烯脂酰辅酶A水解酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备小鼠抗人烯脂酰辅酶A水解酶(enoyl CoA hydratase,ECHS1)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA、Western blot、免疫沉淀、免疫组化和间接免疫荧光等方法对mAb进行特异性鉴定,通过Uni-ZAP XR正常成人肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果:获得1株可稳定分泌抗人ECHS1 mAb 的杂交瘤细胞株BGB095.该mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),可用于ELISA检测、Western blot、免疫沉淀、免疫组化等实验.结论:成功制备了抗人ECHS1的mAb,为代谢疾病和肿瘤的研究提供了有力的工具.     

具有中和活性抗人类腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备具有中和活性抗人类腺病毒(HAdv)单克隆抗体(mAb),并进行鉴定与应用.方法:以活的人类腺病毒3型(HAdv-3)滴鼻免疫BALB/c鼠,用细胞融合技术制备抗HAdv 的mAb细胞株,采用中期分裂相秋水仙素阻抑法对mAb细胞株染色体进行分析;使用鼠mAb亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定,通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光技术进行特异性鉴定.建立HAdv-3感染动物模型,用获得的HAdv-3 mAb进行保护性研究.结果:细胞融合率为86%,抗HAdv抗体阳性孔率为51.4%.鉴定1株杂交瘤细胞(1A4),染色体数为98条,抗体亚类属IgG2a/κ,抗体腹水ELISA效价达10~(-5).ELISA、Western blot和间接免疫荧光证实该mAb特异性好.该mAb对HAdv-3感染动物有保护性作用.结论:成功地制备具有中和活性的抗HAdv mAb.该mAb识别的是HAdv六邻体蛋白,对HAdv-3感染动物有保护作用.     

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.     

氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定与应用.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原,借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物.结果:获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgGl(K),该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离.结论:成功制备了抗人CPSI的mAb,为CPSI的研究提供了有力的工具.     

一株鼠抗人TLT-2单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

为了制备鼠抗人TLT-2单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进行初步的研究。以TLT-2基因转染细胞株免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗人TLT-2 mAb,收集腹水,并用ProteinG亲和层析法纯化。以流式细胞术、IP和Western blot等方法鉴定该单抗的特异性。并通过流式细胞术、CCK8和ELISA等方法对单抗的生物学特性进行了初步分析。结果:获得一株持续稳定分泌鼠抗人TLT-2 mAb的杂交瘤细胞株,命名为8C10。杂交瘤细胞分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ)。IP和Western blot分析证明,8C10能特异性识别人TLT-2分子。经8C10荧光染色后流式细胞术的结果表明:TLT-2在T细胞表面呈弱阳性表达,在单核细胞和B细胞表面呈强阳性表达。细胞增殖实验结果显示,该mAb对T细胞的增殖有抑制作用。提示,成功获得了一株特异性鼠抗人TLT-2 mAb,该mAb对T细胞体外增殖及其细胞因子IFN-γ、IL-2、和IL-10的分泌均有明显的抑制作用。     

鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:探索以白细胞为免疫原的鼠抗人白细胞天然蛋白单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)制备与克隆筛选鉴定方法,制备鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体,并鉴定抗体性质。方法:用健康人外周血白细胞免疫小鼠,利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备mAbs,通过免疫细胞化学法对杂交瘤细胞进行非特异性阳性筛选,有限稀释法进行亚克隆,应用免疫沉淀鄄质谱法进行mAb 特异性鉴定,通过Western blot 进行细胞株筛选,小鼠体内诱生腹水法制备单抗,亲和层析法纯化,ELISA 间接法测定效价及亲和力,Western blot 进行特异性鉴定及交叉反应性分析,免疫组化染色人乳腺癌石蜡切片。结果:获得免疫细胞化学检测阳性多克隆细胞35 孔,分泌鼠抗人S100A9 蛋白单克隆抗体细胞株11 株,优选1 株制备腹水并纯化鉴定抗体,抗体效价为1 3.18 105 ,亚类为IgG1,轻链为kappa 链,抗体纯度达95%以上,亲和力常数3.54 108 L/ mol,与S100A8的交叉反应率为0.12%,与S100A12 和S100A13 几乎无交叉反应,组化染色识别人乳腺癌组织中的S100A9 蛋白。结论:成功制备鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体,该单抗具有高效价、较高亲和力和高特异性,能为其应用于免疫组化检测S100A9蛋白的表达提供依据。     

