一种新的真核细胞表达载体pEF—BOS的应用

采用一种新的真核细胞表达载体ｐＥＦ－ＢＯＳ在ＣＯＳ细胞内表达了ｇｐ１３０和ＧＡＭ两种分子，并利用免疫沉淀和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ观察了表达结果，发现应用ｐＥＦ－ＢＯＳ表达载体可在ＣＯＳ细胞内获得上述两种分子的较高表达，优于一般常用的ｐＳＶ表达载体。     

基因免疫诱导9.1C3分子内影像类抗独特型抗体的产生

本文分别采用真核表达载体ｐＥＦ－ＢＯＳ及ｐＣＭＶ４构建含起始码和终止码的抗９．１Ｃ３分子单克隆抗体重链可变区基因重组表达质粒９．１Ｃ３ＶＨｐＥＦ－ＢＯＳ及９．１Ｃ３ＶＨｐＣＭＶ４，并将其分别免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。取免疫小鼠血清对Ｋ５６２细胞进行间接免疫染色和流式细胞仪分析表明，基因免疫小鼠体内可诱导９．１Ｃ３分子内影像类抗独特型抗体的产生。     

基因免疫诱导9.1C3分子因影像类抗独特型抗体的产生

本文分别采用真核表达载体ｐＥＦ－ＢＯＳ及ｐＣＭＶ４构建含起始码和终止码的抗９．１Ｃ３分子单隆抗全重链可变区基因重组表达质粒９．１Ｃ３ＶＨｐＥＦ－ＢＯＶ及９．１Ｃ３ＶＨｐＣＭＶ４，并将其分别免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。取免疫小鼠血清对Ｋ５６２细胞进行间接免疫染色和流式细胞仪表明，其因免疫小鼠体内可诱导９．１Ｃ３分子内影像８类抗独特型抗体的产生。     

一种N端缺失的rhGM-CSF(7～127)在大肠杆菌中的表达与调控

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端均缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明三种载体表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的水平分别为２１％，１８．８％和２５％。经过用ＰＣｇｅｎｅ软件和Ｚｕｌｃｅｒ算法分析ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）－３′ＵＴＲｍＲＮＡ的二级结构，表明３′ＵＴＲ在终止密码ＴＧＡ附近形成两个茎－环结构，它可能与ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ载体高表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）有关。表达产物ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）经弱阴离子ＤＥＡＥ交换层析纯化后，纯度达到９２％，比活性为８×１０７Ｕ／ｍｇ。     

c-erbB-2基因工程抗体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

原癌基因ＨＥＲ－２／ｎｅｕ／ｅｒｂＢ－２编码的１８５－ｋＤａ跨膜磷酸糖蛋白为受体酪氨酸激酶家族中的成员。已报道ｃ－ｅｒｂＢ－２在多种腺癌中过表达，其中包括１５％～４０％的早期及转移性乳腺癌和卵巢癌［１］。亦有人报道，约７３％的转移性乳腺癌和卵巢癌过表达 ＨＥＲ－２／ｎｅｕ［２］，表明其为乳腺癌靶向性免疫治疗的理想靶分子。我们采用基因工程技术，构建了ｃ－ｅｒｂＢ－２ ＳｃＦｖ基因，并获得了其在ＣＯＳ７细胞中的表达。ｌ 材料和方法１．ｌ材料ＣＯＳ７细胞为本室保存。载体ｐｃＤＮＡ３．ｌ购自Ｉｎ－ｖｉｔｒ…     

一种N端缺失的rhGM—CSF（7～127）在大肠杆菌中的表…

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端块缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表     

逆转录病毒表达载体N2A／hGM－CSF的构建及其在COS－7细胞的初步表达

用特异性核酸内切酶ＢａｍＨＩ剪切质粒ｐＣＤ／ｈＧＭ－ＣＳＦ，制备人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因片段，低融点胶回收后，连接至Ｎ２Ａ载体ＢｇｌⅡ位点，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，经快提质粒进行酶切鉴定和核酸打点杂交筛选出重组质粒Ｎ２Ａ／ｈＧＭ－ＣＳＦ。利用ＤＥＡＥ－葡聚糖介导该重组质粒转化ＣＯＳ－７细胞，收集４８ｈ培养上清液，免疫学和生物学活性检测表明该上清中表达产物具有天然ＧＭ－ＣＳＦ的活性，而用质粒Ｎ２Ａ转化ＣＯＳ－７细胞，培养上清中未检测出ＧＭ－ＣＳＦ活性。     

