骨髓间充质干细胞向造血细胞分化的体外诱导体系构建及优化

目的构建模拟胚胎期不同造血部位的造血微环境体系用于体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)向造血细胞分化,并初步评价分化效率。方法采用体视显微镜及HE染色观察E11.5小鼠胚胎卵黄囊(YS)、胎盘(PL)和胎肝(FL)的解剖部位和形态;选取E7.5～E9.5、 E10.5～E12.5及E13.5～E15.5胚胎YS、 PL和FL组织进行基质细胞培养并制备条件培养液,即为卵黄囊基质细胞条件培养液(YSSC-CM)、胎盘基质细胞条件培养液(PLSC-CM)和胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM),与体外扩增的SD大鼠BMSC共培养。实验分为对照组、白细胞介素6(IL-6)联合干细胞因子(SCF)处理组、 YSSC-CM处理组、 PLSC-CM处理组和FLSC-CM处理组。共培养7～9 d,收集培养液中漂浮细胞。吉姆萨染色检测细胞形态,直接免疫荧光术检测细胞表面特异性分子CD34和CD45的表达,集落形成实验检测粒-巨噬细胞集落形成单位(GM-CFU)鉴定分化细胞。结果体视显微镜下观察鼠胚PL和FL与人胚的位置相同,而YS是包裹在胚体及羊膜的外侧, HE染色显示PL血管迷路、 FL血窦和YS血岛富含血细胞;倒置相差显微镜及细胞计数结果显示,与空白对照组及IL-6联合SCF处理组相比, YSSC-CM组、 PLSC-CM组和FLSC-CM组培养液中的漂浮细胞明显增多, FLSC-CM组最多;YSSC-CM组、 PLSC-CM组和FLSC-CM组漂浮细胞,经吉姆萨染色后形态类似于淋巴或单核样细胞,表达造血细胞特异性表面标志CD34和CD45,形成造血集落数最多是FLSC-CM组,其次是PLSC-CM组,最少为YSSC-CM组。而对照组和IL-6联合SCF处理组无变化。结论依循阶段性和时序性,获取YS、 PL和FL并制备了YSSC-CM、 PLSC-CM和FLSC-CM,可诱导SD大鼠BMSC向造血细胞分化, FLSC-CM处理的细胞分化效率较优。     

成人骨髓间充质干细胞对造血干细胞体外增殖的影响

目的研究骨髓间充质干细胞（MSC）对脐带血（CB）CD34^＋细胞体外增殖和造血重建能力的影响。方法取人骨髓单个核细胞贴壁培养．梭形细胞完全融合后传代，用流式细胞仪检测免疫表型；将CBCD34^＋细胞接种到MSC或其他培养液中．比较不同培养条件对造血干细胞扩增能力、集落形成能力及黏附分子表达的影响。结果在加入IL-3的培养体系中．在MSC和细胞因子作用下，CD34^＋细胞扩增7d和14d后，有核细胞（NC）、CD34^＋细胞和CDl33^＋细胞数，实验组均显著多于对照组。CD34＋细胞在未加入IL-3的培养体系中培养8d后，实验组NC、CD34^＋细胞、CD34^＋CD38-细胞和造血祖细胞集落扩增倍数均显著高于对照组。扩增后CD34^＋细胞的ALCAM、VLA-α4、VLA-α5、VLA-β1、HCAM、PECAM和LFA-1表达较扩增前无显著变化。结论MSC可为造血干细胞（HSC）体外扩增提供适宜的微环境，有助于CD34^＋细胞体外增殖并抑制HSC分化，保持其造血重建潜能和归巢能力。     

系统性红斑狼疮患者血清IgG对骨髓造血干/祖细胞抑制和凋亡的研究

目的：观察系统性红斑狼疮（SLE）患者血清IgG类抗体体外造血抑制活性及其与造血细胞过度凋亡的关系.方法：应用甲基纤维素集落培养法、原位末端标记及流式细胞术观察系统性红斑狼疮患者血清IgG在体外抑制正常骨髓造血干/祖细胞的增殖及促进正常CD34＋细胞的凋亡.结果：活动期SLE患者血清IgG体外可明显抑制正常骨髓粒-巨噬系祖细胞（CFU-GM）和红系祖细胞（CFU-E）的增殖.这种IgG可特异吸附于正常CD34＋细胞表面,加速CD34＋细胞凋亡,上调CD34＋细胞Fas抗原表达水平.结论：活动期SLE患者血清IgG在体外可抑制正常骨髓造血干/祖细胞的增殖.机制与其上调CD34＋ Fas抗原表达水平而促进CD34＋细胞凋亡有关.     

