银杏内酯B促进体外培养胚胎大鼠脊髓神经细胞生长发育的研究

目的探讨GB对体外培养的胚鼠脊髓神经元存活和生长发育的作用。方法胚胎大鼠脊髓神经细胞原代培养,相差显微镜下进行细胞计数和显微测量,观察GB对神经元存活和生长发育的作用。对培养7d细胞行NSE免疫组化染色,光镜下观察GB对NSE染色阳性神经元生长发育的影响。结果GB及NGF能够促进体外培养胚胎大鼠脊髓神经细胞及NSE染色阳性神经元的存活,促进其细胞及突起的生长。其促进脊髓神经细胞的存活、胞体及突起发育的作用与NGF一致,而其促进神经突起分化与生长的作用强于NGF。结论NGF和GB能促进培养大鼠发育期脊髓神经元存活、分化和生长,并且表现出各自作用的特异性。     

普拉克索和罗匹尼罗对体外培养的多巴胺神经元的神经营养作用

目的 :探讨新型选择性多巴胺D3受体激动剂普拉克索和罗匹尼罗对多巴胺神经元的神经营养作用及其机制。方法 :在大鼠的腹侧中脑细胞和不同部位星形胶质细胞培养基中加入普拉克索和罗匹尼罗刺激 ,观察药物对多巴胺神经元存活的影响。结果 :药物直接作用或从黑质区星形胶质细胞培养基中提取的条件培养液均可使酪氨酸羟化酶 (TH )阳性神经元数量增加 ,同时培养液中脑源性神经营养因子 (BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)含量增加。而其他脑区的星形胶质细胞不能产生类似作用。结论 :普拉克索和罗匹尼罗对多巴胺神经元具有神经营养作用 ,这可能是由于其使特定区域星形胶质细胞产生并分泌了神经营养因子。     

丙戊酸钠对帕金森病小鼠多巴胺能神经元及胶质细胞源性神经营养因子表达的影响

帕金森病(Parkinson's disease ,PD)是一种神经系统退行性疾病,主要表现为中脑黑质致密部多巴胺能神经元的丧失,纹状体多巴胺含量下降[1],至今尚无有效的治疗手段.丙戊酸钠(valproate,VPA) 是临床上作为治疗双相精神障碍的药物,能有效控制患者的躁狂和抑郁症状[2].胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)最初从大鼠胶质瘤细胞系B49条件培养液中分离纯化,对大鼠中脑多巴胺能神经元有特异性营养作用[3].为探讨VPA对小鼠帕金森病中脑黑质多巴胺能神经元及纹状体GDNF表达的影响,本研究拟用C57BL小鼠1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyfidine,MPTP)法建立帕金森病模型,通过中脑黑质致密部(SNc)酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学染色及原位杂交方法观察纹状体GDNF表达,有望为PD寻求更有效的治疗手段,并对VPA更广泛的临床应用提供依据.     

毛钩藤碱对6-羟基多巴胺诱导的帕金森病模型大鼠神经保护作用及机制研究

目的 探讨毛钩藤碱对帕金森病(Parkinson′s disease, PD)模型大鼠的神经保护作用及机制。方法 采用右侧中脑黑质致密部注射6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)制备大鼠PD模型,将建模成功的PD大鼠随机分为模型组、美多芭组、毛钩藤碱低剂量和高剂量组,同时设置正常对照组,每组12只。给予相应药物灌胃干预,每天1次,连续1个月。采用旋转试验、转棒试验和Morris水迷宫试验检测大鼠行为学变化;HE染色法观察大鼠右侧中脑黑质病理学变化;高效液相色谱法(HPLC)检测大鼠右侧纹状体中多巴胺(dopamine, DA)水平;免疫组化法检测大鼠右侧中脑黑质中多巴胺能神经元标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)表达;ELISA法检测大鼠右侧中脑黑质IL-6、IL-1β和TNF-α水平;Western blot检测大鼠右侧中脑黑质中NF-κB p65、NF-κB抑制因子α(IκBα)、p-IκBα等蛋白表达水平。结果 毛钩藤碱能显著改善PD大鼠行为学障碍及中脑黑质损伤,升高纹状体DA含量及中脑黑质中TH阳性神经元数量和Iκ...     

