effective anthelmintics, the disease remains prevalent in many parts of the world and there is a need for new and improved measures for control of the infection. An effective vaccine to prevent infection in pigs, the parasite's natural intermediate host, would be a valuable new option to assist with T. solium control. Several approaches are being used currently towards the development of a T. solium vaccine and these approaches are reviewed briefly, with emphasis on the use of recombinant oncosphere antigens. Highly effective vaccines have been developed against cysticercosis in sheep and cattle caused by Taenia ovis and Taenia saginata, respectively. This success has encouraged the adoption of a similar strategy for T. solium. The recent finding that one oncosphere antigen, TSOL18, can induce complete protection against T. solium infection in pigs, highlights the potential for development of a practical vaccine. A vision is proposed for the development of a safe, effective, inexpensive vaccine for pigs, which can be administered in an edible form. Through an international collaborative effort, research is progressing towards the realisation of such a vaccine and its use to reduce the global burden of neurocysticercosis.     

猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组蛋白快速诊断试纸条研制

目的以猪带绦虫六钩蚴重组蛋白(TSOL18)为抗原,建立一种简便快速的猪囊虫抗体检测方法,评价其血清学诊断的价值。方法用胶体金颗粒标记纯化的TSOL18重组蛋白,将兔抗TSOL18-GST-IgG和TSOL18重组抗原分别喷涂于硝酸纤维素膜的质控线和检测线上,与PVC垫板等部件按顺序装配成猪囊虫抗体快速检测试纸条;用该试纸条检测猪血清样品测定敏感性和特异性。结果该试纸条与全囊虫抗原ELISA的相对敏感性和特异性分别为75.0%(12/16)和95.2%(40/42),与剖检计数法的相对敏感性达80.0%(12/15)。试纸条在4℃存放12个月,检测结果稳定,重复性好。结论基于TSOL18建立的胶体金免疫层析试纸条操作简单、快速敏感、稳定性好,可用于猪囊虫病感染的诊断和筛查。     

猪带绦虫六钩蚴TSO18基因研究进展

猪囊尾蚴病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,疫苗是预防控制猪囊尾蚴病的重要手段.TSO18基因是猪带绦虫六钩蚴阶段重要的免疫原基因,被认为是最具有前途的疫苗候选基因.该文综述了猪带绦虫六钩蚴TSO18基因的分子生物学及其疫苗开发的研究进展.     

猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达

目的 在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法 将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转化入长双歧杆菌, IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达情况。结果 酶切、PCR和测序证实,重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(M_r)约为55 kD,与预期结果相一致。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论 猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。