乙酰肝素酶反义寡核苷酸对胃癌细胞侵袭和转移的影响Ⅱ.胃癌细胞SGC-7901中乙酰肝素酶基因和CD44v6表达的关系

目的:探讨乙酰肝素酶(HPA)反义寡核苷酸(AS-ODN)对CD44v6表达的影响.方法:采用脂质体介导HPA AS-ODN转染人胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR检测HPA mRNA的表达,采用免疫细胞化学SABC法观察细胞内CD44v6表达的变化.结果:脂质体介导转染HPA AS-ODN 48 h后,SGC-7901胃癌细胞内HPA mRNA表达下降,CD44v6阳性表达率转染前69.4%,转染不同浓度的AS-ODN后分别为56.5%,54.1%,46.5%和41.3%.转染后细胞CD44v6表达明显减少(P＜0.01).结论:HPA AS-ODN可以有效抑制胃癌细胞CD44v6的表达.     

胃癌细胞SGC-7901中乙酰肝素酶基因和CD44v6表达的关系

目的:探讨乙酰肝素酶(HPA)反义寡核苷酸(AS-ODN)对CD44v6表达的影响。方法:采用脂质体介导HPAAS-ODN转染人胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR检测HPAmRNA的表达,采用免疫细胞化学SABC法观察细胞内CD44v6表达的变化。结果:脂质体介导转染HPAAS-ODN48h后MSGC-7901胃癌细胞内HPAmRNA表达下降MCD44v6阳性表达率转染前69.4%M转染不同浓度的AS-ODN后分别为56.5%,54.1%,46.5%和41.3%。转染后细胞CD44v6表达明显减少(P<0.01)。结论:HPAAS-ODN可以有效抑制胃癌细胞CD44v6的表达。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对胃癌细胞侵袭和转移的影响Ⅰ.乙酰肝素酶反义寡核苷酸对SGC-7901细胞MMP-2和TIMP-2表达的影响

目的：探讨乙酰肝素酶（HPA）反义寡脱氧核苷酸（AS-OND）对人胃癌细胞株SGC-7901细胞基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及组织金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）表达的影响。方法：采用脂质体介导法将HPA AS-ODN转染SGC-7901细胞,用RT-PCR检测HPA-mRNA表达．用免疫细胞化学的方法检测细胞内MMP-2和TIMP-2的变化。结果：AS-ODN转染48h后,SGC-7901细胞内HPA-mRNA表达下降（P〈0．01）,MMP-2的表达量亦减少（P〈0．01）。结论：HPAAS-ODN可以有效地抑制胃癌细胞MMP-2的表达。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的：探讨乙酰肝素酶(HPA)反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)对人胃癌细胞株SGC-7901细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：设计合成HPAAS-ODN．用脂质体介导法转染SGC-7901细胞,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后细胞HPA-mRNA及p53、bcl-2基因的表达;用倒置相差显微镜及扫描电镜观察转染前后细胞的形态学变化;用DNA末端原位标记染色法(TUNEL)检测转染前后细胞的凋亡指数;用流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡率的变化。结果：HPAAS-ODN转染后,SGC-7901细胞内HPA-mRNA表达下降,p53的表达量升高,bcl-2的表达量降低;细胞凋亡指数和凋亡率升高;出现了典型的凋亡细胞的形态学变化。结论：HPAAS-ODN可有效地抑制胃癌细胞HPA mRNA的表达：并通过下调bcl-2,上调p53的表达,诱导胃癌细胞凋亡。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响

目的：探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响．．方法：采用脂质体介导乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染人胃癌细胞株SGC7901细胞,以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后乙酰肝素酶mRNA、Fas mRNA和Bcl-2 mRNA表达的变化,采用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果：脂质体介导转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸后,SGC7901胃癌细胞内乙酰肝素酶mRNA和Bcl-2 mRNA表达下降,FasmRNA表达上升,凋亡细胞比率由转染前的4．04％增加至转染后的16．00％。结论：转染后的乙酰肝素酶反义寡核苷酸可有效地诱导胃癌细胞发生凋亡。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对SGC-7901细胞MMP-2和TIMP-2表达的影响 Ⅰ.乙酰肝素酶反义寡核苷酸对SGC-7901细胞MMP-2和TMP-2表达的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(HPA)反义寡脱氧核苷酸(AS-OND)对人胃癌细胞株SGC-7901细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)表达的影响。方法:采用脂质体介导法将HPAAS-ODN转染SGC-7901细胞G用RT-PCR检测HPA-mRNA表达,用免疫细胞化学的方法检测细胞内MMP-2和TIMP-2的变化。结果:AS-ODN转染48h后GSGC-7901细胞内HPA-mRNA表达下降(P<0.01),MMP-2的表达量亦减少(P<0.01)。结论:HPAAS-ODN可以有效地抑制胃癌细胞MMP-2的表达。     

