低温冻存对脐血造血细胞增殖潜能的影响

目前脐血库长期库存脐血造血细胞的唯一有效方法是加入细胞保护剂后深低温冻存[1] ,这使得脐血细胞必然要经历进入深低温状态和复苏两过程 ,因此将不可避免地引起细胞理化性质的变化[2 ] 。从理论上讲 ,这有可能影响脐血造血细胞的生物特性 ,尤其是增殖潜能。为此 ,本研究采用Ｄｅｘｔｒａｎ 4 0 ＤＭＳＯ作为脐血造血细胞低温保护剂 ,探讨低温冻存对脐血造血细胞增殖潜能的影响。1　材料与方法1.1　材　料羟乙基淀粉 (Ｈｅｓｐａｎ ,ＨＥＳ)购自Ｄｕｐｏｎｔｐｈａｒ ｍａ公司 ;二甲基亚砜 (ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ,ＤＭＳＯ…     

脐带间充质干细胞支持脐血单个核细胞冻存复苏后的体外生长

目的:研究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,h UC-MSC)对冻存复苏后脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)体外生长的支持作用,以提高冷冻损伤后的造血细胞在体外的生存率。方法:用组织块培养法分离获得h UC-MSC,流式细胞仪检测其表面分子并诱导分化进行鉴定。分两组培养冻存复苏后的脐血MNCs:一组以h UC-MSC为滋养层共培养,另一组单独培养。光镜下观察两组MNCs密度。培养第10天,流式细胞仪检测两组造血细胞的百分比,并计数MNCs总数和造血细胞数进行对比。结果:成功分离培养获得h UC-MSC,符合各项鉴定标准。共培养组MNCs总数、CD45、CD14及CD19阳性造血细胞数均明显多于单培养组。结论:h UC-MSC可有效支持冻存复苏后脐血MNCs的体外生长。     

F68及其联合DMSO对脐血造血细胞的低温保护作用

目的研究普鲁兰尼克(F68)及其联合DMSO在-80℃条件下对脐血造血干细胞的低温保护作用,为临床应用提供依据.方法脐血造血细胞冻存30、60、90 d后复苏,应用台盼蓝拒染率、集落形成试验、3H-TdR掺入率等,测定经F68保护体系冻存的脐血活力,并与目前通用的冷冻保护剂二甲亚砜及CP-1进行了对比研究.结果在-80℃条件下,F68对脐血造血细胞具有明显的冷冻保护作用,并与DMSO具有协同保护效果,联合F68及DMSO的保护体系可使MNC、CFU-GM的平均回收率及台盼蓝拒染率在第90天时分别达到(83.4±6.3)%,(68.8±7.9)%, (92.5±5.1)%,优于目前通用的细胞冻害保护液CP-1及DMSO.90 d的冻存期内,脐血细胞活力无明显下降.结论 F68及其与DMSO组成的冻存方案对脐血造血干细胞具有良好的冻存保护效果.     

不同的冻存方法对脐血CD34~+细胞的影响

目的 :研究不同冻存方法对脐血CD34+ 细胞的影响 ,探讨脐血CD34+ 细胞先分离后冻存的可能性 ,以寻找脐血保存的更好方法。方法 :对 31份脐血采用全脐血直接冻存 ,分离为单个核细胞冻存 ,和分离为CD34+ 细胞冻存 ,3种不同的冻存方法 ;用造血祖细胞培养技术、活细胞染色技术、流式细胞技术等方法研究冻存前后脐血造血祖细胞活性的变化。结果 :冻存后细胞活度下降 ,集落形成率下降 ,以全脐血冻存组为甚 ;CD34+ CD38- 比例冻存后增高。结论 :先分离后冻存法可行 ,且具有减小冻存体积 ,对造血祖细胞损伤较小的特点 ;早期造血祖细胞可能更能耐受冻存处理     