诱导条件对TNF—α ScFv在原核系统中表达量的影响

目的：探讨诱导时间对目的蛋白表达量的影响。为大量获得抗ＴＮＦ－α单链抗体提供实验依据。方法：将Ｅ６ＳｃＦｖ基因分别克隆入表达载体ｐＥＴ１５ｂ－Ｅｔａｇ和ｐＢＶ２２０中,构建重组质表达质粒ｐＥＴＥ６ＳｃＦｖ和ｐＢＶＥ６ＳｃＦｖ。在化学诱志和温度诱导两种条件下,于诱导后相同时间点等量取菌体,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对各时间点表达产物扫描定量。     

人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析

目的 在大肠杆菌中表达抗入ＴＮＦ－α单链抗体（ＳｃＦｖ）,并分析它的结合活性和中和活性。方法 在获得抗人ＴＮＦ－αＥＳｃＦｖ基因的基础上,用热诱导载体ｐＢＶ２２０在大肠杆菌中表达Ｅ６ＳｃＦｖ蛋白。ＥＬＩＳＡ测定抗体的结合活性,实时ＢＩＡ技术确定亲和常数。Ｌ９２９细胞毒试验分析其中和活性。结果 克隆了抗人ＴＮＦ－αＥ６ＳｃＦｖ基因的热诱导载体ｐＢＶ２２０在大肠杆菌中,经４２℃热诱导,得到了相对分子质     

逆转录病毒表达载体N2A／hGM—CSF的构建及其在COS…

用特异性核酸内切酶Ｂａｍ Ｈｉ剪切质粒ｐＣＤ／ｈＧＭ－ＣＳＦ，制备人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因片段，低融点胶回收后，连接至Ｎ２Ａ载体Ｂｇ１Ⅱ位点，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，经快提质粒进行酶切鉴定和核酸打点杂交筛选出重组质粒Ｎ２Ａ／ｈＧＭ－ＣＳＦ。利用ＤＥＡＥ－葡聚糖介导该重组质粒转化ＣＯＳ－７细胞，收集４８ｈ培养上清液，免疫学和生物学活性检测表明该上清中表达产物具有天然ＧＭ－ＣＳＦ的活性，而用质粒     

星形细胞瘤中PTEN、Mdm2和p53的表达及其相关性研究

目的: 探讨不同组织病理分级的星形细胞瘤中PTEN、Mdm2和p53的表达水平, 并分析PTEN影响Mdm2、p53表达的信号转导机制。方法: 采用免疫组织化学方法检测68例星形细胞瘤标本中PTEN、Mdm2和p53的表达水平。结果:星形细胞瘤中PTEN、Mdm2、p53的表达水平分别是54.4%(37/68)、41.2%(28/68)、45.6%(31/68)。PTEN阳性标本中Mdm2的表达率(24.3%, 9/37)与PTEN阴性标本中该蛋白的表达率(61.3%, 19/31)相比差异显著, 统计学分析显示PTEN表达与Mdm2表达呈负相关(P＜0.01)。Mdm2表达和p53表达一致符合率达66.2%(45/68), 两者的表达密切相关(P＜0.05)。结论: (1)PTEN、Mdm2和p53表达与星形细胞瘤的组织病理分级相关。(2)抑癌基因PTEN可以下调癌基因Mdm2的表达水平。(3)Mdm2和p53的表达存在一致性。     

