白藜芦醇通过TFEB调节细胞自噬的机制研究

目的研究白藜芦醇对HeLa细胞自噬的影响,探讨白藜芦醇通过转录因子TFEB调节自噬的可能机制。方法用0、12.5、25、50、100μmol/L白藜芦醇处理HeLa细胞后,CCK-8法检测细胞活性;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和TFEB总蛋白水平以及TFEB在核提取液中的水平;荧光显微镜观察GFP-LC3融合蛋白在细胞内分布;荧光定量PCR检测TFEB及其靶基因mRNA水平。结果白藜芦醇处理24 h后HeLa细胞活性降低,激活型Caspase-3蛋白水平增加。白藜芦醇处理增加细胞LC3-Ⅱ蛋白水平,在12h达到高峰,且呈剂量依赖性变化,同时GFP-LC3荧光在细胞内呈点状聚集。白藜芦醇处理增加总细胞和核提取液中TFEB蛋白水平,并增加TFEB自身mRNA及其靶基因mRNA水平。结论白藜芦醇可能通过TFEB在转录水平调节细胞自噬。[营养学报,2019,41(4):374-378]     

c-MET受体拮抗剂NK4对人口腔表皮样癌细胞株KB侵袭能力的影响

[目的]研究不同浓度NK4因子对人口腔表皮样癌细胞株KB侵袭能力的影响.[方法]采用基底膜侵袭实验观察不同浓度NK4因子对人口腔表皮样癌细胞株KB侵袭能力的影响.[结果]在浓度为10 μg/ml时,NK4因子对人口腔表皮样癌细胞株KB侵袭重组基底膜的抑制率为56.4%.[结论]NK4因子具有抑制肿瘤细胞人口腔表皮样癌细胞株KB侵袭的能力.     

自噬基因Beclin1过表达诱导人卵巢癌细胞SKOV3自噬和凋亡的研究

目的:探讨自噬基因Beclin 1在人卵巢癌SKOV3细胞中过表达对其体外生长活性的影响。方法:构建自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1,将其稳定转染SKOV3细胞,实现Beclin 1在SKOV3中的过表达;用MTT法分析Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,用流式细胞仪检测凋亡和自噬情况,电镜和荧光显微镜下观察自噬现象。结果:pcD-NA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后Beclin 1在mRNA和蛋白水平均高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组。Beclin 1在SKOV3中的稳定过表达后G1期细胞明显增多,S期细胞比例明显减少,细胞增殖受到抑制,凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后MDC标记的自噬囊泡平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组。pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后在电镜下可见大量自噬囊泡形成。在荧光显微镜下见pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞中MDC标记的自噬囊泡明显增加。结论:自噬基因Beclin1过表达可诱导人卵巢癌细胞SKOV3自噬和凋亡,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性。     

重组人p53腺病毒药物对人喉癌细胞的抑制实验

[目的]探索p53基因在喉癌基因治疗方面的可行性。[方法]以人喉癌细胞系Hep-2为实验对象,将重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)转染Hep-2细胞,体外实验观察重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)对Hep-2细胞生长的影响。[结果]各浓度重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)(1010、109、108、107)对Hep-2生长均有抑制。尤以1010明显。转染3d后,重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)诱导Hep-2细胞明显凋亡。[结论]重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)对Hep-2细胞生长能有效抑制,能明显诱导其凋亡,为喉癌的治疗提供了临床前依据。     

