匐行恶丝虫感染的分子诊断

匐行恶丝虫病为寄生虫病 ,常因误诊而耽搁了正规治疗 ,尤其当乳房感染导致并发症时。大多数误诊由形态学检测所致 ,为了弥补这一缺憾 ,作者应用直接PCR扩增技术扩增匐行恶丝虫特异性基因型序列 ,对该虫进行鉴别诊断。用于扩增匐行恶丝虫的特异性引物 :DIR3 ( 5′ CCGGTAGACCATGGCATTAT 3′)和DIR4 ( 5′ CGGTCTTGGACGTTTGGTTA 3′) ,与犬恶丝虫鉴别诊断的特异性引物为 :5′ ACGTATCTGAGCTGGCTCAC 3′和5′ ATGATCATTCCGCTTACGCC 3′。从 3位患者的组织中获取成虫 ,所有的患者均经ELISA检测 ,其抗匐行…     

抗生素和抗癌药对白念珠菌定居小鼠肠道和播散的影响

给经口饲白念珠菌(白念)的小鼠口服抗生素、腹腔注射抗癌药,持续3～4周,此间每隔一周处死数只小鼠,检查其盲肠及内脏器官的白念菌落数。结果发现,抗生素和抗癌药处理能增加小鼠肠道内白念定居数量,并促进白念播散至内脏器官。此动物感染模型可用于白念珠菌病播散规律和防治措施等的研究。     

复合PCR检测医学常见重要真菌的研究

目的　建立复合PCR用于快速检测白念珠菌和非白念珠菌医学真菌。方法　设计白念珠菌特异引物用于扩增白念珠菌DNA ;11种医学真菌 (白念珠菌、热带念珠菌、假热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、解脂念珠菌、克鲁斯念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉和黄曲霉 )的DNA用医学真菌通用引物扩增 ;建立由上述两组引物组成的复合PCR ,在一次试验中区分白念珠菌和非白念珠菌真菌。结果　白念珠菌引物只特异扩增白念珠菌DNA ,扩增产物为 779bp ;通用引物扩增上述 11种医学真菌DNA ,扩增产物为 2 6 0bp左右。 12种常见致病细菌、乙肝病毒及人血液白细胞和组织细胞DNA均不被这两种引物扩增。复合PCR扩增白念珠菌DNA产生两条DNA片段 ,其长度分别为 779bp和 2 5 8bp ;非白念珠菌DNA只产生一条 2 6 0bp左右的片段。结论　复合PCR可在一次试验中检出白念珠菌和非白念珠菌 ,因此 ,复合PCR对于医学真菌的检测是一种较快速、敏感和特异的方法。     

多聚酶链反应检测肺炎病人尿样及血清中军团菌DNA

现行的军团菌检测直接荧光测定法(DFA)敏感性差,痰培养耗时长仅能做回顾性诊断。作者用多聚酶链式反应(PCR)法,设计了一对20-mer引物L5SL9(5′-ACTATAGCGATTTGGAA-3′)和L5SR93(5′-GCGATGACCTACTTTCACAT-3′)扩增55rRNA基因编码区104bp片段,首次快速检测出肺炎病     

不稳定性心绞痛患者血浆组织因子途径抑制物水平及启动子-287T→C多态性分析

本研究对不稳定性心绞痛 (UA)患者血浆组织因子途径抑制物 (TFPI)的水平和TFPI 2 87T→C的基因多态性进行了观察 ,探讨TFPI在UA发病过程中所起的作用。1.方法 :选择UA患者 10 2例 (UA组 )和冠状动脉造影无狭窄者 10 0例 (对照组 )进行研究。ELISA法测定TFPI的血浆水平。采用酚抽提法提取全血基因组DNA ,根据TFPI基因序列 ,参考Dider等设计的引物 ,并加以修改 (5′ 端引物 :5′ GAATTCAAATAAGGCTGCGTA 3′ ;3′ 端引物 :5′ GAGGGAGCCTCAGAGTCGGCTTC 3′)。于PCR仪内进行DNA中组织因子途径抑制物相应片…     