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力。结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107～2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性。结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础。     

降钙素原抗原的表达及其抗体的制备与初步鉴定

目的:构建降钙素原(PCT)原核表达载体, 制备其多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定.方法:以甲状腺癌细胞cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 在大肠杆菌中分别表达GST-PCT和His-PCT融合蛋白, 用His-PCT免疫家兔和BALB/c小鼠制备兔pAb和鼠mAb.通过ELISA法测定抗人PCT抗血清效价;用Western blot、 间接免疫荧光鉴定pAb的特异性.使用间接ELISA法筛选分泌特异性抗PCT的杂交瘤细胞株, 采用Western blot和间接免疫荧光鉴定mAb的特异性. 结果:构建了重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 并在大肠杆菌中表达、纯化.经ELISA法测得抗人PCT抗血清效价是1∶ 256 000.制备的抗PCT兔多克隆抗体可特异地识别重组和天然的PCT蛋白.获得8株可稳定分泌抗PCT的杂交瘤细胞株, 可识别重组人PCT蛋白, 其中有4株可特异性结合TT细胞质中的天然蛋白. 结论: 成功地制备出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb, 为进一步研究PCT在严重的细菌感染和脓毒症中的病理及生理作用奠定了基础.     

抗丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2,PDC-E2)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果 获得1株可稳定分泌抗人PDC-E2 mAb 的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ), 该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化和免疫沉淀实验.结论 成功制备了抗人PDC-E2的mAb,为PDC-E2的研究提供了有力的工具.     

缺失PRD的人FOXP3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗脯氨酸富含区缺失的人FOXP3(△PRD-hFOXP3)的单克隆抗体(mAb),为进一步研究人FOXP3各片段功能奠定基础。方法:以纯化的△PRD-hFOXP3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,经筛选及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb杂交瘤细胞株;利用核型分析、间接ELISA及Western blot分别鉴定了杂交瘤的细胞核型、抗体的效价与特异性。结果:筛选到2株可稳定分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb的细胞株,分别命名为1A2和3A11;2株抗体均为IgG1,腹水经ELISA方法测定效价均可达1∶105;Western blot显示这2株杂交瘤分泌的mAb均可与△PRD-hFOXP3蛋白特异性地结合。结论:成功获得2株能稳定分泌特异性抗△PRD-hFOXP3的mAb的杂交瘤细胞株,可用于人FOXP3的进一步研究及相关试剂的研发等。     

前列腺癌中AGR2蛋白的表达及临床意义

目的探讨AGR2在前列腺癌中的表达及意义。方法应用免疫组化方法检测AGR2和AR在61例前列腺癌和33例良性前列腺增生症中的表达状况。结果 AGR2在前列腺癌中阳性率为68.9%,其在前列腺增生症中的阳性率为36.4%,两组中的差异有显著性(P0.01)。前列腺癌中AGR2和AR的表达呈正相关(r=0.323,P=0.011)。AGR2与患者的临床分期、年龄、Gleason分级及术前患者血清的PSA及cPSA水平均无相关性(P0.05)。结论 AGR2可能与前列腺癌的发生有关,该蛋白的表达可能受AR调控。     

AGR2 associates with HER2 expression predicting poor outcome in subset of estrogen receptor negative breast cancer patients

Expression of the AGR2 oncogene was shown to be associated with estrogen receptor positive tumors. This gene contributes to enhanced cellular proliferation, drug resistance, metastasis development and may also serve as a predictor of poor prognosis. However, our analysis of AGR2 expression in a subset of estrogen-receptor negative tumors revealed that AGR2 could also be upregulated in hormone-independent manner. AGR2 expression was shown to be significantly increased in HER2 positive breast tumors on both the mRNA and the protein level. Moreover, in a subset of estrogen- and progesterone-receptor negative and simultaneously HER2-positive cases, increased AGR2 expression significantly correlated with worse patient prognosis. Subsequent analysis of independent data sets either collected in our institute or obtained from Oncomine cancer microarray database confirmed all these findings.     

