TopoⅡ与胶质瘤替莫唑胺化疗耐药性的关系

背景与目的:TopoⅡ与替莫唑胺(temozolomide,TMZ)治疗胶质瘤后产生化疗耐药的关系依然未清楚,本文探讨拓扑异构酶Ⅱ(topoⅡ)与胶质瘤细胞替莫唑胺化疗耐药性的关系。方法:替莫唑胺诱导构建耐药细胞株U251/TR,CCK-8法检测该细胞株的耐药性,RT-PCR法检测topoⅡ在U251和U251/TR中的表达变化。采用siRNA技术沉默耐药细胞株中topoⅡ的表达后,检测其对化疗药物敏感性变化。结果:成功构建TMZ耐药细胞株U251/TR,该细胞系对替莫唑胺有耐药性,其topoⅡ的表达明显升高,沉默topoⅡ的表达后,耐药性成功逆转。结论:TopoⅡ与替莫唑胺化疗耐药性有关。     

不同化疗药物对胶质瘤获得性SLC22A18基因耐药的逆转作用

目的:探讨临床上治疗胶质瘤的不同化疗药物对胶质瘤U251细胞获得性SLC22A18耐药的逆转作用及可能的分子机制。方法:将重组腺病毒载体(Ad)介导的SLC22A18基因联合替莫唑胺(TMZ)、卡氮芥(BCNU)以及顺铂(DDP)3种常见化疗药物处理对Ad/SLC22A18产生耐药的U251-SLC22A18/R胶质瘤细胞,通过MTT比色法检测处理后胶质瘤细胞的存活率,以评估体外不同化疗药物对SLC22A18耐药的逆转作用;在体内进一步评估该逆转策略的有效性;并且通过免疫印迹等方法探讨逆转耐药的可能的分子机制。结果:在体外只有TMZ和BCNU能够使U251-SLC22A18/R细胞对Ad/SLC22A18重新敏感。进一步的研究结果表明联合TMZ和Ad/SLC22A18能在体内有效地抑制U251-SLC22A18/R细胞来源的胶质瘤生长,且联合TMZ和Ad/SLC22A18抑制作用明显比其它对照组强。Ad/SLC22A18和TMZ的联合治疗可以下调MGMT蛋白的表达,并且Ad/SLC22A18和BCNU的联合治疗可以上调Bax蛋白的表达。结论:联合应用Ad/SLC22A18和TMZ或BCNU能在体内外有效地逆转U251-SLC22A18/R细胞对SLC22A18的获得性耐药,TMZ的逆转作用可能与其诱导的MGMT蛋白低表达有关,BCNU的逆转作用可能与其诱导的Bax蛋白过度表达有关。     

脑胶质瘤细胞化疗耐药中p38MAPK信号通路的作用

探讨p38MAPK信号通路在脑胶质瘤细胞化疗耐药中的作用及相关机制。 方法 在 前期建立U251/TMZ胶质瘤耐药细胞株的基础上,用特异性阻断剂SB203580阻断耐药细胞株中 p38MAPK信号通路,替莫唑胺作用下检测耐药株的细胞活性变化,同时检测MDR1、TopoⅡ、BCL-2 等耐药相关基因的蛋白表达变化。 结果 阻断通路后替莫唑胺作用下细胞的抑制率明显低于未阻 断组,两组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）,阻断后耐药细胞中BCL-2、MDR1的表达明 显升高,TopoⅡ的表达明显降低,与未阻断的耐药细胞相比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结 论 U251/TMZ胶质瘤耐药细胞中p38MAPK信号通路被阻断后细胞的耐药性增强,其机制可能与耐药 株中耐药相关基因BCL-2、TopoⅡ、MDR1的表达变化有关。     