恶性肿瘤患者念珠菌感染临床分离株的基因型特征研究

目的建立常见病原念珠菌种间分型方法和白色念珠菌种内的基因分型方法,为临床念珠菌感染的分子诊断和白色念珠菌分子流行病学研究提供依据。方法收集恶性肿瘤念珠菌感染临床株,应用PCR技术扩增念珠菌rDNA的内转录间隔区ITS1-ITS2,根据PCR产物片段的大小进行念珠菌种间分型;采用PCR方法扩增白色念珠菌25S rDNA基因内含子区,以内含子大小及其中可转座I型内含子片段的缺失或插入作为分型依据,对白色念珠菌进行种内基因分型,并对白色念珠菌不同基因型的药敏结果进行分析。结果78株恶性肿瘤患者念珠菌感染临床株依据PCR电泳图谱和科玛嘉显色培养基结果分4种:白色念珠菌58株,大小218 bp;光滑念珠菌10株,大小480 bp;热带念珠菌7株,大小219 bp;克柔念珠菌3株,大小150 bp。临床分离的58株白色念珠菌经PCR方法分为3型:A型32株(450 bp),B型19株(840 bp),C型7株(450、840 bp)。A、B型为主要基因型,B型和C型白色念珠菌对5氟-胞嘧啶的敏感性高于A型。结论PCR方法用于念珠菌种间与种内分型,快速简捷、特异性强、重复性好,比较适合临床念珠菌的分型研究。     

等位基因特异性PCR技术在5-脂氧合酶基因多态性检测中的应用

目的 探讨等位基因特异性PCR技术检测5-脂氧合酶基因六个位点的单核苷酸多态性(SNP)的效果.方法 采集36例哮喘患者外周静脉血2 mL,用0.2％氯化钠处理收集白细胞,采用基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)法直接对已知位点的SNP进行扩增分型.针对野生型和突变型设计3 ′端的碱基,且倒数第二位的碱基设计故意错配的碱基,用以提高引物的特异性.结果 5-脂氧合酶六个位点的SNP检测结果准确清晰.结论 采用本研究设计的引物可以对5-脂氧合酶的六个位点直接扩增分型;与测序法和限制性内切酶酶切法相比,等位基因特异性PCR技术检测5-脂氧合酶六个位点的SNP具有经济、快速、简便、易行等特点.     

慢性胃炎和胃癌的幽门螺杆菌基因分型

目前认为 ,幽门螺杆菌 (Hp)是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要致病因素 ,而且与胃癌关系密切[1] 。本研究应用PCR RFLP基因分型方法分析Hp感染者Hp基因分型 ,鉴定Hp菌株 ,为抗Hp治疗及探讨Hp感染与慢性胃炎、胃癌的关系提供理论基础。一、材料与方法1.材料 :所有标本取自青岛大学医学院附属医院胃镜室 ,其中中、重度慢性浅表性胃炎 36例 ,胃癌 4 5例 ,均经病理证实。以无菌方法采取标本后立即提取组织DNA。2 .引物设计及PCR反应 :引物 :Hp1 S :5′ GAACTA GACTACACCAT 3′ ,Hp2 AS :5′ TGGTTTGAGGGCGAATC 3′ ,…     

SOE法构建甲状腺自身免疫ScFv基因

目的甲状腺自身免疫疾病(AITD)的患者血中有多种抗甲状腺自身抗体.为了构建单链抗体(ScFv)库以获得抗甲状腺ScFv,首先需要构建ScFv基因,我们利用重叠延伸拚接(SOE)法,制备了人源ScFv基因,为建立ScFv库和进一步研究AITD的发病机制及分析甲状腺自身抗体的作用打下基础.方法分离Graves病人血中的单个核细胞.提取总RNA,逆转录合成cDNA.参照文献报道设计引物,重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的引物均采用兼并序列引物,VH5′引物和VL3′引物带有27个互补碱基的接头(linker)编码序列.VL3′引物插入Spel内切酶位点,VH5′引物插入Sacl内切酶位点.先分别通过PCR扩增VH和VL,将纯化的VH和VL扩增产物按照一定比例混合,利用VH和VL互补序列,做15次PCR循环,合成出完整的ScFv基因,再以VH3′和VL5′引物进行PCR获得更多的ScFv基因产物,将ScFv基因重组到p3SCMH噬菌粒中,并做酶切鉴定.结果用PCR扩增VH和VL基因,PCR产物做电泳鉴定,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在380bp和420 bp左右有特异扩增带.将VH和VL的PCR产物用低溶点胶电泳纯化,并分别做DNA定量,将VH和VL的量调整为不同的比例做SOE,制备ScFv基因.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示在800 bp左右有特异扩增带.纯化后的PCR产物,用Sacl+Spel双酶消化后,重组到噬菌粒中,转入XL1-blue大肠杆菌中扩增,再以提纯的重组噬菌粒做模板以VH3′引物和VL5′引物做PCR扩增,同时对重组噬菌粒做双酶切鉴定.琼脂糖凝胶电泳显示,两种鉴定方法均在800bp处有特异条带,证明ScFv连接成功.结论构建未知亲本抗体的ScFv常采用两种方法,一种是将Linker设计在表达载体上,两端各有限制性内切酶位点供VH和VL插入;另一种方法即本文使用的SOE法.前者操作繁杂,而SOE法虽然操作相对简单但不容易成功,它要求VH和VL的量要有严格的比例.由于纯化的VH和VL做准确定量有困难,我们的体会是做SOE时将VH和VL的量以不同的比例混合,以增加成功率.一般认为Linker长度以14～25个氨基酸残基为宜.本文采用的15肽序列(Gly4Ser)3是目前使用最广泛的Linker.本实验制备的ScFv基因已经成功的构建了噬菌体抗体库,并筛选出TRAb噬菌体抗体.     

