应用套式聚合酶链反应技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

目的 依据孕妇血浆中存在游离胎儿ＤＮＡ的理论,寻找一种非创伤性产前基因诊断的新方法。方法 用套式聚合酶链反应技术对１２例１２￣４０孕周的初产妇血浆中游离胎儿ＤＮＡ进行特异性扩增,扩增的基因为Ｙ染色体短臂单拷贝基因片段（ＤＹＳ１４基因）,扩增片段的大小分别为２３９ｂｐ和１９８ｂｐ,１２例孕妇均采用母体血浆直接作为模板进行套式聚合酶链反应扩增。结果 １０例妊娠男性胎儿孕妇中有８例血浆中出现ＤＹＳ１４基     

荧光定量PCR检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

目的探讨荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）方法检测孕妇血浆中胎儿DNA的可行性，探讨胎儿DNA在孕妇血浆中的含量及其在孕期的变化规律。方法以胎儿SRY基因序列作为胎儿DNA在孕妇血浆中的标志，应用荧光MGB（Minor Groove Binder）探针实时定量PCR方法连续测定30例孕妇在不同孕期和产后共237份血浆标本中胎儿DNA的含量。结果使用该方法最低可检测到20000个女性DNA中的一个男性DNA。孕妇血浆中最早检出SRY序列的时间为孕6^＋6周。孕8周起，所有怀男胎孕妇的标本中均可检出SRY序列，其含量随着妊娠的进展而增高，在晚期妊娠达高峰，产后24～48h血浆中SRY序列检测均为阴性。胎儿DNA在孕妇血浆总DNA含量中的相对浓度分别为孕早期4．88％、孕中期6．10％、孕晚期4．77％。全部实验无假阳性和假阴性出现。结论FQ-PCR方法是一种灵敏度和准确性高，特异性强的定量检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的方法，孕妇血浆中存在高浓度的胎儿DNA，可用于无创伤性产前基因诊断。     

孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断中的应用

目的依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,寻找一种无创性产前基因诊断的新方法。方法提取42例孕14~40周的产妇血浆中游离胎儿DNA,采用引物延伸预扩增(primerextensionpreamplification,PEP)后行PCR,特异性扩增其Y染色体重复序列(DYZ3)基因。同时采用9个短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)多态性位点的多重扩增方法以检出血浆中胎儿DNA。结果DYZ3-PCR中,32例妊娠男性胎儿孕妇中有28例血浆中出现基因扩增带,检出率为87.5%,10例妊娠女性胎儿孕妇血浆有2例假阳性结果。性别总符合率为85.7%,STR-PCR中,检测出孕妇血浆中父源性胎儿DNA的存在。结论应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断敏感性和特异性较高,是一种无创性产前基因诊断方法,具有广泛的临床应用前景。     

孕妇血浆中胎儿DNA检测在产前诊断中的应用

目的 探讨孕妇血浆中提取胎儿游离DNA,鉴别胎儿性别以诊断胎儿遗传性疾病的方法。方法 选择妊娠7-38周,B超确诊为单胎,经绒毛和羊水细胞染色体检测,确诊为妊娠男性胎儿的正常孕妇16例,妊娠女性胎儿的正常孕妇8例;X性连锁遗传病（假性肥大性肌营养不良,血友病,色盲,无汗性外胚层发育不良症）家族史行产前诊断者4例,用酚提取法,纯化孕妇血浆中胎儿DNA,然后用巢式聚合酶链反应（PCR）技术测定男性胎儿睾丸决定因子（SRY）。结果 16例妊娠男性胎儿孕妇血浆中,胎儿游离DNA第1次巢式PCR测定,检出SRY基因扩增片段10例,第1次检出率为62.5%;经第2次巢式PCR测定。另6例全部检出SRY基因扩增片段,累计检出率为100%,妊娠女性胎儿的8例孕妇血浆中,均未检出SRY基因扩增片段,4例X性连锁遗传病家族史者均检出SRY基因扩增片段。结论 从孕妇血浆中提取胎儿游离DNA行胎儿性别诊断是一种快速,简便,准确的产前诊断方法。     