野生型p53基因对人肺癌细胞的生长抑制作用研究

ＧＬ细胞系是由人肺腺癌建立的癌细胞系，该细胞系ｐ５３基因第２４５密码子发生了Ｇ→Ｔ突变。我们将野生型（ｗｔ）及突变型（ｍｔ）ｐ５３基因分别导入ＧＬ癌细胞系中，对其细胞形态，生长速度，集落形成率以及裸鼠成瘤进行了研究。结果发现导入ｐ５３－ｗｔ后，细胞形态，生长速度，软琼脂生长情况并没有明显变化，但裸鼠成瘤试验发现导入ｐ５３－ｗｔ基因的ＧＬ癌细胞系，成瘤晚，生长速度明显减慢，其速度明显低于对照细胞系和导入ｐ５３－ｍｔ细胞系。而导入ｐ５３－ｍｔ细胞系，成瘤早，肿瘤生长速度明显加快。说明ｐ５３－ｗｔ基因可有效地抑制ＧＬ癌细胞的生长，而ｐ５３－ｍｔ基因则可促进ＧＬ癌细胞的生长。这一研究结果更进一步地证明了ｐ５３基因抗癌功能，对肺癌发生以及肺癌的防治都具有重要意义。     

自噬基因Beclin1在喉鳞癌患者中的表达及临床意义

目的：探讨自噬基因Beclin1在喉鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法：应用免疫组织化学SP法检测77例喉鳞癌组织和22例正常组织中Beclin1的表达,分析Beclin1的表达与喉鳞癌生物学行为的关系。结果：Beclin1表达主要位于细胞浆,与正常组织比较,喉鳞癌组织中Beclin1的蛋白表达阳性率明显降低（P〈0.05）;Beclin1表达与喉癌的临床分型无关（P〉0.05）,与喉癌的T分期、分化程度及淋巴结转移相关（P〈0.05）。结论：Beclin1表达缺失可能是喉鳞癌形成过程中的重要机制之一,可能成为探讨肿瘤发生和抑制肿瘤浸润转移研究的新靶点。     

苯代谢物氢醌促进人T细胞白血病细胞自噬的研究

目的探讨苯代谢物氢醌(hydroquinone,HQ)对人T细胞白血病细胞株(Jurkat细胞)自噬水平的影响及其作用机制。方法取对数生长期的Jurkat细胞,分别暴露于含终浓度为0(对照)、6.25、12.5、25、50μmol/L HQ的培养基处理24 h。采用单丹黄酰尸胺(MDC)染色法检测Jurkat细胞内自噬囊泡的生成;通过透射电子显微镜观察Jurkat细胞内自噬体的超微结构;采用Western blot法检测自噬标志性蛋白微管相关蛋白1A/1B轻链3B(LC3B)、P62蛋白及经典的自噬调节通路磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路中人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源等位基因(PTEN)、Akt与磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表达情况。结果 Jurkat细胞内MDC荧光强度随着HQ浓度的升高而增强,在胞浆中呈点状分布。HQ染毒组Jurkat细胞出现较多的双层膜自噬体结构,伴有线粒体明显肿胀,内质网扩张等超微结构的改变。与对照组比较,各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平及6.25、12.5μmol/L HQ染毒组Jurkat细胞内P62蛋白的表达水平均较高,差异均有统计学意义(P0.05);且随着HQ染毒浓度的升高,Jurkat细胞内LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平均呈上升趋势,而P62蛋白的表达水平呈先上升后下降的趋势。与对照组比较,12.5、25、50μmol/L HQ染毒组Jurkat细胞内PTEN蛋白的表达水平均较高,而各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内p-Akt蛋白的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P0.05);但各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内Akt蛋白的表达水平均无明显改变(P0.05)。且随着HQ染毒浓度的升高,Jurkat细胞内PTEN蛋白的表达水平呈上升趋势,p-Akt蛋白的表达水平呈下降趋势。结论 HQ可促进Jurkat细胞内自噬水平的增加,其作用机制可能与PI3K/Akt信号通路被抑制有关。     

IL-15cDNA转染人喉癌细胞系的建立及其表达的研究

目的建立转人白细胞介素-15(hIL-15)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-15的表达情况。方法将携带人白细胞介素-15的质粒pcDNA3.1( )-hIL-15转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Westernblot和ELISA法对hIL-15的表达进行检测。结果IL-15基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达。RT-PCR电泳结果显示hIL-15基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-15的含量为(185.0±12.2)pg/ml,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-15。结论hIL-15基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达。     

自噬相关蛋白14对氟致人神经母细胞瘤细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨自噬相关蛋白14(ATG14)在氟致神经毒性中的作用.方法 不同浓度氟化钠(NaF)(0、20、40、60 mg/L)染毒人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)24 h,采用CCK-8试剂盒测定细胞存活率,流式细胞术测定凋亡率,免疫印迹法测定UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK...     