庚型肝炎病毒感染的流行病学与临床

文章就目前HGV感染的流行病学及临床研究进行了论述。 1.HGV感染的诊断:目前尚未研制出信赖性很高的HGV抗体检测系列,对所有标本采用PCR法检测血清HGV是必要的。作为PCR的引物,现在NS5区或NS3区被使用着,今后5′UTR的引物将被广泛应用。     

丙型肝炎病毒1b型NS3基因扩增方案的改进

目的优化扩增武汉地区HCV1b型患者HCV非结构蛋白3(NS3)的cDNA,并进行测序。方法从患者血清中提取HCVRNA,采用型特异性引物扩增分型法检测HCV患者基因分型。设计3对外侧引物和3对内侧引物,采用套式PCR技术(方案一)分别扩增HCV1b型患者的HCVNS33个区段,然后用3对内侧引物进行测序。为了优化NS3扩增和测序效果和减少操作繁琐,对引物进行改进,设计1对外侧引物和1对内侧引物,采用改进的套式PCR技术(方案二)直接扩增HCV1b型患者的HCVNS3区,然后用3个正向引物和1个逆向引物进行测序。结果改进的套式PCR技术(方案二)与套式PCR技术(方案一)相比,操作较为简单,而且扩增效率增高,扩增效果较好。结论采用改进的套式PCR技术(方案二)扩增和测序HCVNS3区更迅速、有效、实用。     

用3'非编码区通用引物通过RT-PCR检测登革1～4型病毒RNA

目的 　根据登革病毒 (DEN) 3 端非编码区的一段高度保守序列 ,设计登革 1～ 4型通用引物 ,采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测登革病毒 1～ 4型RNA。方法　用C6/ 3 6细胞培养登革病毒。用热酚法提取病毒RNA ,进行RT PCR扩增 ,并对扩增产物测序。结果　DEN 2 NGC株可扩增出至少 10TCID5 0 的病毒 ,测序结果与已知序列一致。DEN 1～ 4型标准株和DEN -2 -0 4与DEN 2 4 3株均能够扩增出唯一的一条特异条带。结论　应用通用引物RT PCR法可从病毒浓度少至 10TCID5 0 的感染细胞培养液中检出DEN 2 NGC株病毒 ,并且该对通用引物对于其他 3型登革病毒亦具有很好的通用性 ,其方法的特异性和敏感性亦较强。     

肥大细胞对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响

目的　检测大鼠腹腔肥大细胞 (mastcell,MC)对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响。方法　SD大鼠体重约 2 0 0g ,雌雄不限 ,供采集MC和原代培养平滑肌细胞 (smoothmusclecell,SMC)。采用梯度密度离心分离MC ,提取MC上清液(含MC释放的各种炎症介质 )。用MC上清液和氧化型低密度脂蛋白 (oxLDL)处理SMC ,实验分四组 :对照组SMC在 5mL含10 %小牛血清的DMEM中培养 4 8h ;oxLDL组SMC在 5mL含 10 %小牛血清的DMEM中 (含oxLDL ,终浓度为 10 0mg L)培养 4 8h ;MC上清液组SMC在 5mL含 10 %小牛血清的MC上清液 (由含 1× 10 6 个MC的细胞悬液提取 )中培养 4 8h ;MC上清液 +ox LDL组SMC在 5mL含 10 %小牛血清的MC上清液 (由含 1× 10 6 个MC的细胞悬液提取 )中 (含oxLDL ,终浓度为 10 0mg L)培养4 8h。采用油红O染色检测SMC泡沫化。RT PCR检测SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达 ,PCR引物序列Ⅰ型胶原为 5′ GACACTGAACCCTTTGTAATG 3′和 5′ GTGAAACTCCCGTCTGCT 3′ ,扩增片段长度为 399bp ;Ⅲ型胶原引物序列为 5′ AGCGGAGAATACTGGGTT 3′和 5′ TGTAATGTTCTGGGAGGC 3′ ,扩增片段长度为 2 88bp ;内参照采用β actin ,引物序列为 5′ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′和 5′ CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3′,扩     