利用孕妇血浆游离胎儿DNA产前诊断胎儿RhD血型的研究

目的探讨无损伤性产前诊断胎儿RhD血型的方法。方法西安交通大学第二医院1999年2月至2001年12月，以妊娠14～40周的单胎孕妇为对象，其中RhD阴性孕妇8例，RhD阳性孕妇12例，利用PCR技术对孕妇血浆中游离胎儿DNA进行RhD基因第10外显子的特异性扩增，扩增片段长度为186bp，另外以等位基因RhCE基因为内对照，扩增片段长度为136bp，结果能同时扩增出186bp和136bp两条带，判断所妊娠胎儿血型为RhD阳性；扩增出136bp一条带，判断所妊娠胎儿血型为RhD阴性。8例RhD阴性孕妇中，5例扩增出136bp一条特异性片段，3例同时扩增出136bp和186bp两爷特异性片段；12例RhD阳性孕妇血浆标本，均同时扩增出136bp和186bp两条特异性片段，所有RhD-PCR扩增结果均得到脐血血清学检测结果的证实。结论利用孕妇血浆中游离胎儿DNA对胎儿RhD血型进行诊断，是一种简便、快速、特异性较高的产前诊断方法，值得临床推广应用、     

检测孕妇血循环中胎儿DNA进行无创产前诊断的研究进展

孕妇血循环中胎儿DNA以两种形式存在，一是存在于进入母体血循环中的胎儿的完整细胞内，二是游离于母体血浆中。分析孕妇外周血循环中完整胎儿细胞DNA或游离DNA，是无创性产前诊断领域的一个日益引人注目的技术，这一技术可以单独使用或与其他无创性检查方法，如超声诊断、孕妇血清学分析等联合应用，使无创性产前诊断技术提高到一个新的水平。近年采用先进的磁珠细胞分选法(magnetic cell sorting，MACS)、流式细胞分选术和激光捕获显微分离(1aser capture microdissection，LCM)技术富集分离。     

胚外体腔液中胎儿细胞DNA检测在产前诊断中的应用

目的探讨胚外体腔液中细胞DNA检测用于孕早期诊断性连锁遗传疾病的可行性和准确性。方法对25例孕6～11周、要求人工流产的孕妇术前行胚外体腔穿刺术,抽取胚外体腔液0．5～3ml。采用煮沸法对胚外体腔液进行DNA抽提,Picogreen染料对DNA进行定量分析。采用X,Y两对引物对DNA进行PCR检测。随后行人工流产术,取少量绒毛组织进行染色体核型分析,并与胚外体腔液中的DNA检测结果作对照。结果0．5～3ml胚外体腔液中含有750—6270个胎儿细胞。男性胎儿DNA扩增结果出现两个条带（X,Y）11例,女性胎儿出现1个条带（X）14例。与绒毛组织染色体核型分析结果完全一致。结论胚外体腔液中细胞DNA检测,用于孕早期性连锁遗传疾病的产前诊断具有快速、敏感的特点。     

孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断中的初步应用--胎儿SRY基因、STR基因型的鉴定

目的 :利用孕妇血浆中游离胎儿 DNA进行非创伤性产前基因诊断。方法 :对 6 5例 5～ 4 1孕周孕妇血浆胎儿DNA进行 SRY的 PCR扩增 ,以检出男性胎儿 DNA;同时采用短串联重复序列 (STR)多态位点即 CSFIPO、TPOX、THO1(CTT)三个位点的复合扩增方法对 19例妊娠女性胎儿的孕妇血浆 DNA进行扩增 ,以检出女性胎儿 DNA。两种扩增均采用母体血浆直接作为模板进行。结果 :SRY- PCR中 ,4 6例妊娠男性胎儿的孕妇中 ,有 30例血浆中出现 SRY基因扩增带 ,19例妊娠女性胎儿的孕妇血浆中仅 1例孕中期者为假阳性 (5 .3% )。本研究孕早、中、晚期的性别符合率分别为 6 0 %、84 .0 9%、5 0 % ,总符合率为 73.85 % .CTT- PCR中 ,19例妊娠女胎孕妇血浆中有 15例检出父源性等位基因即女性胎儿 DNA。结论 :应用孕妇血浆中胎儿 DNA作产前诊断敏感性和特异性较高 ,尤其是在孕中期 ,它是一种非创伤性产前诊断方法 ,适用于临床。     