胶质瘤干细胞样细胞中MGMT表达以及与替莫唑胺的耐药关系研究

背景与目的:O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltranferase,MGMT)是一种能将鸟嘌呤DNA第六位氧氧原子上的甲基加合物移除和修复损伤DNA的酶,临床上能影响甲基化类化疗药物的疗效。胶质瘤干细胞样细胞被认为是胶质瘤复发的根源之一。本研究旨在探讨MGMT在胶质瘤干细胞样细胞中的表达以及与替莫唑胺耐药的关系。方法:采用悬浮克隆球形成法自胶质瘤细胞株U251、SKMG-4、SF295、SKMG-1、U373、U87、MGR1和MGR2中富集胶质瘤干细胞样细胞。应用免疫荧光技术检测胶质瘤干细胞样细胞相关分子标志;裸鼠移植瘤试验检测胶质瘤干细胞样细胞的成瘤能力。RT-PCR和Western blot检测胶质瘤干细胞样细胞中MGMT的表达;甲基化特异性PCR分析胶质瘤干细胞样细胞MGMT启动子甲基化状况;CCK-8法检测不同浓度替莫唑胺对胶质瘤干细胞样细胞和胶质瘤细胞增殖的作用。结果:分别自8个胶质瘤细胞株中成功富集胶质瘤干细胞样细胞:U251G、SKMG-4G、SF295G、SKMG-1G、U373G、U87G、MGR1G和MGR2G。胶质瘤干细胞样细胞高表达CD133、Nestin和Sox-2等干细胞标志,而且低表达GFAP和TUJ1。胶质瘤干细胞样细胞均能在裸鼠移植成瘤。MGMT在8株胶质瘤细胞及U87G、MGR1G和MGR2G中为阴性,而在U251G、SKMG-4G、SF295G、SKMG-1G和U373G中为阳性表达。替莫唑胺对胶质瘤干细胞样细胞和胶质瘤细胞的抑制作用差异具有显著性。胶质瘤干细胞样细胞与胶质瘤亲代细胞相比更加耐药(P<0.05)。另外,替莫唑胺对MGMT阳性及MGMT阴性胶质瘤干细胞样细胞IC50间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MGMT阴性表达的胶质瘤细胞经干细胞样培养后,MGMT表达可转为阳性;胶质瘤干细胞样细胞较胶质瘤亲代细胞更耐受替莫唑胺;MGMT的表达与胶质瘤干细胞样细胞对替莫唑胺的耐受之间无明显关联,提示胶质瘤干细胞样细胞对替莫唑胺的耐药可能还有MGMT以外的机制参与。     

MGMT、TopoⅡα、Pgp在人星型细胞瘤Ⅱ级中的表达及其意义

背景与目的：耐药相关基因检测,对临床个体化化疗具有参考价值,本研究探讨MGMT、TopoⅡα及Pgp在人星型细胞瘤Ⅱ级的肿瘤细胞中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化法检测MGMT、TopoⅡα及Pgp在24例人星型细胞瘤Ⅱ级的肿瘤细胞中的表达情况。结果：在24例人星型细胞瘤Ⅱ级肿瘤中,MGMT、TopoⅡα、Pgp阳性率分别是29.2%、33.3%、25.0%。结论：依据肿瘤组织耐药基因表达情况可为星形细胞瘤Ⅱ级患者选择适当的化疗方案,进行个体化化疗。     