ACT1-qPCR定量分析弓形虫内参引物的筛选与鉴定

目的运用PCR对刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH、PRU、VEG株速殖子和HFF、Vero细胞系以及SPF级昆明鼠脑组织所得DNA样品进行特异性扩增,鉴定并筛选出适合用作弓形虫实时荧光定量PCR(q PCR)分析的内参引物。方法体外培养并无菌收集HFF、Vero细胞系及弓形虫RH、PRU、VEG株速殖子,SPF级昆明鼠经颈椎脱臼处死无菌采集脑组织,并提取基因组DNA。合成弓形虫MIC6基因(Toxo DB:TGME49_218520)特异性引物P1/P2,经PCR扩增鉴定所得样品是否含有弓形虫DNA成分,设空白对照。依照Toxo DB数据库弓形虫ACT1基因参考序列(Toxo DB:TGME49_209030)设计引物,经NCBI Primer-BLAST比对分析后进行合成特异性引物P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10和P11/P12,预期片段大小均为121 bp。以弓形虫RH DNA为模板,采用梯度PCR优化ACT1基因内参引物的退火温度。运用已优化条件对待检DNA样品进行PCR特异性扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,鉴定出适合用于弓形虫q PCR定量分析的内参引物。结果 PCR扩增弓形虫RH、PRU和VEG株DNA MIC6基因时均出现一条长度约为1 050 bp的条带,且空白对照和其他样品无此条带,与预期结果一致,表明所得DNA样品可用。优化退火温度时发现,除P7/P8外其他引物均不受退火温度影响,56℃适合用于PCR或q PCR扩增ACT1基因目的片段的退火温度。以56℃为退火温度对待检DNA进行检测时发现,扩增弓形虫阳性样品时所有引物均能产生1条大小约为121 bp的条带,空白对照无此条带,与预期结果一致。此外,引物P7/P8、P9/P10扩增Vero细胞系和引物P3/P4、P5/P6、P9/P10扩增昆明鼠脑组织DNA样品时均有杂带出现,且有杂带大小约为121 bp;引物P11/P12扩增弓形虫阴性DNA样品时均无杂带出现。结论引物P11(5′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′)和P12(5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)适合分别用作弓形虫q PCR定量分析时扩增ACT1靶基因的上游和下游引物。     

微卫星锚定PCR及其在寄生虫学中的应用

微卫星 DNA是新近发现的一种 DNA遗传标记 ,已初步应用于寄生虫学研究中。要扩增出目标微卫星 DNA,往往需要根据已知的模板序列来设计一对特异性引物 ,在目前对寄生虫基因组还知之甚少的情况下 ,这无疑给研究带来了极大的困难。微卫星锚定 PCR不需要事先知道模板的序列 ,而是利用引物与微卫星 DNA序列互补结合 (在引物的 3′端或 5′端锚定一个或几个寡核苷酸分子 ) ,进而扩增出微卫星 DNA之间的序列 ,从而揭示物种基因组 DNA的差异。微卫星锚定 PCR克服了一般PCR、RFL P以及 RAPD等方法的某些不足 ,具有操作简便、DNA用量…     

恶性疟原虫海南株CSP3′末端基因的克隆及序列分析

目的　构建恶性疟原虫海南株 (FCC1 HN)CSP3′末端基因的原核表达载体 ,并对CSP3′末端基因进行序列测定。方法　根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物 ,采用PCR技术扩增出CSP3′末端基因 ,将其克隆入原核表达载体pGEX 4T 1,转化大肠杆菌JM10 9;阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定 ,用双脱氧链末端终止法进行序列测定。　结果　从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3′末端基因 ,其片段大小为 2 2 5bp ,构建的阳性重组质粒pGEX 4T 1 CSP3′末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致 ,测序结果进一步确认了插入片段的正确性。　结论　成功地构建了CSP3′末端的原核重组质粒 ,为进一步研究其功能奠定了基础。     