蔡氏扶正消瘕汤对胃癌SGC-7901细胞黏附分子表达的影响

目的：探讨蔡氏扶正消癌汤对人体外生长胃癌细胞SGC-7901表面黏附分子的影响以及作用的计量和效应关系。方法：流式细胞仪检测细胞膜表面E-Cadherin,CD44,CD44-v6和CD54的表达。结果：蔡氏扶正消瘕汤作用48h后,SGC-7901细胞膜表面的E-Cadherin表达增高,CD44、CD44-V6和CD54表达减少。随着药物剂量增加,E-Cadherin表达阳性细胞表达逐渐升高;CD44、CD44-v6、CD54表达的阳性细胞比率逐渐下降,抑制率也逐渐升高。结论：蔡氏扶正消瘢汤在抑制人胃癌细胞SGC-7901体外增殖的基础上,能够增加胃癌细胞SGC-7901表面E-Cadherin的表达,减少胃癌细胞SGC-7901表面CD44,CD44-V6和CD54的表达,并在计量和效应间存在联系,说明蔡氏扶正消瘕汤能阻止胃癌SGC-7901细胞对邻近正常组织的浸润及远处转移,从而发挥抗癌作用。     

重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN对胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响

目的 构建人细胞外金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）重组质粒,观察其在胃癌SGC-7901细胞中的表达及对细胞侵袭和迁移的影响。方法 从结肠癌细胞株SW-480中提取总RNA,通过RT-PCR获得EMMPRIN基因,连接至载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN,通过脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌SGC-7901细胞;RT-PCR和Western blotting分别检测EMMPRIN mRNA和蛋白在SGC-7901细胞中的表达,Transwell实验检测EMMPRIN对SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响。结果 重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN构建成功,并在SGC-7901细胞中表达,RT-PCR和Western blotting检测示转染后SGC-7901细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达均增加,Transwell实验检测示转染后SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力均显著增强。结论 EMMPRIN可显著增强肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。     

p73β基因转染对胃癌细胞的生物学影响

目的研究人p73β基因转染对人胃癌细胞SGC-7901的生物学影响,探讨p73β基因抑制SGC-7901细胞增殖的机制。方法用脂质体转染法瞬时转染SGC-7901细胞,转染重组质粒pcDNA3.1-p73β（SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组）和空载质粒pcDNA3.1-N0（SGC-7901-pcDNA3.1-N0组）,并用未转染质粒具有相同遗传背景和代数的SGC-7901细胞作为空白对照（SGC-7901组）。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞中P73β、p21、c-myc表达量变化,MTT法观察细胞增殖的活力,原位细胞凋亡检测TUNEL法观察细胞凋亡。结果RT-PCR检测发现SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞与SGC-7901-pcDNA3.1-N0和SGC-7901两对照组相比,其p73β表达明显增高,p21相对表达量明显增多,c-myc相对表达量明显减少。与两对照组相比,SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞增殖率明显减弱,细胞凋亡率明显增高（均P〈0.05）。结论p73β基因可以促进SGC-7901细胞内p21基因的表达,抑制c-myc基因表达。p73β基因可降低胃癌细胞增殖力,诱导胃癌细胞凋亡。     

胃癌组织中CD44v6、增殖细胞核抗原的表达

目的：探讨胃癌组织中CD44v6，增殖细胞抗核抗原（PCNA）的表达与胃癌侵袭性转移的关系以及预测胃癌淋巴结转移的价值。方法：应用免疫组织化学S－P法，62例原发性胃癌中CD44v6，PCNA表达与胃癌淋巴结转移的关系进行检测。结果：胃癌组织中CD44v6阳笥率为64．5％，PCNA阳性率为100％，其中弱阳性（Ⅰ－Ⅱ级）表达率为24．2％，强阳性（Ⅲ－Ⅳ）表达率为75．8％。随着肿瘤分化程度的降低，CD44v6，PCNA的表达增高；有淋巴结转移的病例中CD44v6的阳性经以及为75．8％。随着肿瘤分化程度的降低，CD44v6，PCNA的表达增高；有淋巴结转移的病例中CD44v6的阳性率以及PCNA的强阳性表达率显著高于未发生淋巴结转移者。结论：胃癌组织中CD44v6，PCNA的异常表达，可能是胃癌发生、发展的一个重要分子学改变，联合检测其结果有助于评估胃癌的浸润、淋巴结转移和预后。     