白藜芦醇抗帕金森病黑质细胞凋亡的实验性研究

目的　研究帕金森病(PD)动物模型黑质细胞的凋亡情况及白藜芦醇对神经的保护作用。方法　成年健康SD大鼠1 0 0只,分为5组,每组2 0只。PD模型组应用脑立体定位仪注入6 羟基多巴胺和0 . 2 %抗坏血酸生理盐水混合液至中脑黑质,诱发PD模型;白藜芦醇实验组应用脑立体定位仪注入6 羟基多巴胺和白藜芦醇混合液;正常对照组应用脑立体定位仪注入0 . 2 %抗坏血酸生理盐水混合液,术后观察SD大鼠旋转行为,及应用TH免疫组化和Tunel法观察白藜芦醇对黑质神经元的保护作用。结果　TH染色可见白藜芦醇实验组黑质部位损毁较轻、有较多的残存TH阳性细胞。6 羟基多巴胺模型组TH染色黑质大部毁损,几乎无残存的TH阳性细胞。旋转试验结果,白藜芦醇实验组大鼠旋转次数平均2 0 6圈/ 30分;6 羟基多巴胺模型组模型鼠旋转次数平均31 4圈/ 30分;两者存在统计学差异(P <0 . 0 5 )。术后第2天检测黑质细胞凋亡情况,白藜芦醇实验组黑质细胞凋亡较少,细胞棕黑色,可见凋亡小体;6 羟基多巴胺模型组黑质细胞凋亡数量较多。结论　白藜芦醇具有神经保护作用。     

白藜芦醇抗帕金森病黑质细胞凋亡的实验性研究

目的　研究帕金森病(PD)动物模型黑质细胞的凋亡情况及白藜芦醇对神经的保护作用。方法　成年健康SD大鼠100只,分为5组,每组20只。PD模型组应用脑立体定位仪注入6-羟基多巴胺和0.2 %抗坏血酸生理盐水混合液至中脑黑质,诱发PD模型;白藜芦醇实验组应用脑立体定位仪注入6-羟基多巴胺和白藜芦醇混合液;正常对照组应用脑立体定位仪注入0.2 %抗坏血酸生理盐水混合液,术后观察SD大鼠旋转行为,及应用TH免疫组化和Tunel法观察白藜芦醇对黑质神经元的保护作用。结果　TH染色可见白藜芦醇实验组黑质部位损毁较轻、有较多的残存TH阳性细胞。6-羟基多巴胺模型组TH染色黑质大部毁损,几乎无残存的TH阳性细胞。旋转试验结果,白藜芦醇实验组大鼠旋转次数平均206圈/ 30分;6-羟基多巴胺模型组模型鼠旋转次数平均314圈/ 30分;两者存在统计学差异(P<0.05 )。术后第2天检测黑质细胞凋亡情况,白藜芦醇实验组黑质细胞凋亡较少,细胞棕黑色,可见凋亡小体;6-羟基多巴胺模型组黑质细胞凋亡数量较多。结论　白藜芦醇具有神经保护作用。     

新型非免疫活性的FKBP_(12)配基N308促神经生长和神经损伤保护作用的体外评价

目的评价新型非免疫抑制的FKBP12配基N308在体外促神经生长和神经损伤的保护作用。方法采用鸡胚背根神经生长实验评价N308体外促神经生长作用;在原代培养的大鼠中脑多巴胺神经元损伤和大脑皮层神经细胞缺氧损伤的模型上观察N308的保护作用。结果 N308能够协同神经生长因子(NGF)对鸡胚背根神经节的神经纤维生长,具有明确的促进作用,在10～1000 pmol.L-1浓度范围内表现出良好的剂量依赖关系。在0.3～30 nmol.L-1浓度范围内N308明显提高缺氧诱导的大脑皮层神经细胞的存活率;0.5μmol.L-1 N308对6-OHDA诱导的大鼠中脑多巴胺神经元细胞损伤具有明确的保护作用,使细胞突起明显增长。结论 N308在体外具有明确的促神经生长及神经损伤的保护作用。     