AP-4、EZH2基因表达量与子宫内膜癌病灶中细胞凋亡、 上皮间质转化的相关性研究

目的 研究AP-4、EZH2基因表达量与子宫内膜癌病灶中细胞凋亡、上皮间质转化的相关性。方法 回顾分析2017年1月~2018年1月在我院进行切除术治疗的35例子宫内膜癌患者临床资料,收集子宫内膜癌病灶和癌旁病灶适量,提取RNA后分别测定AP-4、EZH2基因表达量,进一步测定病灶中细胞凋亡、上皮间质转化基因的表达量。结果 子宫内膜癌病灶内AP-4、EZH2基因表达量高于癌旁病灶,差异有统计学意义（P＜0.05）;子宫内膜癌病灶内SRPX2、RLIP76、ZEB1、SALL4、TET1、RANKL、N-cadherin的mRNA表达量高于癌旁病灶,Fat-1、ITLN-1、Caspase-3、α-catenin的mRNA表达量低于癌旁病灶;AP-4高表达病灶内SRPX2、RLIP76的mRNA表达量高于低表达病灶,Fat-1、ITLN-1、Caspase-3的mRNA表达量低于AP-4低表达病灶;EZH2高表达病灶内ZEB1、SALL4、TET1、RANKL、N-cadherin的mRNA表达量高于EZH2低表达病灶,α-catenin的mRNA表达量低于EZH2低表达病灶。结论 宫内膜癌病灶内AP-4、EZH2基因高表达量,可以抑制癌细胞凋亡、促进癌细胞上皮间质转化,值得临床予以重视和关注。     

Expression of phosphorylated mTOR and its regulatory protein is related to biological behaviors of ameloblastoma

The present study investigated the relationship between the expression of p-mTOR, p-4EBP1 and p-p70S6K in the cytoplasm and nucleus of ameloblastoma (AB) cells and the invasiveness of ABs. Immunohistochemistry was performed to detect the expression of p-mTOR, p-4EBP1 and p-p70S6K in ABs and the level of these proteins in the nucleus and cytoplasm was scored. There was ectopic expression of p-mTOR in ABs. 27 AB patients were positive for p-mTOR expression in the nucleus and 47 for p-mTOR expression in the cytoplasm. The ectopic expression of p-4EBP-1 was also noted. 23 patients (27%) were positive for p-4EBP-1 expression in the nucleus and 55 (64.7%) for p-4EBP-1 expression in the cytoplasm. The ectopic expression of p-p70S6K was also noted. Of these patients, 33 were positive for p-p70S6K expression in the nucleus (38.8%) and 45 for p-p70S6K expression in the cytoplasm (52.9%). Statistical analysis showed the expression of three proteins in the nucleus of patients with recurrent cancer was markedly higher than that in those with primary cancer. The expression of p-mTOR, p-4E-BP1 and p-p70S6K in the nucleus was related to the invasiveness of ABs. Multivariable analysis with Cox proportional hazards model showed the p-mTOR expression had influence on AB recurrence (OR: 6.417, 95%CI: 1.428-28.824). The possibility of AB recurrence in patients with nuclear p-mTOR expression was 6.417 folds higher than that in those with cytoplasmic p-mTOR expression. The nuclear expression of p-mTOR, p-4E-BP1 and p-p70S6K was associated with biological behaviors (invasiveness) of ABs, and p-mTOR was an independent predictor of AB.     

TrkAsiRNA表达载体构建及对TrkA基因表达的抑制

目的　构建具有特异阻断TrkA基因功能的siRNA表达系统 ,为前列腺癌基因治疗提供新的方法。方法　根据Genbank提供的TrkA基因mRNA序列 ,应用设计软件设计特异性的短链寡核苷酸 ,化学合成后经退火形成双链DNA片段 ,克隆到pSlincerTM2 1 U6载体中 ,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切和序列测定对重组体进行鉴定 ,最后将构建的表达载体转染前列腺癌细胞株 ,观察对TrkA基因表达的影响。结果　酶切和序列测定表明 ,成功构建了siRNA表达载体 ,能够抑制细胞内TrkA基因表达。结论　本研究构建的siRNA表达载体 ,具有阻断TrkA基因的表达的功能 ,为前列腺癌基因治疗提供新的有效的方法。     

Topographic expression of p21WAF1/SDI1/CIP1, bcl2, and p53 is altered at the early stage of colorectal carcinogenesis

We analyzed the expression of p21, bcl2, and p53 in normal and different pathologic mucosa of the human colorectum using immunohistochemistry and cold polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism. The topography of normal mucosa showed; bcl2 and p53 expression restricted to basal epithelial cells and p21 expressed only in superficial epithelial cells. This topographic expression was altered in hyperplastic polyps and adenomas. Hyperplastic polyps revealed absence of or weak bcl2 expression and strong p21 expression without topography. In adenomas, whereas bcl2 expression increased and extended to parabasal and superficial dysplastic epithelium, the increase of p21 expression was limited to surface dysplastic epithelium. p53 was weakly expressed throughout the full thickness of dysplastic epithelium. Bcl2 expression in adenomas was stronger than in carcinomas; p53 expression was converse and p21 expression was variable. In carcinomas, this topographic expression was largely abrogated but p53 mutation (36%) was more frequent than in adenomas (2%). In carcinomas, p21 and p53 expression correlated inversely, but there was no relationship with bcl2. These results suggest that there is precisely ordered topographic pattern of p21, bcl2, and wild p53 expression in normal colorectal cells, but this becomes disordered during the early stage of colorectal carcinogenesis.     