中西药联合对胃癌SGC-7901/ADR细胞MRP介导的耐药性研究

目的：探讨中西药联合逆转胃癌多药耐药亚系SGC-7901/ADR细胞MRP介导的耐药性作用。方法：以SGC-7901/ADR细胞为靶细胞,以不加药组为阴性对照组,5-FU组、斑贞1号组、班贞1号＋5-FU组、班贞1号＋5-FU＋TMP组为实验组,采用半定量RT-PCR法检测SGC-7901/ADR细胞在不同药物作用下MRP mRNA的表达情况。结果：5-FU组与阴性对照组比较,耐药细胞MRP mRNA表达差异无统计学意义（P〉0.05）,提示MRP参与SGC-7901/ADR细胞对5-FU的多药耐药性;其他实验组组间比较及与阴性对照组比较,MRP mRNA表达差异均有统计学意义（P〈0.01）,中西药联合组（斑贞1号＋5-FU＋TMP）MRP mRNA表达量最低（仅为0.07）。结论：中西药联合可以克服SGC-7901/ADR细胞由MRP介导的多药耐药性,为当前胃癌的治疗提供了新的理论依据。     

5‘—荧光素标记的ReLA反义脱氧寡核苷酸在人白血病细胞HL—60中的分布及稳定性

目的 比较修饰型及未修饰型ReLA反义脱氧寡核苷酸（AS-ODN）在人白血病细胞HL-60中的分布及稳定性。方法 将荧光素（FAM）标记的硫代磷酸酯修饰及未修饰型AS-ODN经脂质体介异工直接转染入HL-60细胞，应用荧光显微镜及流式细胞仪观察细胞内荧光的时相分布。结果 发现1μmol/L修饰型AS-ODN进入细胞后，细胞内荧光强度6h达到高峰。在有脂质体存在时，细胞内荧光明显增强，12h后荧光减弱并逐渐消失。而AS-ODN直接转染细胞，细胞内特别是核内荧光强度明显比脂质体组弱。未修饰型AS-ODN直接或经脂质体介导转染，细胞内荧光强度均很弱，滞留时间不超过4h。结论 脂质体可以提高细胞对AS-ODN的摄取及核聚积，而硫代磷酸酯修饰型AS-ODN具有更好的稳定性。     

Bmi-1基因RNA干扰对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的构建针对Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对胃癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的影响。方法利用慢病毒表达体系pHelperl．0／pHelper2．0／pGCL—GFP,成功构建针对Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA—Bmi-1,适时定量PCR（real—timePCR）检测稳定转染后胃癌细胞SGC-7901中Bmi-1mRNA表达,流式细胞术检测细胞凋亡,MTr法检测其增殖能力。结果稳定转染vshRNA—Bmi-1后SGC-7901细胞Bmi-1mRNA表达明显下降,总抑制效率达85％;癌细胞增殖减慢,凋亡率明显增加。结论构建针对Bmi-1基因的RNAi表达载体,成功转染胃癌细胞SGC-7901,可促进癌细胞凋亡,抑制其增殖能力。     

槐耳清膏诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的实验研究

目的研究槐耳清膏对胃癌SGC-7901细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用,并探讨其作用机制。方法用终浓度为0、0．5、1、2、4、6mg／mL的槐耳清膏和10μg／mL的5-氟尿嘧啶（5-Fu）作用于SGC-7901细胞,分别于24h和48h后采用MTT法检测细胞增殖抑制率;48h后收集各组胃癌SGC-7901细胞,琼脂糖凝胶电泳检测DNA,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测survivin mRNA表达。结果MTT法检测显示,槐耳清膏对胃癌SGC-7901细胞有增殖抑制作用,并存在浓度和时间依赖关系（P〈0．05）;槐耳清膏6mg／mL组的抑制率48h后达到（77．9&#177;2．3）％,5-Fu组为（53．4&#177;1．6）％,差异有统计学意义（P〈0．05）。流式细胞术检测显示,槐耳清膏4mg／mL组的细胞凋亡率最高,早期凋亡细胞达33．2％;6mg／mL组早期凋亡细胞6．3％,而晚期凋亡细胞为19．9％。RT—PCR结果显示,槐耳清膏组胃癌SGC-7901细胞survivin mRNA表达下调。结论槐耳清膏在体外对胃癌SGC-7901细胞有明显的增殖抑制和凋亡诱导作用,初步推断槐耳清膏诱发胃癌细胞凋亡与其对survivin基因表达的抑制有关。     