Genistein对他莫昔芬预处理后多巴胺能神经元的保护作用

目的：观察他莫昔芬阻断雌激素受体后,genistein（GST）对多巴胺能神经元是否具有保护作用。方法：取孕14～16天SD大鼠胚胎中脑腹侧部,常规体外培养后分为4组：正常对照组、GST＋MPP^＋组、TAM＋GST-4-MPP^＋组和MPP^＋组。用TH免疫细胞化学染色观察各组TH阳性神经元的生长状况。用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞活力和代谢状态。用Western Blot观察各组bax蛋白的表达情况。结果：TAM＋GST＋MPP^＋组与GST＋MPP^＋组相比,TH阳性神经元数量有所减少,突起长度变短,细胞活力差,bax蛋白的表达量增加,差异有统计学意义。同时MPP^＋组与TAM＋GST＋MPP^＋组相比,TH阳性神经元数量减少,突起长度短,细胞活力最差,bax蛋白的表达量最多,差异均有统计学意义。结论：TAM能部分下调GST对多巴胺能神经元的保护作用;GST除了通过ER途径发挥保护作用外,还可能经其他途径发挥保护作用。     

果糖二磷酸锌对体外培养新生大鼠海马神经细胞生长发育的影响

目的　研究不同剂量果糖二磷酸锌 (ZnFDP)对体外培养新生大鼠海马神经细胞的生长发育的影响。方法　采用体外培养的新生大鼠海马神经细胞 ,在血清培养液中加入低、中、高剂量ZnFDP ,使之终浓度分别为 2 .5、12 .5、12 5 μg·ml-1,通过细胞形态学观察 ,神经元突起和胞体生长状况的定量比较 ,不同培养期细胞存活数和培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)渗漏量的测定 ,分析研究了ZnFDP对海马神经细胞生长发育的影响。结果　培养 36h后与对照组比 ,中剂量ZnFDP组海马神经元的突起数目增多 ,突起长度增加 ,胞体长径没有显著性变化 ;低剂量ZnFDP组与对照组比各项指标没有显著差别 ;高剂量ZnFDP则明显抑制神经细胞分化。培养 3d、7d、10d ,中剂量ZnFDP组细胞存活数明显高于对照组 ;培养 7d、10d ,中剂量ZnFDP组LDH渗漏量明显低于对照组。结论　一定量的ZnFDP能促进海马神经细胞的生长发育。     

鱼藤酮对大鼠中脑神经元多巴胺转运、储存和代谢的影响

目的探讨鱼藤酮对多巴胺(DA)神经元选择性毒性作用的可能机制。方法大鼠背部sc鱼藤酮(1.0或1.5mg.kg-1.d-1)28d,观察大鼠的外观和行为变化。然后麻醉处死大鼠,取中脑黑质组织。分别用免疫组织化学法、Western蛋白印迹法和RT-PCR法检测鱼藤酮对大鼠中脑黑质DA神经元突触囊泡单胺转运体(VMAT2)表达的影响;以卞胺为底物进行比色,检测组织单胺氧化酶(MAO)的活性;高效液相色谱-荧光检测器流速梯度法测定黑质组织内DA及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的含量。结果注射鱼藤酮28d后,大鼠发生外观和行为改变,出现类帕金森病症候群特征;中脑黑质DA神经元VMAT2蛋白免疫深染的细胞数量减少;鱼藤酮1.0和1.5mg.kg-1组VMAT2蛋白和基因表达与正常对照组比较明显降低,MAO活性分别从对照组的(23.6±7.6)升高至(37.8±5.0)和(40.5±4.3)kU.h-1.g-1蛋白,均具有统计学意义;实验组大鼠中脑黑质组织内DA及其代谢产物DOPAC和HVA含量明显减少。结论鱼藤酮可抑制大鼠中脑黑质DA神经元VMAT2的表达,增强DA代谢相关酶MAO的活性,进而影响DA的转运、储存和代谢,这可能是鱼藤酮DA神经元选择性毒性作用机制之一。     

Activation of TRPV1 in the VTA excites dopaminergic neurons and increases chemical- and noxious-induced dopamine release in the nucleus accumbens.