白藜芦醇对裸鼠移植瘤bcl-2与bax基因表达影响

目的 探讨白藜芦醇预防性给药对裸鼠胃癌移植瘤细胞凋亡相关基因bcl-2、bax表达影响。方法 胃癌MGC-803细胞建立裸鼠胃癌移植瘤模型,白藜芦醇低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)和高(150 mg/kg)剂量预防性给药;透射电镜、原位末端标记染色(TUNEL)法观察各组裸鼠胃癌移植瘤细胞凋亡发生情况,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化法检测各组裸鼠胃癌移植瘤组织内bcl-2、bax基因和蛋白表达情况。结果 白藜芦醇低、中、高剂量用药组细胞凋亡情况明显高于模型组,中、高剂量组bcl-2值分别为(0.26±0.072)和(0.24±0.083),低于模型组(0.41±0.056),差异有统计学意义(P<0.05);中、高剂量组bax值分别为(1.31±0.11)和(1.47±0.089),高于模型组(1.17±0.045),差异有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示bcl-2蛋白表达低于模型组,而bax蛋白表达高于模型组。结论 白藜芦醇诱导裸鼠胃癌移植瘤细胞凋亡作用与上调bax和下调bcl-2表达有关。     

白藜芦醇对小鼠脂代谢及相关蛋白表达影响

目的探讨白藜芦醇（RSV）对高脂饲料喂养的C57BL/6J小鼠脂代谢及肝脏沉默信息调节因子1（SIRT1）及肝X受体α（LXRα）表达影响。方法雄性C57BL/6J小鼠30只,分为对照组、高脂组和RSV干预组（n=10）,对照组和高脂组分别喂饲基础饲料和高脂饲料,RSV干预组在喂饲高脂饲料同时给予RSV灌胃,第16周测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量,分离小鼠肝脏,测定TG、TC含量以及SIRT1、LXRα蛋白表达水平。结果与对照组比较,高脂组小鼠血清TG、TC、LDL-C含量[分别为（1.25±0.25）、（4.29±0.59）、（1.59±0.20）mmol/L]和肝脏TG、TC含量[分别为（5.78±1.69）、（2.69±1.20）mmol/L]升高,肝脏SIRT1、LXRα蛋白表达水平[分别为（0.36±0.03）、（0.78±0.07）]下降（P<0.05）;与高脂组比较,RSV干预组小鼠血清TG、TC、LDL-C含量[分别为（0.91±0.15）、（3.65±0.36）、（1.39±0.11）mmol/L]和肝脏TG、TC含量[分别为（4.63±1.70）、（1.65±0.89）mmol/L]明显下降,肝脏SIRT1、LXRα蛋白表达水平[分别为（0.41±0.05）、（0.88±0.09）]明显升高（P<0.05）。结论白藜芦醇可有效改善高脂饲料喂养C57BL/6J小鼠脂代谢异常,其机制可能与促进肝脏SIRT1及LXRα表达有关。     

反式二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞中HER2/neu基因表达的影响

目的探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞HER2/neu基因表达的影响。方法利用半定量RT-PCR、SYBR GreenI实时定量RT-PCR(QRT-PCR)、Western blot及免疫细胞化学方法分别检测经2.0μmol/L反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化细胞(16HBE-T)与对照DMSO溶剂组未恶性转化细胞(16HBE-N)之间HER2/neu基因mRNA和蛋白表达水平的差异,及两组细胞内HER2/neu蛋白表达定位分析。结果经几种不同方法检测反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞中HER2/neu基因mRNA和蛋白水平都比对照溶剂组细胞(16HBE-N)表达显著升高(P<0.05)。HER2/neu蛋白定位在胞膜。结论反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在HER2/neu表达增高,其可能与原癌基因HER2/neu被激活作用有关。     