lncRNA POU3F3 通过调节MGMT的表达影响高级别脑胶质瘤细胞对替莫唑胺耐药

[摘要] 目的：探讨lncRNA POU3F3 通过调节MGMT的表达影响高级别脑胶质瘤细胞对替莫唑胺(temozolomide,TMZ)耐药及其作用机制。方法：选取2016 年1 月至2018 年1 月北京大学国际医院神经外科收治的60 例患者组织标本,其中,脑外伤患者12 例（正常组）、初发高级别脑胶质瘤患者30 例（初发组）、复发高级别脑胶质瘤患者[复发组,已经接受了手术治疗+TMZ综合治疗再次复发的人群]18 例。采用1、2、4 及8 μg/ml TMZ诱导U251 细胞并维持正常生长1 周以构建抵抗U251 TMZ耐药细胞系（U251 TMZ-resistance,U251-TR）;正常组采用相同体积的0.9%生理盐水处理U251 细胞。采用qPCR和Wb检测正常脑组织及神经胶质瘤细胞中POU3F3 和甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（methylguanine DNA methyltransferase,MGMT）mRNA和蛋白的表达水平。慢病毒转染构建稳定干扰POU3F3 的U251-TR细胞系（U251-TR stable interference POU3F3,U251-TR siPOU3F3）,MTT法验证U251-TR 细胞并检测细胞TMZ IC50值,Wb检测细胞中MGMT蛋白的表达水平。结果：与正常组及初发组比较,复发组POU3F3 表达显著增高（P<0.01）,U251-TR细胞TMZ IC50值显著高于U251 细胞（P<0.01）,U251-TR siPOU3F3 细胞TMZ IC50值显著低于U251-TR细胞（均P<0.01）,但高于U251 细胞（P<0.01）;U251-TR细胞POU3F3 及MGMT mRNA和蛋白的表达水平均高于U251 细胞（均P<0.01）,U251-TR siPOU3F3 细胞POU3F3 及MGMT mRNA和蛋白表达水平均低于U251-TR 细胞（均P<0.01）。结论：lncRNA POU3F3 是促进高级别脑胶质瘤细胞TMZ耐药性的关键因素,可能对临床上TMZ耐药的研究有一定的意义。     

脑胶质瘤干细胞和U251人胶质瘤细胞系X线辐射敏感性研究

目的：研究脑胶质瘤干细胞 （Brain glioma stem cell） 和U251胶质瘤细胞系对不同剂量X线的射线敏感性。方法： 从脑胶质瘤组织中分离培养脑胶质瘤肿瘤球, 用CD133免疫磁珠技术分离得到脑胶质瘤干细胞; 经不同剂量X线照射脑胶质瘤干细胞和U251细胞后, 用软琼脂克隆形成实验检测两者的放射敏感性。结果： 1） 从脑胶质瘤组织中分离胶质瘤干细胞。2） 随着照射剂量的增加, 两种细胞的存活率均出现下降, 但肿瘤干细胞的存活率明显高于U251细胞 （t=-3.71, P<0.01）。3） 根据公式SF=exp（-αD-βD2） 对实验数据进行拟合, 得到干细胞和U251细胞的α/β值分别为3.57、 7.15。结论： 脑胶质瘤干细胞与U251胶质瘤细胞系相比具有较强的辐射抗拒性。     

非小细胞肺癌多药耐药性病理学检测的临床意义

 目的 检测113例非小细胞肺癌（NSCLC）中谷胱甘肽巯基转移酶π（GST-π）、肺耐药相关蛋白（LRP）、DNA拓扑异构酶Ⅱa（TopoⅡa）、多药耐药相关蛋白（MRP）和多药耐药基因（MDRt）的表达，观察上述指标与肿瘤I临床病理因素的关系及各指标表达之间的相关性。方法 采用免疫组化SP法检测GST-π、LRP、TopoⅡa蛋白的表达；应用原位杂交技术检测MRP和MDR1 mRNA表达。结果 （1）GST-π、LRP、TopoⅡa蛋白及MRP、MDR1 mRNA在113例NSCLC中的阳性表达率分别为75.2％、80．5％、60．2％、79．6％、51．3％。其中LRP表达最高，MDR1表达最低。（2）LRP、TopoⅡa和MRP的表达分别与肿瘤组织学类型有关。（3）GST-π与MRP（P〈0．05）、LRP与MRP（P〈0．01）、MDR，与MRP（P〈0．01）的表达间具有相关性。结论 （1）多种耐药相关基因的过度表达及其相互作用可能是NSCLC产生原发MDR的重要原因。（2）LRP和MRP过度表达，TopoⅡa高表达和MRP低表达可能分别与肺腺癌、鳞癌的化疗敏感性有关。     