性表达对发情雄性小鼠血清睾酮、雌二醇和间质细胞表达芳香化酶的影响

目的:研究性表达对发情雄性小鼠血清睾酮、雌二醇水平及睾丸组织芳香化酶表达的影响。方法:采用放射免疫法检测发情雄性小鼠性表达组与禁欲组血清睾酮、雌二醇水平以及睾丸组织雌二醇含量;采用原位杂交、免疫组织化学技术检测睾丸组织芳香化酶表达水平。结果:发情雄性小鼠性表达组血清雌激素水平显著性增高,性表达显著上调睾丸间质细胞芳香化酶表达;发情雄性小鼠性表达组睾丸组织匀浆上清液雌二醇浓度较禁欲组显著性升高。结论:性表达可能通过上调发情雄性小鼠睾丸间质细胞芳香化酶表达而提高外周血雌二醇水平。     

miR-183及MAPK1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其意义

目的探讨miR-183及丝裂原激活的蛋白激酶1（MAPKl）mRNA与蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及意义。方法实时定量PCR方法检测NSCLC组织miR-183及MAPKlmRNA的表达水平,Westernblot方法检测NSCLC组织MAPKl蛋白表达;统计分析miR-183与MAPKl蛋白的相关性。结果miR-183在非小细胞肺癌组织中的表达量较癌旁组织明显降低（P〈0．01）,MAPKlmRNA与蛋白在癌组织中较癌旁组织表达明显增高（P〈0．05）;统计分析显示,miR-183表达与MAPKl表达呈显著地负相关关系。结论miR-183在NSCLC组织中低表达,与MAPKl表达呈显著负相关关系。     

表达载体介导的反义RNA抑制人巨噬细胞移动抑制因子的表达

目的：研究表达载体介导的反义RNA对人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)表达的抑制作用。 方法:用亚克隆技术构建可转录MIF反义RNA的真核表达载体pcDNA3-antiMIF。用lipofectamine2000分别将pcDNA3、pcDNA3-antiMIF转染可表达MIF的HEK293(293-MIF)细胞，用Real-time定量PCR鉴定MIF mRNA表达水平。将pcDNA3-antiMIF转化人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，建立可表达MIF反义RNA的HUVECs(HUVECs-antiMIF)细胞。将MIF的真核表达载体pSecTag-MIF转染HUVECs-antiMIF，用Real-time定量PCR鉴定MIF mRNA的表达水平。 结果:正确构建了MIF反义RNA的表达载体pcDNA3-antiMIF。MIF 反义RNA对293-MIF细胞中MIF表达的抑制水平达32%（P<0.05）。建立稳定表达MIF反义RNA的HUVECs-antiMIF细胞株。HUVECs-antiMIF中MIF的表达受到抑制，表达水平降低40%（P<0.05）。 结论:表达载体介导的反义RNA能有效地抑制MIF的表达，建立了稳定表达MIF反义RNA的HUVECs。     

pHsa—m122真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的构建肝脏特异性的微RNA—miR-122真核细胞表达载体并对其表达活性进行鉴定。方法经PCR从人基因组DNA中扩增肝脏特异性的微RNA—miR-122的前体序列，引入酶切位点和Poly T转录终止序列，将其插入siRNA专用真核表达载体pSuper中。将构建载体进行酶切、测序鉴定，再通过共转染含miR-122靶序列的GFP表达质粒后．经荧光显微镜和流式细胞仪及Western Blot检测，鉴定载体功能性表达。结果miR-122的前体序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上，且可表达出具有生物活性的miR-122，将该真核表达载体命名为pHsa-m122。结论成功构建miR-122真核表达载体pHsa-m122，有助于进一步研究miR-122在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用。