苦参碱诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡的实验研究

目的 研究苦参碱对人喉癌细胞Hep-2的生长抑制作用及凋亡机制.结果 四甲基噻唑蓝(MTT)法测定苦参碱对细胞的抑制作用,荧光显微镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪技术(FCM)观察细胞周期及凋亡.结果 不同浓度苦参碱对Hep-2细胞有明显抑制作用,且呈时间依赖性及剂量依赖性;FCM检测结果 显示:S期细胞比例及凋亡率增高,G2/M期细胞比例下降,且呈剂量依赖性;形态学发现Hep-2细胞染色质凝聚,核碎裂,凋亡小体形成;DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的梯形条带.结论 苦参碱可能是通过将人喉癌细胞周期阻滞在S期,诱导喉癌细胞凋亡,抑制其增殖,发挥其抗癌功能.     

抗癌药物对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞端粒酶活性的影响

目的观察羟基喜树碱、顺铂和环磷酰胺三种抗癌药对Hep-2细胞端粒酶活性的影响。方法运用MTT法测定72h的药物IC50，在此基础上，运用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附法测定细胞经过不同浓度的抗癌药作用不同时间后端粒酶活性的变化。结果羟基喜树碱和环磷酰胺均能抑制Hep-2细胞增殖生长并下调端粒酶活性，而顺铂则促进Hep-2细胞增殖生长并上调端粒酶活性。结论羟基喜树碱和环磷酰胺都能通过直接或间接的方式下调端粒酶活性，其机制可能与药物浓度及时间有关。顺铂则上调端粒酶活性，其机制不清楚。     

白藜芦醇对镍染毒NIH/3T3细胞COX-2 mRNA表达影响的实验研究

研究白藜芦醇对镍染毒小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)损伤的保护作用。将NIH/3T3细胞分为镍染毒组和白藜芦醇干预组,染毒组给予终浓度分别为0.00、100.00、200.00、400.00μg/ml的三氧化二镍(Ni_2O_3)混悬液。干预组在染毒前加入白藜芦醇溶液(终浓度为20μmol/L)预处理2 h,其他处理与染毒组一致。采用MTT法检测细胞生长抑制率;实时定量PCR(real time PCR,RT-PCR)法检测细胞中环氧合酶-2(COX-2)mRNA的表达水平。结果显示,随着染毒浓度的升高,染毒组和干预组细胞生长抑制率均明显增加。在Ni_2O_3染毒浓度100.00、200.00、400.00μg/ml时,干预组抑制率均低于染毒组,差异有统计学意义(P0.05);干预组COX-2mRNA相对表达量分别为4.18±0.18、5.25±1.10、7.34±0.96。干预组COX-2基因相对表达量均低于染毒组,差异有统计学意义(P0.05)。提示,随着镍染毒浓度的增加,NIH/3T3细胞损伤程度增加,COX-2 mRNA表达水平增高,白藜芦醇对镍所致的细胞损伤具有一定的保护作用。     