Identification of novel HLA-A*0201-restricted epitopes from anterior gradient-2 as a tumor-associated antigen against colorectal cancer

Anterior gradient-2 (AGR2) promotes tumor growth, cell migration and cellular transformation and its enhanced expression is almost completely restricted to malignant tissues, thus making AGR2 an interesting target for the development of immunotherapeutic strategies. We investigated whether the AGR2 molecule comprises human leukocyte antigen (HLA)-A*0201-binding epitopes recognized by human cytotoxic T lymphocytes (CTLs), which could be targeted in dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy against colorectal cancer (CRC). We reviewed the sequence of AGR2 for peptides that could potentially bind to HLA-A*0201 with the aid of a computer-based program. Five candidate peptides with different binding scores were synthesized and tested. These peptides were then assessed for their immunogenicity to elicit specific immune responses mediated by CTLs in vitro by means of enzyme-linked immunospot assays and CTL assays. AGR2 was highly expressed in several CRC cell lines, including DK01, DLD1, KM12C, HCT-8 and HT-29. DCs pulsed with AGR2-P2 (aa 11-19; LLVALSYTL) or AGR2-P4 (aa 127-135; RIMFVDPSL) generated potent CTLs that could lyse T2 cells pulsed with AGR2-P2 or AGR2-P4 and HLA-A0201(+) AGR2-positive CRC cell lines in a strong dose-dependent and HLA-A*0201-restricted manner. In conclusion, these novel epitopes derived from AGR2 protein may be attractive candidates for DC-based immunotherapy for CRC.     

AGR2对毒胡萝卜素作用下人肺癌NCI-H460细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察anterior gradient 2(AGR2)基因在内质网应激诱导剂毒胡萝卜素作用下对人肺癌NCIH460细胞增殖能力及凋亡的影响。方法:通过慢病毒介导的shRNA建立AGR2基因沉默的稳定细胞系;采用集落形成实验检测AGR2在毒胡萝卜素作用下对细胞增殖能力的影响;流式细胞术分析在毒胡萝卜素作用下AGR2对细胞凋亡的影响。结果:成功构建AGR2基因沉默的稳定细胞系,Western blot结果显示AGR2的蛋白表达水平显著降低(P0.01);在未经药物处理条件下,AGR2基因缺失对NCI-H460细胞集落形成率及凋亡无显著影响;毒胡萝卜素作用24 h后,AGR2基因沉默的细胞集落形成率远低于对照组(P0.05);流式细胞术检测结果显示AGR2基因缺失提高了毒胡萝卜素诱导的细胞凋亡率(P0.05)。结论:AGR2基因缺失不影响正常条件下NCI-H460细胞的存活及凋亡能力,但可使毒胡萝卜素作用下细胞的增殖能力显著下降,细胞凋亡率显著提高。本研究揭示了AGR2在内质网应激状态下促进肺癌细胞增殖和减轻细胞凋亡的作用,为进一步探讨AGR2在肺癌发生发展及耐药性中的作用提供了理论依据。     

Differential expression of anterior gradient protein 3 in intrahepatic cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma

Intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) is the second most common primary liver cancer next to hepatocellular carcinoma (HCC). Despite the significant difference of the therapeutic strategy for both diseases, their histological appearance may be very similar. Thus the correct diagnosis is crucial for treatment choice but is often difficult to achieve. The aim of our study was to evaluate anterior gradient 3 (AGR3) as a new diagnostic marker helping to distinguish between ICC and HCC. AGR3 is a putative transmembrane protein implicated in breast, prostate and ovary tumorigenesis and belongs to the family of protein disulfide isomerases.     