Dopamine (DA)-containing neurons of the ventral tegmental area (VTA) provide dopaminergic input to the nucleus accumbens and to the prefrontal cortex within the mesolimbic pathway. In the present study, we combined electrophysiological recordings and microdialysis techniques to investigate the function of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) channel in the VTA. In brain slices, application of the TRPV1 receptor agonist capsaicin increased the firing rate of rat dopamine neurons and in a proportion of tested cells (44%) it also induced a bursting behavior. The effects of capsaicin were concentration dependent. The increase in neuronal firing was dependent on enhanced glutamatergic transmission since it was blocked by the superfusion of the ionotropic glutamate antagonists, CNQX and AP5. Interestingly, microinjection of capsaicin into the VTA and noxious tail stimulation transiently enhanced dopamine release into the nucleus accumbens. Both the in vitro and in vivo effects were mediated by TRPV1 activation in the VTA since they were reduced by co-perfusion of the selective TRPV1 receptor antagonist iodoresineferatoxin. Our data suggest a novel role for TRPV1 channels in the mesencephalon of rat, namely activation of the DA system following a peripheral noxious stimulation.     

川芎嗪对大鼠大脑皮层神经细胞的体外存活及其钙超载的影响

目的:研究川芎嗪对体外培养的大鼠大脑皮层神经细胞的保护作用及其钙超载的影响。方法:取出生1d内的乳鼠大脑皮层制成细胞悬液,接种于经多聚赖氨酸包被的培养板。于培养6d后,加入不同浓度的川芎嗪,继续培养1d,采用MTT比色法测量其存活细胞的吸收值,同时行NSE检查。采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术检测药物对谷氨酸(500μmol·L-1)、KCl(50mmol·L-1)诱导培养6d的大脑皮层神经细胞内钙超载的影响,计算荧光强度变化率。结果:NSE检查结果表明,培养6d的存活细胞大部分均为神经元。MTT比色检查结果表明,川芎嗪浓度为1.6～200.0μg·mL-1时,存活细胞数均明显增加(P<0.05)。LSCM测定结果表明,100μg·mL-1川芎嗪能明显降低荧光强度变化率(P<0.01)。结论:川芎嗪能促进体外培养的大脑皮层神经细胞存活,且可抑制谷氨酸、KCl诱导的神经细胞内钙超载,这可能是其治疗缺血性脑血管病的作用机制。     

神经营养因子Neurturin在Vero细胞中的表达及其生物学活性研究

目的探讨Neurturin(NTN)基因转染Vero细胞后的表达情况,为恒河猴帕金森病(PD)基因治疗打下基础。方法将表达载体pcDNA3-hNTN转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对表达的人NTN蛋白进行了体外生物学活性测定。结果pcDNA3-hNTN质粒转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆且有目的蛋白hNTN表达,表达的hNTN在体外能够促进培养的鸡胚背根神经节长出神经突起,并能促进体外培养的胚胎中脑多巴胺能神经元的存活。结论获得了能稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,其表达的hNTN对体外培养的中脑多巴胺能神经元具有保护作用,为移植并进行PD猴基因治疗动物实验打下了基础。     

Excretion process of copper from copper pre-loaded rat liver parenchymal cells

Excretion of copper from copper pre-loaded rat liver parenchymal cells was investigated. The copper pre-loaded cells were isolated from the liver of copper-administered rats and were maintained for 4 days in modified Williams medium E; sodium pyruvate was increased while calcium was reduced in concentration, and 10% fetal bovine serum and insulin were added. For the first 30 hr after plating, loss of copper was slow, with a half-life of more than 100 hr: subsequently the rate of loss was faster, with a half-life of 51 +/- 9 hr. Copper pre-loaded in the cells was mostly bound to metallothionein and the amount of copper-metallothionein decreased with time of culture. Furthermore, the relative ratio of the two iso-metallothioneins changed with length of culture.     