白藜芦醇对小鼠前脂肪细胞凋亡及细胞周期的影响

目的研究白藜芦醇（Res）对小鼠前脂肪细胞凋亡及细胞周期的影响及其机制。方法分别用25、50、75、100μmol／L的Res干预小鼠前脂肪细胞24、48、72h,并设0μmol／LRes为阴性对照组（每组设3个复孔,重复3次）。全自动倒置荧光显微镜观察细胞的形态学变化、细胞增殖．毒性检测试剂盒检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期。结果形态学上．经50μmol／LRes干预48h后的小鼠前脂肪细胞具有典型凋亡形态学改变。细胞增殖-毒性检测发现,0、25、50、75、100μmol／LRes干预24h细胞增殖率分别为100％、（97．00±1．00）％、（91．00±2．65）％、（90．67±2．52）％和（86．00±3．61）％;干预48h细胞增殖率分别是100％、（86．67±2．52）％、（76．00±2．00）％、（34．33±2．08）％和（30．33±2．52）％;干预72h,细胞增殖率分别是100％、（82．00±2．65）％、（65．67±3．06）％、（21．00±3．61）％和（16．33±3．21）％。偏相关分析结果显示细胞增殖率与干预时间、Res浓度均呈负相关关系（r=-0．72、-0．83,均P〈0．01）。0、25、50、75、100μmol／LRes干预24h,G0／G1期的细胞比例分别为（27．23±2．63）％、（39．03±2．74）％、（80．20±5．15）％、（87．97±3．12）％和（90．80±2．08）％;S期的细胞比例分别为（72．43±2．99）％、（63．93±6．90）％、（19．80±5．15）％、（12．20±2．86）％和（9．20±2．08）％,2个细胞周期的50、75、100μmol／LRes干预组与阴性对照组之间的细胞比例差异均有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。0、25、50、75、100μmol／LRes干预48h,细胞凋亡率分别为（2．90±0．10）％、（5．40±3．81）％、（8．23±4．24）％、（29．77±6．18）％和（27．23±3．17）％;细胞坏死率分别为（7．50±0．87）％、（12．00±4．89）％、（12．27±3．81）％、（12．67±6．13）％和（20．73±2．64）％,100μmol／L的干预组的细胞调亡率、坏死率与阴性对照组的差异均具有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）,其他各组与阴性对照组的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论在一定的剂量范围内（0～100μmol／L）,Res可能抑制小鼠前脂肪细胞生命周期并促进其凋亡。     

Hep-2细胞在严重急性呼吸综合征病原学检测中的应用研究

目的 应用人咽喉上皮癌细胞(Hep-2)对严重急性呼吸综合征(SARS)病例标本进行病原体检测与研究，为该病的预防与控制提供依据。方法 采用Hep-2细胞培养法，对2003年l～2月广东省收集的SARS病例的咽拭子等标本分离致病病原体，并应用电镜形态学、逆转录．多聚酶链反应(RT-PCR)扩增部分基因进行序列分析，并对分离的病原体进行研究。结果 132例SARS病例的3l份咽拭子、100份痰液和l份尸检肺组织标本中有73份标本致单层细胞出现“蚀斑病变”，细胞病变阳性率为55．3％，其中48h阳性率为36．4％。采用巢式PCR(Nested-PCR)对其中25份出现“蚀斑病变”细胞培养物进行检测，能扩增出冠状病毒的特异片段；对中2-18、中2-19等6份Nested-PCR产物进行基因序列分析，结果 显示其核苷酸序列与国内外公布的结果一致，氨基酸序列与已知的人或动物冠状病毒的同源性在58％～76％之间。通过电镜在SARS病例标本(中2-10)病变细胞及l份尸检肺组织标本中观察到衣原体样颗粒和病毒样颗粒。结论 从接种SARS病例标本的Hep-2细胞病变培养物中证实有冠状病毒。     

已烯雌酚与人乳腺癌细胞WISP-2基因表达

目的探讨已烯雌酚（DEs）对人乳腺癌细胞（MCF-7细胞株）WISP-2基因（wnt-1 inducible signaling pathway protein-2）表达的影响及DES在乳癌发生中的作用机制。方法用四甲基偶氮噻唑蓝（M1vr）法检测DES对人乳癌MCF-7细胞生长活性的影响；以免疫细胞化学法及逆转录-聚合酶链反应法检测DES对人乳癌MCF-7细胞WISP-2mRNA和WISP-2蛋白表达影响。结果DES使MCF-7细胞增殖率增加，其吸光度A570值明显上升，与对照组比较，P〈0．05。以10nmol／L的DES分别作用细胞不同时间，A570值随着作用时间的延长而增加。DES可使MCF-7细胞WISP-2mRNA和WISP-2蛋白表达上升，WISP-2蛋白和mRNA的表达强度随药物浓度增加而升高，WISP-2mRNA和蛋白表达随DES作用时间的延长而增加，其效应类似于雌二醇。结论IDES能促进MCF-7细胞增殖，2DES能诱导MCF-7细胞的WISP-2基因表达增加，作用强度随剂量的增加而增加；随着作用时间的延长而上升。