孕妇外周血中胎儿DNA水平检测在子痫前期诊断中的应用

目的探讨孕妇外周血中胎儿DNA水平检测在子痫前期诊断中的应用价值。方法选择30例子痫前期孕妇为子痫前期组(其中轻度18例,重度12例),另选择30例正常孕妇作为对照组,两组孕妇分别于孕20周、孕晚期(子痫前期组孕33周+3、对照组孕34周+3)、分娩后1、3、6 h取外周血,采用荧光定量PCR检测外周血中Y染色体上的性别决定基因(SRY基因)胎儿DNA水平(B超确定两组孕妇所妊娠的胎儿均为男性);放射免疫法检测两组孕妇孕晚期内皮素水平。结果(1)子痫前期组孕20周时的胎儿DNA水平为(316±61)copy/m l,其中轻度、重度患者分别为(266±79)、(396±91)copy/m l;对照组孕妇为(165±43)copy/m l,子痫前期组及轻度、重度患者明显高于对照组,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)子痫前期组孕晚期胎儿DNA水平为(970±413)copy/m l,其中轻度、重度患者分别为(758±357)、(1285±573)copy/m l,对照组孕妇为(319±99)copy/m l,子痫前期组及轻度、重度患者明显高于对照组,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)子痫前期组产后1、3、6 h胎儿DNA水平分别为(139±45)、(76±31)、(44±13)copy/m l,其中轻度患者分别为(102±42)、(57±25)、(36±12)copy/m l,重度患者分别为(209±51)、(97±40)、(52±17)copy/m l;对照组分别为(33±13)、(9±5)、0 copy/m l。子痫前期组及轻度、重度患者明显高于对照组,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。(4)子痫前期组内皮素水平为(80±18)ng/L,其中轻度患者为(74±14)ng/L,重度患者为(89±32)ng/L;对照组为(50±11)ng/L,子痫前期组及轻度、重度患者明显高于对照组,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。(5)子痫前期组胎儿DNA水平与内皮素水平呈正相关关系(r=0.748,P<0.01)。结论孕妇外周血胎儿DNA水平变化可以作为预测和诊断子痫前期发病与疾病程度的一个指标。     

母血清及血浆中胎儿游离DNA的研究进展

发现母血浆及血清中胎儿游离DNA，为无创性产前诊断技术开辟新途径。利用母血中有男胎睾丸确定基因(SRY)特异性序列确定胎儿DNA存在。用PCR技术扩增SRY的单拷贝序列(DYSl4)，确定性别敏感性60％～100％。利用实时定量PCR技术测定母血清和血浆中胎儿DNA浓度，妊娠7周母血清中可确定胎儿DNA，随妊娠周增加胎儿DNA量也增高。另证明非整倍体核型胎儿在母血浆中的DNA浓度高于正常核型胎儿，母血浆中定量测定胎儿游离DNA技术可能成为筛查染色体非整倍体核型胎儿的一种手段。     

富集孕妇外周血中胎儿细胞行胎儿性别诊断

目的探讨对孕妇外周血中胎儿细胞进行非侵入性产前诊断的可行性。方法对６４例孕８～４０周孕妇外周血进行密度梯度离心法,富集胎儿细胞,并经显微镜下观察计数各种细胞所占百分比。同时,对所富集细胞经提取ＤＮＡ进行人Ｙ染色体特异ＤＮＡ扩增,判定胎儿性别并与新生儿性别进行对照。结果６４例孕妇外周血中,２５例观察到有核红细胞,占３９．０６％。６４例孕妇分娩３３例男性婴儿,其中２８例扩增出Ｙ特异带;另外３１例分娩女性婴儿,除１例出现Ｙ特异带,其余未见特异带。诊断的灵敏度为８４．８５％,特异度为９６．７７％,总符合率为９０．６３％。结论密度梯度离心法可从孕妇血中富集胎儿细胞,且所获得细胞已基本满足体外扩增Ｙ染色体基因所需要的模板量。     

应用Rh阴性孕妇外周血胎儿游离DNA进行RhD血型产前基因诊断

目的探讨利用Rh阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿RhD血型的方法。方法通过SRY基因确定胎儿DNA的存在，采用PCR-SSP技术对32例妊娠11～40周的单胎RhD阴性孕妇血浆中胎儿游离DNA进行RHD基因外显子5、7、10和内含子4的特异性扩增，其基因型结果与产后新生儿脐血血清学检测结果进行对比性分析，回顾性评价胎儿基因分型结果的准确性。结果32例样本中，28例基因定型结果与血清学表型相符，准确率达到87．5％，通过检测RHD1227A等位基因鉴定了RhD放散型，使结果达到93．75％（30／32）的准确率。结论利用Rh阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性诊断胎儿RhD血型，是一种简便、快速且无损伤性的产前基因诊断的可行性方法，可用于新生儿溶血病的预防和诊断，值得临床推广应用。     