舒郁胶囊对大鼠海马原代培养神经元Ca~(2+)-CaM通路的作用

目的观察海马神经元内Ca2+浓度和CaM蛋白水平表达变化,探索复方舒郁胶囊治疗抑郁情绪的微观作用机制。方法采用孤养结合慢性温和刺激复制抑郁情绪大鼠模型,以调肝方药舒郁胶囊及其君药柴胡提取物进行干预,氟西汀作为阳性对照药,制备各组大鼠血清;运用原代无血清培养技术培养大鼠海马神经元,以制备的各组大鼠含药血清孵育神经元;采用荧光探针Fluo-3/AM染色和细胞免疫荧光技术,分别测定海马神经元胞内[Ca2+]i和CaM蛋白表达水平。结果与正常组相比,模型血清组细胞内[Ca2+]i和CaM蛋白表达水平明显降低(P<0.05);各含药血清组神经元胞内[Ca2+]i和CaM蛋白水平较模型血清组明显升高(P<0.05),与正常血清组差异无显著性。结论舒郁胶囊调控海马神经元胞内Ca2+-CaM体系的变化可能是其治疗抑郁情绪的作用机制之一。     

慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内转移对帕金森病大鼠模型的保护作用

目的探讨慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因直接转移对帕金森病(PD)大鼠的保护作用。方法将携带TH、GDNF基因并含启动子为Palb的四环素应答元件的慢病毒(Lv-TH-GDNF)和四环素反式作用子rtTA2s-M2病毒共同注射到SD大鼠左侧纹状体,用强力霉素(DOX)诱导大鼠目的基因GDNF和TH的表达。1周后在大鼠的同侧纹状体注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)损毁纹状体的DA能神经元。通过旋转行为、黑质TH免疫组化染色以及高效液相色谱-电化学方法(HPLC-ECD)检测纹状体DA含量评估其保护效应;通过RT-PCR、免疫印迹观察Lv-TH-GDNF在脑内的表达。实验与健康对照组、磷酸缓冲液(PBS)对照组进行比较。结果在6-OHDA损伤后4周,Lv-TH-GDNF+rt-TA2s-M2+DOX组大鼠阿扑吗啡诱发的旋转效应均明显低于PBS对照组(P<0.01),损毁侧的的黑质区TH阳性细胞表达强度、纹状体DA含量均明显高于PBS对照组(P<0.01),但二者均低于健康对照组(P<0.01)。RT-PCR、免疫印迹结果显示,与PBS对照组比较,Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2+DOX组大鼠纹状体TH、GDNF基因的表达明显增高(P<0.01)。结论慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内直接转移,在强力霉素诱导下可减缓6-OHDA诱发的大鼠DA能神经元进行性变性,具有保护作用。     

大豆磷脂对体外培养乳鼠神经细胞损伤保护作用的研究

目的:观察大豆磷脂脂质体(SPL)对谷氨酸所致培养乳鼠神经细胞损伤的保护作用。方法:取新生大鼠(0~1d)大脑皮层神经细胞进行原代培养,8~10d后加入谷氨酸(Glu),造成神经细胞的损伤,SPL保护组在Glu损伤处理的同时加入不同浓度的大豆磷脂脂质体,测定乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)的含量,观察谷氨酸对神经细胞的兴奋毒性及大豆磷脂脂质体的保护作用。结果:加入谷氨酸后,神经细胞出现明显损伤性变化,培养上清液中LDH含量增加,细胞匀浆中MDA生成增加,SOD含量明显减少。大豆磷脂脂质体在0.2mg/ml~1.6mg/ml浓度时能显著减轻上述损伤性变化。结论:大豆磷脂脂质体对谷氨酸所致培养乳鼠神经细胞兴奋毒性损伤具有显著的保护作用,其机制可能与大豆磷脂脂质体抗脂质过氧化作用有关。     