MGMT基因启动子甲基化检测在脑胶质瘤化疗中的意义

背景与目的：如何预测和克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,实施个体化治疗是肿瘤化疗急需解决的问题。与基因启动子甲基化密切相关的DNA损伤修复基因O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O^6-methylguanine-DNA methyhransferase,MGMT）表观沉默与肿瘤对烷化剂药物化疗敏感性密切相关。本研究探讨检测MGMT基因启动子CpG岛甲基化在判断脑胶质瘤患者预后及预测肿瘤对烷化剂药物耐药性中的意义。方法：甲基化特异性PCR（MSP）法检测脑胶质瘤组织及肿瘤细胞株MGMT基因启动子甲基化状态,蛋白印迹和免疫组化法测定蛋白表达。MTF法检测肿瘤细胞株对烷化剂药物敏感性,将患者随访资料针对MGMT甲基化状态绘制Kaplan-Meier生存曲线,并进行log—rank检验分析。结果：39例脑胶质瘤患者组织MGMT基因启动子甲基化发生率为46．2％,蛋白表达阳性率为61．5％,且肿瘤组织中MGMT基因甲基化状态与蛋白表达显著相关（P〈0．05）：6例正常组织均未检测出基因甲基化。MGMT基因过甲基化的脑胶质瘤SHG44细胞株用5-Aza-CdR处理后完全脱甲基化．MGMT蛋白恢复了表达,同时细胞株对烷化剂药物敏感性也发生逆转．由敏感转变为耐受。在采用手术、放疗和烷化剂尼莫司汀化疗等综合治疗的39例脑胶质瘤患者中,MGMT基因甲基化的患者生存率显著高于MGMT基因未甲基化患者（P〈0．05）。结论：MGMT基因甲基化状态与蛋白表达及肿瘤细胞对烷化剂药物敏感性密切相关,有可能替代MGMT蛋白检测成为判断脑胶质瘤患者预后和预测肿瘤对烷化剂化疗耐药性的标志分子。     

人脑恶性胶质瘤耐药相关蛋白的表达及临床意义

目的 探讨耐药相关蛋白在人脑恶性胶质瘤的表达规律，评价其对临床化疗用药的指导意义。方法 免疫组化S-P法检测97例未经治疗的脑胶质瘤6种耐药相关蛋白表达，包括6-氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）、P-糖蛋白（P-gP）、多药耐药相关蛋白（MRP）、拓扑异构酶Ⅱ（TOPoⅡ）、胎盘型．谷胱甘肽S转移酶（GST-π）、和胸苷酸合成酶（TS）。结果 TS在所有病例中均不表达；P-gP仅表达于正常脑组织及肿瘤周边区域的毛细血管；MGMT、GST-π、ToPoⅡ以及MRP均表达于肿瘤细胞，阳性例数（率）分别为53例（54．6％）、97例（100％）、42例（43．2％）和31例（31．9％）；Ⅲ、Ⅳ级肿瘤MRP阳性表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ级肿瘤，而MGMT及ToPoⅡ表达阳性率则较低（P〈0．05），GST-π和P-gP阳性表达与肿瘤分级无关。结论 ①脑胶质瘤细胞表达多种耐药相关蛋白，其原发性耐药可能是多因素综合作用的结果；②P-gP介导的多药耐药（MDR）机制在胶质瘤细胞原发性耐药中作用不大，但可能与血脑屏障、血肿瘤屏障的形成有关；③耐药相关蛋白在脑胶质瘤的表达存在明显异质性，常规联合检测这些蛋白的表达状况有助于临床合理选择化疗方案。     

替莫唑胺联合干扰素α/β治疗胶质瘤移植瘤的实验研究

背景与目的:6-氧甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(06-methylguanine-DNA-methyl transferase,MGMT)是肿瘤对甲基化类药物耐药的重要原因之一.替莫唑胺(temozolomide,TMZ)常规方案对MGMT阳性胶质瘤的化疗效果不理想.本实验在动物体内观察干扰素α/β(interfero...     