当归多糖对脐血造血细胞的抗冷冻损伤作用

目的：探讨当归多糖（APS）对脐血造血细胞的抗冷冻损伤作用.方法：采用细胞计数法比较羟乙基淀粉（HES）、明胶、淋巴细胞分离液（Ficoll）分离脐血单个核细胞（MNC）的回收率.应用细胞计数法、台盼蓝拒染法、集落形成实验和流式细胞术,检测冻存1,3,6mo脐血MNC的生物学活性,将脐血MNC与不同浓度APS共培养24h后冻存,1mo后复苏,观察APS对脐血MNC抗冷冻损伤的作用.结果：HES法、明胶法的MNC回收率均大于85%,显著高于Ficoll法（50.00±4.00）%（P〈0.05）;冻存1,3,6mo组MNC,CFU-Mix,CD34＋细胞回收率及台盼蓝拒染率差异均无显著性,且脐血MNC的损伤与冻存时间不相关.APS50,100,200,400mg/L不同浓度APS组MNC,CFU-Mix回收率和台盼蓝拒染率除APS400mg/L组下降外,其余各组明显上升（P〈0.05）;各组组间CD34＋细胞回收率差异无显著性.结论：APS可有效提高脐血造血细胞的抗冷冻损伤能力.     

人脐血粒-单系造血祖细胞冻存研究

目的:观察人脐血在不同温区保存时粒-单系造血祖细胞(CFU-GM)的损伤情况及有效地长期深低温保存的可行性。方法:采用传统的室温制备—程序降温—液氮保存方法,观察脐血造血细胞活力及 CFU-GM 产率。结果:在室温存放12 h 不受影响,而-8℃、-20℃温区存放12 h 其活力及产率下降,产率分别比冻存前减少了15.5%和38.1%,-30℃温区继续下降,而-80%温区未再进一步降低。液氮中不同时间-80℃保存不会进一步降低 CFU-GM 产率。结论:-8℃～-30℃之间是冻存损伤造血祖细胞主要的危险区,而液氮中长期深低温保存不会进一步损伤脐血造血祖细胞。故-80℃冻存脐血比较合适。     

当归多糖对脐血造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究

目的探讨当归多糖(APS)是否具有恢复脐血造血细胞冷冻损伤的作用及与造血生长因子(HGFs)联合促进冷冻复苏后脐血单个核细胞(MNC)体外扩增的效应。方法将冷冻30d的脐血MNC复苏后,立即在常规培养体系中分别加入APS0、50、100、200、400μg/mL,或同时加入HGFs组合,培养24h或14d,采用MNC计数,台盼蓝拒染实验、MTT法、CFU-Mix集落形成实验以及流式细胞术计数CD34 细胞等方法分别观察APS促进冷冻损伤的脐血造血细胞恢复的能力以及APS联合HGFs对脐血造血细胞的扩增能力。结果冷冻复苏后加入一定质量浓度的APS可使脐血MNC数量与台盼蓝拒染率明显增加,造血细胞的增殖能力显著提高,CFU-Mix集落产率明显提高(P<0.05),且能明显提高冻存脐血MNC中CD34 细胞率(P<0.05);一定质量浓度的APS联合HGFs可显著提高冷冻复苏后的脐血MNC扩增倍数及CFU-Mix集落产率(P<0.05);其作用无明显量效关系。结论APS能提高冷冻复苏后脐血造血细胞的活力、增殖能力以及CD34 细胞率,可促进脐血造血细胞冷冻损伤的恢复;与HGFs联合可促进冷冻复苏后的脐血MNC体外扩增。     

脐血造血干细胞不同温度长期冻存效果的实验研究

目的通过观察在不同温度条件下长期冻存的效果,以探讨脐血造血干细胞适宜的保存时间。方法以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,分别采用-80℃冰箱直接冻存和程控降温-196℃液氮冻存,冻存前及冻存3、6及12个月后,应用全自动血细胞分析仪测定脐血单个核细胞(MNC)计数,台盼蓝拒染法显微镜下计数细胞存活率及流式细胞仪测定CD34 细胞计数。结果在-80℃冰箱冻存3个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较差异均无显著性。冻存6个月后,脐血台盼蓝拒染率较冻存前差异有显著性(P<0.05)。冻存12个月后,脐血各项指标较冻存前差异均有显著性,其中台盼蓝拒染率差异存在非常显著性(P<0.01)。在-196℃液氮冻存3、6及12个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较均无显著差异。结论以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,脐血造血干细胞在-80℃冰箱中可以有效保存3个月,6个月后存在部分细胞损害,此时的脐血不适合作干细胞移植。脐血经程控降温-196℃液氮冻存12个月后,造血干细胞仍保存完好,适宜长期保存。     