鸟苷酰环化酶C小干扰RNA对胃癌细胞生长的影响

目的：研究靶向鸟苷酰环化酶C（Guanylyl cyclaseC,GC-C）的小干扰RNA（siRNA）对人胃癌SGC-7901细胞体外生长能力的影响。方法：利用pSilencer TM4.1-CMVneo通过siRNA表达载体法制备GC-CsiRNA。将GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光观察转染前后胃癌细胞GC-C基因的表达变化,黏附实验观察转染前后胃癌细胞黏附能力。结果：构建的GC-CsiRNA测序鉴定与设计完全相符。GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,明显抑制GC-C基因的表达。转染后,GC-CmRNA和蛋白表达分别抑制了66.7%和75.8%,细胞黏附能力较对照组减弱（P〈0.05）。结论：靶向GC-C的siRNA可明显下调靶基因GC-C的表达,在体外抑制胃癌SGC-7901细胞的黏附,提示GC-C基因与胃癌的发生、发展有密切的关系。     

Bcl -2 基因沉默对胃腺癌SGC-7901 细胞5-Fu 敏感性的影响

目的 探讨B 淋巴细胞瘤-2（Bcl -2）基因沉默增强胃腺癌SGC-7901 细胞对5- 氟尿嘧啶（5-FU）敏感性的价值。方法 设立人胃腺癌SGC-7901 细胞研究组和对照组,采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测两组人胃腺癌SGC-7901 细胞中Bcl-2 mRNA 的表达。研究组采用脂质体法转染化学合成的Bcl-2 siRNA 序列至人胃腺癌SGC-7901 细胞,对照组不进行干预。比较转染前后两组Bcl-2 mRNA 的表达水平。两组均添加不同浓度5-FU,采用Annexin V 标记和流式细胞仪检测48 h 后两组不同浓度5-FU 细胞株的增殖抑制率和凋亡率。结果 两组转染前Bcl-2 mRNA 相对表达量比较,差异无统计学意义（P >0.05）。与转染前比较,研究组转染后的Bcl-2 mRNA 相对表达量降低（P <0.05）;与对照组比较,研究组转染后的Bcl-2mRNA 相对表达量降低（P <0.05）。与对照组比较,研究组培养48 h 的细胞增殖抑制率和凋亡率较高（P <0.05）。结论 Bcl -2 基因沉默可增强胃腺癌SGC-7901 细胞对5-FU 的敏感性,抑制癌细胞的增殖,并促进癌细胞的凋亡。Bcl -2 基因沉默可能是改善胃腺癌5-FU 疗效的有效方法。     

shRNA抑制高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ基因的表达对胃癌细胞侵袭力的影响及机制

目的：初步分析高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ（Golgi alpha-mannosidase Ⅱ,GMⅡ）在低中不同分化人胃癌细胞系中的差异表达,以探讨GMⅡ在胃癌发生发展中的作用。方法：应用阳离子脂质体法将合成的靶向GMⅡ基因的pGPU6/GFP/Neo-GMⅡ-1406质粒载体,分别转染至低分化胃癌细胞MGC-803和中分化胃癌细胞SGC-7901中,然后荧光倒置显微镜观察并计算转染率,最后经过G418筛选出稳定转染的细胞株。应用RT-PCR和Western blot检测转染后GMⅡ和E-cadherin、α-catenin 的mRNA及蛋白表达变化情况,同时利用细胞划痕实验和Transwell体外侵袭实验来测定GMⅡ被沉默后两株细胞侵袭能力的变化。结果：GMⅡ短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）转染胃癌MGC-803和SGC-7901细胞后GMⅡ的mRNA和蛋白表达明显抑制,而E-cadherin和α-catenin的2种因子检测结果明显升高（P＜0.05）;细胞划痕实验结果显示,转染重组质粒pGPU6/GFP/Neo-GMⅡ-1406组（GMⅡshRNA组）与对照组（空白对照组,阴性对照组）相比,GMⅡ被沉默后的胃癌细胞的侵袭能力降低（P＜0.05）;Transwell体外侵袭实验中GMⅡshRNA组胃癌细胞较空白对照组、阴性对照组细胞侵袭能力都明显降低,18 h穿过小室的细胞数分别为：（65±5）、（197±6）、（186±5）,（72±4）、（178±4）、（184±5）个与对照组相比差别具有统计学意义（MＧＣ-803：P=0.000,SGC-7901：P=0.000）。结论：GMⅡ基因沉默后的胃癌细胞的侵袭能力下降,可能与上调E-cadherin、α-catenin的表达有关。     