弓形虫ITS-1序列PCR诊断方法的建立

目的本文旨在为弓形虫感染的临床病例检测建立特异性PCR诊断方法。方法本研究以弓形虫ITS-1序列为种特异性遗传标记,采用有限稀释法稀释速殖子DNA,经PCR扩增,检测该方法的敏感性;用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫,检测PCR方法的特异性。人工感染小鼠和家兔,用组织触片法和PCR方法检测感染动物的组织,并检测10头临床疑似病猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏和肝脏等组织,比较两者的敏感性。结果该PCR方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子DNA(相当于10个速殖子的DNA);鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带,仅弓形虫出现特异条带(300bp)。组织触片和PCR方法对人工感染小鼠组织DNA的检出率均为87.5%(7/8),对人工感染家兔的检出率分别为50%(3/6)和66.7%(4/6),对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20%,两种方法的检查结果基本一致。结论本试验结果表明,PCR技术可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测方法。     

多引物嵌套式聚合酶链反应在艾滋病病毒感染诊断中的应用

目的 评价多引物嵌套式聚合酶链反应(Nested-PCR)在艾滋病病毒(HIV)感染诊断中的应用。方法 采用柱离心式小量组织/细胞基因组脱氧核糖核酸(DNA)抽提试剂盒提取DNA。用3套分别来自于长末湍重复序列(LTR)-gag、pol、env不同区域的序列引物进行嵌套式PCR扩增。结果 用多引物嵌套式PCR对28例不同来源标本进行检测,其中13例为HIV感染者,4例为HIV可疑感染者,4例为人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)感染者且HIV抗体检测为阴性,7例为正常者。经过检测每一套引物均漏检了1份标本,即每一套引物敏感性均为92.3％。HTLV标本经检测均为HIV阴性。根据判断标准,该检测方法敏感性和特异性均达到100％,最低检测线达到103外周血单核细胞(PBMC)。结论 多引物嵌套式PCR具有高敏感性及特异性,在鉴定HTV感染方面有重要的意义.可作为蛋白印迹试验的补充和辅助诊断。     

在Crohn病组织检出副结核分枝杆菌DNA

长期以来人们一直怀疑副结核分枝杆菌是人类Crohn病的病原菌,但由于该菌在体外培养生长缓慢,用常规方法又难以和鸟分枝杆菌相鉴别,故难以确定它在Crohn病发生中的确切作用。本文应用PCR技术在Crohn病组织中检测副结核分枝杆菌DNA。材料和方法:Crohn病患者40例,溃疡性结肠炎23例,无炎症性肠病者40例作为对照。自手术切除标本取约2cm~2全层肠组织,在-20℃环境中保存备用。苯酚氯仿混合提取法抽提组织DNA,作PCR扩增。两个引物扩增片段位于副结核杆菌特异DNA插入片段IS900的5′区域(第22～421nt),长400bp。模板DNA(1％)用量5μl(相当于0.03 g原始组织,检测灵敏度相当于300个细菌/克组织),用其他分枝杆菌、肠道菌及链霉菌属菌株检测PCR特异性。待测标本同时作PCR阴性对照(只含缓冲液)及阳性对照(模板用10fg副结核杆菌DNA)。结果:IS 900 PCR技术可扩增5fg副结核杆菌DNA,相当于1个靶细菌。各组病人阳性率如下:Crohn病组65％(26/40),其中19例来自小肠,7例来     

聚合酶链反应快速检测胃粘膜幽门螺杆菌

本研究的目的是了解简单的PCR方法诊断幽门螺杆菌感染的价值。选用互补于幽门螺杆菌尿素酶A基因片段的一对引物,建立PCR方法扩增幽门螺杆菌DNA,扩增产物经琼脂糖电泳显示一条411bp区带。用PCR扩增41株HP分离菌均阳性,而空肠弯曲菌等8种肠道细菌均阴性,显示100％特异,系列稀释试验显示PCR能检测0.1pg的HP DNA;126例胃粘膜标本用PCR、尿素酶试验、培养和涂片检查,HP检出率分别为70.6％、56.3％、32.5％和56.3％,这些结果提示简单快速的PCR方法是检测HP的有价值的方法。