超低温冻存前后胎儿脐血中NK细胞活性的研究

目的　探讨影响胎儿脐血NK细胞活性的因素。方法　采用台盼蓝染色法检测NK细胞活性 ,脐血MNC用Ficoll分离液离心获得。结果　经液氮 (- 196℃ )冻存后脐血NK活性比冻存前显著提高。结论　提示超低温能解除抑制脐血NK细胞活性的因素     

人参总皂苷对骨髓造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究

目的 探讨骨髓造血细胞的冷冻保存效果及人参总皂苷(TSPG)降低冷冻损伤的作用。方法 以5％二甲基亚砜(DMSO)为冷冻保护剂，采用逐步降温法将骨髓造血细胞在液氮中保存3～5个月，复苏后应用台盼蓝拒染法、集落形成试验、CD34^ 及细胞总数回收率等，测定骨髓造血细胞生物学活性的变化；将不同剂量的TSPG与复苏的骨髓造血细胞共培养，应用集落形成试验、MTT比色分析法及流式细胞术等方法检测TSPG对骨髓造血细胞冷冻损伤可恢复性的影响。结果 骨髓造血细胞在低温保存时一部分细胞会失去增殖能力，但这种损伤并不与保存时间成正比。细胞复苏后，加入合适剂量的TSPG(25μg／mL)，可明显提高冻存骨髓造血细胞的集落产率；TSPG在一定浓度范围内(25～50μg／mL)能促进冻存骨髓造血细胞的增殖；TSPG(25μg／mL)能促进冻存骨髓造血细胞进入细胞增殖周期。结论 TSPG能促进冷冻骨髓造血细胞的复苏、增殖，提高骨髓细胞冷冻损伤的可恢复性，对应用冻存骨髓造血细胞进行造血移植有一定意义。     

脐血单个核细胞分离方法的比较及形态学改变

目的:探索一种简便、高效的脐血单个核细胞分离方法。方法:以Ficoll密度梯度离心法与羟乙基淀粉(HES)分离法进行对比.比较两种分离方法分离脐血所得的单个核细胞(MNC)细胞数,并观察两组单个核细胞不同培养时间下形态学变化。结果:两种分离方法在分离脐血MNC方面存在着显著性差异,其中以HES法效果较好,但HES法所得细胞培养后生长状态欠佳。结论:HES法是一种高效的脐血单个核细胞分离方法,但该法所得细胞的生长状态欠佳,需进一步实验证实。     

早产儿脐血GM-CSF与生后24h内外周血细胞的分析

目的 测定早产儿、足月儿脐血GM-CSF的浓度及外周血细胞计数，探讨脐血GM-CSF的浓度与生后24h内外周血细胞的关系。方法 54例早产儿、13例足月儿出生时采脐血，用ELISA法测定GM-CSF的浓度，生后24h内检测外周血细胞，应用SPSS统计软件包进行分析。结果 早产儿组及足月儿组脐血GM-CSF的浓度与外周血细胞计数无明显差异；孕妇的高危因素和早产儿并发症不影响脐血GM-CSF的浓度；早产儿脐血GM-CSF的浓度与白细胞计数呈正相关；与中性粒细胞淋巴细胞、中值细胞、红细胞和血小板均无相关性。结论 早产儿与足月儿外周血白细胞数量和脐血GM-CSF的浓度无明显差异；早产儿脐血GM-CSF的浓度与生后24h内外周血白细胞呈正相关。     

脐带源性和脐血源性间充质干细胞分离培养方法的比较

目的建立分离培养人脐带间充质干细胞（UCMSCs）和脐带血间充质干细胞（UCBMSCs）的方法,并比较其效果。方法无菌条件下采集健康足月新生儿脐带及脐血各30份,分别通过原代贴壁培养法、酶消化法培养UCMSCs,及淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步分离法获得脐血中单个核细胞培养UCBMSCs。应用含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基,比较UCMSCs和UCBMSCs分离培养的效果与生长形态。流式细胞术检测其表面标志及诱导分化鉴定其分化能力。结果UCMSCs原代贴壁培养法8d左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出且成簇生长,酶消化法培养UCMSCs5d左右均匀生长;UCBMSCs分离培养用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法得到的细胞数量较淋巴细胞分离法明显增多。两种来源MSCs培养方法相比较,UCMSCs原代培养的时间短,培养成功率明显增高。流式细胞仪检测两种来源的MSCs具有MSCs表面标志特征。定向诱导分化结果表明MSCs具有被诱导为成骨细胞、脂肪细胞的分化能力。结论人脐带来源间充质干细胞原代培养周期短,培养效率更高;脐血间充质干细胞的分离方法中羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法效率更高。     