下调胃癌细胞PDGF-D表达对共培养HUVECs生长和功能的影响

目的：探讨通过RNA干扰下调血小板源性生长因子-D（PDGF-D）基因在胃癌SGC-7901细胞中的表达对与其共培养的脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）生长和功能的影响.方法：构建靶向PDGF-D的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体,转染胃癌SGC-7901细胞后,通过RT-PCR,Western Blot检测干扰前后PDGF-D的表达;用ELISA法检测培养液上清中血管内皮生长因子（VEGF）的含量;将胃癌细胞SGC-7901与HUVECs共培养后,细胞计数法检测细胞生长变化,流式细胞术测量细胞周期变化,血管形成实验检测HUVECs的血管形成能力.结果：PDGF-D-shRNA1,PDGF-D-shRNA2重组载体均能使SGC-7901细胞中PDGF-D基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调（P〈0.05）,且后者抑制效果更好;干扰后胃癌细胞培养液上清中的VEGF下降;与转染后的SGC-7901细胞共培养的HUVECs生长速度明显变慢,且无管状结构形成.结论：重组真核载体能有效抑制SGC-7901细胞的PDGF-D表达,并通过减少VEGF的表达来抑制HUVECs生长和血管形成能力.     

Survivin反义核酸对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨Survivin反义核酸对乳腺癌细胞增殖的影响。方法：本实验分6组，分别以脂质体介导反义寡核苷酸、无义寡核苷酸及RPMI 1640培养液作为空白的对照组，转染人乳腺癌MCF-7细胞系，采用Realtime RT-PCR，Western blot方法检测各组MCF-7细胞Survivin蛋白及mRNA的表达情况，测定转染后细胞贴壁率变化，研究Survivin反义寡核苷酸对MCF-7细胞的生长抑制作用。结果：脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染人乳腺癌MCF-7细胞后，细胞内Survivin蛋白及mRNA表达显著降低，通过Realtime RT-PCR检测MCF-7细胞经作用后其Survivin mRNA起始拷贝数明显下降；同时细胞贴壁率降低达32．96％，细胞生长抑制率最高达73．62％，ASOND／LiP组与NODN／LiP组和LiP组差异有显著性（P＜0．05）。结论：脂质体介导转染的反义寡核苷酸可在Survivin蛋白及mRNA水平有效地降低乳腺癌MCF-7细胞内Survivin的表达，并能够有效抑制乳腺癌细胞的增殖活性，提示Survivin靶向治疗可能成为乳腺癌综合治疗的一种重要方法。     

谷氨酰胺酶反义基因诱导胃癌细胞凋亡的作用研究

目的 利用反义核酸技术封闭胃癌细胞的谷氨酰胺酶基因,观察反义GAcDNA能否对胃癌细胞的恶性表型有所逆转,为肿瘤的基因治疗探索一条新途径,也为后续研究及临床应用奠定基础.方法 将含有GAcDNA片段的反义真核表达载体pcDNA3.0/GA,通过脂质体介导转入胃癌细胞SGC-7901,经筛选、鉴定,命名为SGC-7901GA,采用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,观察反义核酸转染后胃癌细胞凋亡的改变.结果 pcDNA3.0/GA通过脂质体介导转染胃癌细胞SGC-7901,PCR证实GAcDNA目的 片段已经整合到了SGC-7901细胞基因组,获得的G418抗性细胞命名为SGC-7901GA.检测胃癌细胞的凋亡情况表明重组质粒转染后SGC-7901GA的TUNEL阳性细胞数量显著上升,与对照组比较差异有统计学意义.结论 本实验通过含有GAcDNA片段的反义真核表达载体pcDNA3.0/GA转染胃癌细胞株,发现胃癌细胞的凋亡指数增加,提示肿瘤细胞恶性程度有所降低,反义核酸技术封闭谷氨酰胺酶基因可能成为肿瘤基因治疗的一条新途径.