Functional reduction of SK3-mediated currents precedes AMPA-receptor-mediated excitotoxicity in dopaminergic neurons

In primary cultures of mesencephalon small-conductance calcium-activated potassium channels (SK) are expressed in dopaminergic neurons. We characterized SK-mediated currents (I(SK)) in this system and evaluated their role on homeostasis against excitotoxicity. I(SK) amplitude was reduced by the glutamatergic agonist AMPA through a reduction in SK channel number in the membrane. Blockade of I(SK) for 12 h with apamin or NS8593 reduced the number of dopaminergic neurons in a concentration-dependent manner. The effect of apamin was not additive to AMPA toxicity. On the other hand, two I(SK) agonists, 1-EBIO and CyPPA, caused a significant reduction of spontaneous loss of dopaminergic neurons. 1-EBIO reversed the effects of both AMPA and apamin as well. Thus, I(SK) influences survival and differentiation of dopaminergic neurons in vitro, and is part of protective homeostatic responses, participating in a rapidly acting negative feedback loop coupling calcium levels, neuron excitability and cellular defenses. This article is part of a Special Issue entitled 'Trends in neuropharmacology: in memory of Erminio Costa'.     

大脑皮层神经元原代培养方法的改良及一种体外缺氧缺糖简易模型的建立

目的改进SD胎鼠大脑皮层神经元体外原代培养方法及其一种缺氧缺糖(OGD)简易模型建立。方法用温和的TrypLE胰酶消化得到单个皮层神经细胞,用含有B27的Neurobasol培养基进行培养。培养7 d后,将其培养液换成无糖DMEM培养液,放入缺氧装置中分别培养4、5及6 h,利用MTT法检测细胞存活率,并用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞培养液中LDH的释放量。结果分离和培养的神经元生长状态良好,免疫荧光方法证明该方法培养的大脑皮层神经元纯度可达到(93.2±1.3)%,能够达到实验研究的要求。细胞OGD 4、5及6 h后,细胞存活率分别为(52.7±1.3)%、(26.5±3.3)%及(20.8±1.1)%;LDH的释放量分别为(52.9±4.8)%、(89.3±1.3)%及(93.2±1.1)%。结论改良后的培养方法能够稳定地获得高纯度的SD胎鼠大脑皮层神经元,用厌氧发生装置替代三气培养箱建立了一种OGD简易模型,同时选择OGD 4 h作为缺氧缺糖模型最佳时间点。     

MaFGF对顺铂所致海马神经元损害保护作用的体外实验研究

目的探讨改构体酸性成纤维细胞生长因子(MaF-GF)对体外培养的海马神经元顺铂(DDP)损伤的保护作用。方法取新生SD乳鼠海马神经元进行原代培养,采用高分子量神经丝蛋白多克隆抗体(NF-H)进行免疫细胞化学染色鉴定。原代细胞接种于96孔培养板:①培养7 d后加入一系列浓度的DDP,继续培养24 h,采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率;②以DDP建立损伤模型,并在加DDP同时加入一系列浓度的MaFGF,观察MaFGF对海马神经元的保护作用。结果①DDP对体外培养神经元活力具有明显的抑制作用,随着DDP浓度的增加,细胞活力降低;②浓度为5.2～10.4μg.L-1的MaFGF能使DDP损伤的神经元活力明显提高;③MaFGF+DDP组和DDP组比较,各生化和酶学指标差异均有统计学意义(P<0.01),MaFGF+DDP组中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性升高,丙二醇(MDA)、一氧化氮(NO)水平降低。结论MaFGF对DDP损伤的海马神经细胞具有一定的保护作用。