脐血造血细胞的冷冻保存方法的比较

目的 :比较程控降温和 - 70℃冰箱直接保存脐血造血细胞对细胞活性的影响及免疫磁珠分离法对细胞生物学活性的影响。方法 :用密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞后 ,采用联合冷冻保护剂经程控降温后存放于液氮和直接存放于 - 70℃冰箱两种方法冷冻保存一个月 ,从细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率等方面比较这两种冷冻方法的优劣。另外 ,用免疫磁珠分离法正性分选脐带血中CD34+细胞 ,流式细胞仪计数分选前后的CD34+细胞的纯度及回收率 ,并分别进行分选前后的细胞培养。结果 :细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率在冷冻的两组间差异不显著。用免疫磁珠分选后CD34+细胞纯度达 88.3% ,回收率为 4 6 .2 % ,分选后的CD34+细胞比分选后CD34 细胞的细胞活力及集落形成能力明显要高。结论 :两种方法均可对脐血造血细胞进行保存。免疫磁珠分选法能够提供高纯度的造血干细胞 ,其分选过程不会影响细胞的活力及集落形成能力 ,为CD34+细胞分选和移植的临床应用提供实验依据     

特定微环境下诱导脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 在体外分离培养人脐血间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs),探讨脐血间充质干细胞体外培养生长特性及向神经细胞分化的诱导条件.方法 在体外将脐血MSCs进行向神经细胞的定向诱导,观察脐血MSCs的形态变化,并在诱导后第5天用免疫荧光染色检测脐血MSCs中神经元细胞特异性的标志物;并与单纯低糖DMEM培养基培养的对照组脐血MSCs相比较.结果 诱导组中的脐血MSCs生长伸展,形成突起,呈放射状,并可互相形成连接,免疫荧光显示特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)阳性,表现出神经元细胞的特性.而对照组中的脐血MSCs未形成神经样形态结构,免疫荧光NSE阴性.结论 脐血MSCs可在体外经化学方法 定向诱导分化为神经细胞,可应用于神经修复及再生等领域.     

脐血造血细胞的冷冻保存方法的比较

目的：比较程控降温和－70℃冰箱直接保存脐血造血细胞对细胞活性的影响及免疫磁珠分离法对细胞生物学活性的影响。方法：用密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞后，采用联合冷冻保护剂经程控降温后存放于液氮和直接存放于－70℃冰箱两种方法冷冻保存一个月，从细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率等方面比较这两种冷冻方法的优劣。另外，用免疫磁珠分离法正性分选脐带血中CD34＋细胞，流式细胞仪计数分选前后的CD34细胞的纯度及回收率，并分别进行分选前后的细胞培养。结果：细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率在冷冻的两组间差异不显著。用免疫磁珠分选后CD34＋细胞纯度达88.3%，回收率为46.2%，分选后的CD34＋细胞比分选后CD34－细胞的细胞活力及集落形成能力明显要高。结论：两种方法均可对脐血造血细胞进行保存。免疫磁珠分选法能够提供高纯度的造血干细胞，其分选过程不会影响细胞的活力及集落形成能力，为CD34＋细胞分选和移植的临床应用提供实验依据。     