荧光定量聚合酶链反应技术快速产前诊断常见染色体非整倍体的临床应用

目的 探讨荧光定量聚合酶链反应(quantitative fluorescent polymerase chain reaction,QF-PCR)技术在快速产前诊断染色体非整倍体中的临床应用价值. 方法 分别选择21、18、13、X及Y染色体上的22个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点及AMXY作为遗传标记,用QF-PCR技术对因唐氏综合征筛查高风险和高龄妊娠(≥35岁)行介入性产前诊断的1740例孕妇的绒毛或羊水样本进行检测,并同时进行染色体核型分析,比较并分析2种方法 检测结果 的符合率.结果 共有1690例产前诊断样本同时成功进行染色体核型分析和QF-PCR技术检测.所有QF-PCR检测报告均在48 h内得出.QF-PCR技术共检出染色体数目正常1649例,占97.57％;异常41例,占2.43％.其中染色体核型分析检测到的1639例正常病例,QF-PCR技术检测结果 均正常.染色体核型分析检测到51例染色体异常中,有41例用QF-PCR技术成功检测出,包括30例21-三体、6例18-三体、1例45,XO、1例47,XYY、1例47,XXX、1例69,XXX,1例47,XXY[94]/46,XY[6](QF-PCR技术检测结果 为47,XXY).QF-PCR技术对21、18、13、X及Y染色体非整倍体检出率100.0％,无假阳性.对于唐氏综合征筛查高风险和高龄妊娠人群,QF-PCR与染色体核型分析这2种方法 检测一致性可达99.4％ (1680/1690),该人群中2例染色体数目异常嵌合体、4例结构异常嵌合体及4例染色体结构异常病例QF-PCR技术未能检出,占总检测样本0.6％(10/1690).结论 QF-PCR技术能够快速、准确、经济、高效地产前诊断染色体非整倍体,对于21、18、13、X及Y染色体非整倍体检出率100.0％,对于唐氏综合征筛查高风险和高龄妊娠人群,QF-PCR可以准确和快速地为孕妇提供99.4％的诊断信息.     

Quantitative analysis of intact fetal cells in maternal plasma by real-time PCR

OBJECTIVE: Fetal genetic materials in maternal circulation might be potentially used for non-invasive prenatal diagnosis (NIPD). In this study, we quantitatively analysed the intact fetal cells existing in maternal plasma, which would be a special method of NIPD. STUDY DESIGN: Eleven samples from preeclamptic patients, two samples from patients with RhD incompatibilities, and 30 samples from normal pregnancies as controls were collected. The intact cells in the plasma fraction were separated by centrifugation at high speed. The intact cell pellets were washed with PBS to remove any cell-free DNA. RESULTS: We were able to detect intact fetal cells in 3 out of 11 preeclamptic plasma samples from women carrying male fetuses, and from both plasma samples of RhD incompatibility affected pregnancies. However, intact fetal cells were not detected in all the 16 normal pregnancies with a male fetus, although cell-free fetal DNA was detected in all these cases. CONCLUSIONS: Intact fetal cells might be present in maternal plasma. However, the rarity of these cells limits their use for reliable, non-invasive prenatal diagnosis. The detection of such cells was successful in some preeclamptic and RhD incompatibility samples, not in the normal controls. Therefore, as opposed to free fetal DNA in maternal blood the use of intact fetal cells does not provide a reliable mode for NIPD.     

用聚合酶链式反应技术检测孕妇与胎儿巨细胞病毒感染的研究

应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术检测了孕妇、羊水及脐血中巨细胞病毒（ＣＭＶ）ＤＮＡ。结果表明，１８６例中正常孕妇９８例血清中ＣＭＶＤＮＡ阳性２例。阳性率为２％，异常妊娠（死胎、胎儿畸形及产前咨询）孕妇８８例血清中ＣＭＶＤＮＡ阳性１４例，阳性率为１５．９％，两者差异有显著性，（Ｐ＜０．０１）。提示孕妇ＣＭＶ感染与死胎、胎儿畸形及异常妊娠史有关。通过检测羊水和脐血中ＣＭＶＤＮＡ，发现９例胎儿ＣＭＶ感染，其中３例畸形，２例死胎，１例自然流产，３例足月分娩。     

运用胚外体腔液产前诊断α地中海贫血的临床研究

目的探讨胚外体腔穿刺液应用于α地中海贫血产前诊断的安全性及准确性。方法对40例妊娠6～10周、要求人工流产的单胎妊娠孕妇在终止妊娠前行胚外体腔穿刺术抽吸胚外体腔液，吸官术后取绒毛，采用聚合酶链反应(PCR)检测胚外体腔细胞及绒毛的α地中海贫血基因，比较两种标本诊断的符合率。结果36例胚外体腔细胞成功地扩增α地中海贫血基因，结果均与绒毛检测结果相符。结论通过胚外体腔穿刺术取胚外体腔细胞行PCR检测可用于α地中海贫血的早期产前诊断，具有可行性。