pEGFP-N2-BMP2转染诱导P19细胞分化为心肌样细胞

目的 探讨真核表达质粒pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞后能否诱导其分化为心肌样细胞.方法 实验分转染组和对照组,转染组以真核表达质粒pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞并使骨形态发生蛋白2(BMP2)基因稳定表达,然后结合细胞聚集培养,对照组为培养的P19细胞.两组细胞聚集培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4d、8d、12d、16d,免疫细胞化学和Western blotting方法检测心肌标志物心肌肌钙蛋白T (cTnT)和心肌肌动蛋白α;半定量RT-PCR检测心脏早期转录因子GATA-4和NKx2.5基因的表达.结果 转染组心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α两种蛋白形成聚集体贴壁4d时无表达,8d、12d、16d出现表达,其表达随时间延长逐渐增强.取材各时间点之间有显著差异(P＜0.01).在转染诱导后4d时GATA-4、NKx2.5两个基因即出现弱的表达,随着时间延长,8d、12d、16d两个基因的表达逐渐增强.取材各时间点之间有显著差异(P＜0.01).对照组未发现心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α两种蛋白的表达,亦未发现GATA-4、NKx2.5两个基因的表达.结论稳定表达BMP2基因的P19细胞可以分化为心肌样细胞,BMP2可能通过调控转录因子GATA-4、NKx2.5进而影响心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α的表达.     

参麦注射液对鼠肾小管细胞株NRKSIE氧化性损伤影响的实验研究

通过H2O2致鼠肾小管细胞损伤模型建立，研究参麦注射液(SMI)对H2O2所致的小管细胞氧化性损伤的影响。实验结果表明，SMI对H2O2致的小管细胞氧化性损伤具有明显的保护和治疗作用，其疗效略优于辅酶Q10(CoQ10)，证实SMI能明显提高受损的小管细胞有氧代谢功能，并能保护未受损小管细胞，从而为SMI治疗肾脏疾惠提供了依据。     

预适应对氧化应激中HepG2细胞保护作用的初步探讨

目的：建立HepG2细胞预适应、氧化应激模 型。方法:应用不同浓度H₂O₂作用于HepG2细胞，分别用吖啶橙和溴 化乙锭（AO/EB）双染色法、MTT比色法及PI染色流式细胞术检测细胞活力及凋亡情况。结果:各组细胞经AO/EB双染色之后呈现不同的染色状态：对照组细胞为正常 梭形，呈均匀绿色荧光染色；预适应组可见少量绿色浓染细胞；氧化应激组可见大量绿色或 红色浓染凋亡细胞；预适应后氧化应激组凋亡细胞明显少于氧化应激组。预适应组MTT比色 法测定细胞生存活力比较：对照组>预适应组>预适应后氧化应激组>氧化应激组（P<0.05）。PI染色流式细胞术测细胞凋亡率比较：氧化应激组>预适应后氧化应激组>预适应组> 对照组（P<0.05）。结论:不同浓度H₂O₂作用于HepG2细胞发 生预适应和氧化应激现象，应用小剂量H₂O₂作用于细胞可以保护细胞免受更大浓度H₂ O₂带来的损伤。     

胃腺癌中PAR-2、β-catenin和COX-2的表达及其意义

目的 探讨人类蛋白酶激活受体-2(protease-activated receptor-2,PAR-2)、β-连环蛋白(β-catenin)与COX-2在胃腺癌中的表达及其与临床病理因素和预后的相关性及意义.方法 应用免疫组化SP法检测63例胃腺癌组织、19例低级别上皮内瘤变、20例正常胃组织中PAR-2、β-catenin与COX-2的表达情况.结果 PAR-2、COX-2在胃腺癌组织中的阳性表达率较在低级别上皮内瘤变组织、正常胃组织中分别升高(P<0.05),β-catenin在胃腺癌组织中的异常表达率较在低级别上皮内瘤变组织、正常胃黏膜组织中升高(P<0.05).PAR-2在胃腺癌组织中的阳性表达与胃腺癌的浸润深度相关(P<0.05);β-catenin在胃腺癌组织中的异常表达与胃腺癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床病理分期相关(P<0.05);COX-2在胃腺癌组织中的阳性表达与胃腺癌的浸润深度、淋巴结转移、临床病理分期相关(P<0.05).Kaplan-Meier生存分析显示:PAR-2、COX-2阳性表达与阴性表达组患者的5年生存期的差异有统计学意义(P<0.05),β-catenin异常表达与正常表达组患者的5年生存期的差异有统计学意义(P<0.05).结论 PAR-2参与胃腺癌的进展且可作为判断预后的一项指标;β-catenin的异常表达和COX-2的阳性表达与胃腺癌的发生、发展密切相关,且可作为判断预后的重要指标.