人脐带血内皮祖细胞的分离、培养与鉴定

目的:分离、培养、鉴定人脐带血内皮祖细胞（EPCs）,为获取大量血管内皮祖细胞提供方法。方法:脐带血采集后,采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法获取脐带血单核细胞,再将单核细胞接种于铺设有纤维连接蛋白的培养瓶中,经过体外诱导、培养、分化,完成传代扩增;通过免疫组织化学、免疫荧光染色、流式细胞术对细胞进行鉴定。结果:细胞培养第5天呈现集落样生长,单个细胞呈圆形或梭形,2周后细胞长满瓶底,呈鹅卵石样外观。免疫组织化学检测显示,CD31兔抗人单克隆抗体阳性率91.5%,Anti-Von Willebrand factor antibody（vWF）相关抗原兔抗人单克隆抗体的阳性表达率为72.4%;细胞免疫荧光染色检测显示,吞噬Dil标记的乙酰低密度脂蛋白（+）,发出红色荧光;结合FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ（+）,发出绿色荧光;双染（+）,呈黄色荧光。流式细胞术检测CD34阳性率93%,血管内皮细胞生长因子受体2阳性率88.5%,CD133阳性率84.8%。结论:从脐带血中可获取大量CD34+、VEGFR-2+及CD133+血管内皮祖细胞。     

CD133~+人脐血造血祖细胞的干性维持培养及鉴定

目的从人脐带血中分选出CD133+造血祖细胞,并进行长时间干性维持培养。方法通过免疫磁珠法分选出人脐带血中的CD133+造血祖细胞,经流式细胞仪检测免疫磁珠分选后的CD133+造血祖细胞。采用五种方法扩增培养该细胞,8周后,再通过细胞形态学、流式细胞术、免疫细胞化学和免疫荧光对细胞进行干性鉴定,探索最佳干性维持培养方法。结果通过免疫磁珠法可以从人脐带血中分选出80%以上的CD133+造血祖细胞。采用优化的无血清培养基培养8周之后,CD133+造血祖细胞可得到有效扩增。而其他的培养基会使CD133+造血祖细胞由半悬浮细胞分化为梭形贴壁细胞,并且细胞状态欠佳。结论利用免疫磁珠法分选出的CD133+造血祖细胞,采用优化的无血清培养基能够有效扩增该细胞,并可长期有效的维持其干性。     

新生儿脐血细胞的成分特点和免疫学检测分析

目的 对新生儿脐血细胞成分特点、血生化、免疫球蛋白及补体进行分析，并检测脐血CD34^＋细胞数，探讨脐血的组成特征和CD34^＋细胞的含量特点。方法 分类计数用Olympass显微镜；用己糖激酶法分血清TP、ALB、GLB水平；用Beckman Array360 System自动免疫分析仪分析血清IgG、IgA、IgM、补体C3、C4水平；用流式细胞仪Pro Count软件分析脐血CD34^＋细胞百分率。结果新生儿脐血细胞既不同于新生儿静脉血，也不同于成人血，在脐血中出现幼稚红细胞及幼稚粒细胞。其中只有中幼红细胞所占比例有显著性性别差异（P〈0．01），其余均无性别差异（P〉0．05）。新生儿脐血细胞中有核红细胞的数量与其血红蛋白的浓度也不成比例。脐血中血清TP、ALB、GLB、IgA、IgM、补体C3、C4水平均明显低于成人外周血；脐血CD34^＋细胞占有核细胞百分率为（0．97±0．24）％。结论 新生儿脐血细胞具有特殊性，在新生儿免疫状况研究及脐血输注等方面具有重要意义。脐血不仅能正确指导新生儿的医疗保健及疾病防治，而且脐血输注与移植比成人外周血有着更广阔的应用前景。     

维甲酸联合脑源性神经生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞（MSCs）向神经样细胞定向诱导分化的条件及方法,以明确其神经分化潜能。方法将人脐血MSCs体外培养扩增、保存后,取第5代的MSCs分别用维甲酸（RA,RA组）、维甲酸联合脑源性神经生长因子（BDNF,RA＋BDNF组）诱导方法向神经样细胞诱导,诱导分化期间观察细胞形态变化,同时设对照组,对照组不加任何诱导分化剂,比较3组巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NES）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达差异。结果两种不同诱导方法均能诱导细胞发生典型变化,对照组未发现神经样细胞生长。免疫组化法显示3组诱导后均表达nestin、NSE、GFAP,BDNF＋RA组的表达量多于RA组。Real-time RT-PCR显示诱导组及对照组均有NSE mRNA、GFAP mRNA表达,但RA组、RA＋BDNF组诱导后表达上调（P〈0.05）,且RA＋BDNF组较单纯RA组上调明显（P〈0.05）。结论脐血MSCs经两种神经营养因子诱导均可分化为神经样细胞,并表达神经元特异性标志物,其中添加BDNF后较单纯应用RA诱导效果好。