SLC22A18基因对人胶质瘤U251细胞化疗药物敏感性的影响

目的:探讨印记基因SLC22A18 (solute carrier family 22,member 18)对人胶质瘤U251细胞化疗药物敏感性的影响及耐药机制的研究.方法:采用脂质体转染法将携带有SLC22A 18基因的重组质粒pIRES2-EGFP-SLC22A18转入U251细胞;分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测SLC22A18 mRNA及蛋白在转染后U251细胞中的表达情况;CCK-8法检测细胞对化疗药物敏感性的变化;FCM法检测SLC22A18表达对细胞凋亡以及对多柔比星在细胞内蓄积浓度的影响.结果:转染SLC22A18基因的U251细胞中有SLC22A18 mRNA及其蛋白的表达;SLC22A18基因转染组U251细胞与对照组细胞比较,U251细胞对紫杉醇的敏感性下降,半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)值上升(t=3.23,P＜0.05),对替莫唑胺的敏感性上升,IC50值下降(t=4.28,P＜0.05).SLC22A18基因转染组和空质粒转染组细胞凋亡率分别为(41.35±4.98)％和(6.25±0.82)％,差异有统计学意义(t=12.05,P＜ 0.01).SLC22A18表达使细胞内多柔比星蓄积浓度明显下降(t=4.25,P＜0.05).结论:SLC22A18表达使人胶质瘤U251细胞对紫杉醇的敏感性下降,对替莫唑胺的敏感性提高,并可能通过降低细胞内化疗药物蓄积产生耐药性.     

Clinical relevance of MGMT in the treatment of cancer.

Anumber of DNA-damaging chemotherapeutic agents attack the O(6) position on guanine, forming the most potent cytotoxic DNA adducts known. The DNA repair enzyme O(6)-alkylguanine DNA alkyltransferase (AGT), encoded by the gene MGMT, repairs alkylation at this site and is responsible for protecting both tumor and normal cells from these agents. Cells and tissues vary greatly in AGT expression, not only between tissues but also between individuals. AGT activity correlates inversely with sensitivity to agents that form O(6)-alkylguanine DNA adducts, such as carmustine (BCNU), temozolomide, streptozotocin, and dacarbazine. The one exception is those tumors lacking mismatch repair, which renders them resistant to methylating agents. A recent study in patients with gliomas confirmed the correlation between low-level expression of the MGMT gene and response and survival after BCNU. An inhibitor to AGT, O(6)-benzylguanine (BG), depletes AGT in human tumors without associated toxicity and is now in phase II clinical trials. Finally, mutations within the active site region of the MGMT gene render the AGT protein resistant to BG inactivation. As a result, mutant MGMT gene transfer into hematopoietic stem cells has been shown to selectively protect the marrow from the combination of an alkylating agent and BG, while at the same time sensitizing tumor cells. MGMT remains a paradigm for development of new agents that modulate known mechanisms of drug resistance in cancer cells and raise the spectra of combinatorial therapies that encompass known drug resistance mechanisms.     

Overexpression of IL-7 enhances cisplatin resistance in glioma

Cisplatin is one of the most commonly used chemotherapeutic agents for glioma patients. In this study, array comparative genomic hybridization (aCGH) was used to identify genes associated with cisplatin resistance in a human glioma cell line. The cisplatin-resistant U251/CP2 cell line was derived by stepwise selection using cisplatin. The genetic aberrations of the U251 parental cell line and the U251/CP2 cells were analyzed using aCGH. RT-PCR was used to detect the expression of the altered genes revealed by aCGH. The sensitivity of glioma cells to cisplatin was determined by using the MTT assay. Apoptosis was detected using flow cytometry and western blot analysis. The IC 50 value of cisplatin in U251/CP2 cells was five times higher than its IC 50 in U251 cells. The U251 cells lost at least one copy each of the CFHR1 and CFHR3 genes, and both CFHR1 and CFHR3 were homozygously deleted in U251/CP2 cells. The U251/CP2 cells gained two to three copies of C8orf70 and IL-7 genes. IL-7 mRNA expression was studied in 12 glioma cell lines, and expression was positively correlated with the IC 50 of cisplatin. Furthermore, IL-7 mRNA expression was also positively correlated with the IC 50 of cisplatin in 91 clinical glioma specimens. Additionally, treatment with recombinant human IL-7 (rhIL-7) enhanced cisplatin resistance and increased the relative growth rate of the glioma cells. Moreover, the apoptosis induced by cisplatin could be inhibited by IL-7. In conclusion, our results suggest that IL-7 may play an important role in cisplatin resistance in glioma.