血管内皮生长因子促进小鼠胚胎干细胞的造血分化

目的：研究血管内皮生长因子(VEGF)体外促进小鼠胚胎干细胞系ES-D3向造血分化的能力。方法：先将ES-D3形成拟胚体，将拟胚体细胞转入含不同浓度的VEGF和VEGF+SCF的培养基中。实验分6组，分别为VEGF 5 μg/L组、VEGF 10 μg/L组、VEGF 20 μg/L组、VEGF 5 μg/L＋SCF组、VEGF 10 μg/L＋SCF组、VEGF 20 μg/L＋SCF组，同时设不加因子的自发分化对照组。RT-PCR检测造血转录基因GATA-2和早期造血细胞基因c-kit和β-H1的表达，流式细胞仪检测CD34+细胞，甲基纤维素半固体培养法检测生成造血集落的能力。结果：经过1周的诱导培养，实验组生成的细胞可以表达GATA-2、c-kit和β-H1，CD34＋细胞的比例也升高，并可形成造血祖细胞的集落。从诱导生成CD34＋细胞的比例和生成的集落数量看，VEGF联合SCF组的诱导效率要高于VEGF单用组和对照组，其中以VEGF 20 μg/L＋SCF组和VEGF 10 μg/L＋SCF组的诱导效率最高。结论：VEGF能够促进ESC的早期造血分化，尤以与SCF合用时，其诱导效率更高。     

重组人IL-15促人脐血CD34+造血干细胞定向分化为NK细胞

目的 探讨IL－15促CD34^ 造血干细胞定向分化为NK细胞的作用。方法 采用MACS法分离脐血中CD34^ 细胞，分别用IL－15、SCF（造血干细胞因子）和IL－15 SCF体外培养，流式细胞仪测定CD3、CD16、CD56分子，MTT法检测NK细胞杀伤活性。结果 IL－15可以促进CD34^ 细胞分化为以CD56^ CD16^-为主的NK细胞，SCF具有较强的协同作用。结论 IL－15具有促使NK细胞定向分化的作用。     

白细胞介素4调节人脐带间充质干细胞的增殖和造血支持能力

 目的:间充质干细胞（MSC）被认为在多种自身免疫系统疾病和移植物抗宿主病中有良好的应用前景,但是其在各种炎症因子作用下生物学功能的变化仍然值得进一步研究。本文探讨了白细胞介素4（IL-4）对脐带间充质干细胞（UC-MSC）的多种生物学特性以及造血支持作用的影响。 方法: IL-4刺激UC-MSC后,使用流式细胞术检测UC-MSC免疫表型;使用MTT检测细胞活力改变,并使用BrdU-ELISA的方法,检测其增殖能力;使用油红O和茜素红染色来检测UC-MSC成脂和成骨分化;使用实时荧光定量PCR的方法,检测UC-MSC中mRMA表达的差异;收集IL-4刺激的UC-MSC的上清,检测其在促进CD34+细胞集落形成能力的变化。 结果: IL-4刺激后,UC-MSC表面的CD11b、 CD19、 CD34、 CD45、 CD73、 CD90、 CD105、人类白细胞抗原（HLA)-DR和HLA-ABC并未有明显改变。MTT和BrdU-ELISA都表明,IL-4处理组UC-MSC的增殖在72 h后相对于未处理组明显下降（P<0.05）。IL-4处理后,UC-MSC成脂和成骨分化能力未检测到明显的变化。此外,IL-4可以明显增强UC-MSC中IL-6 mRNA表达（P<0.01）,增强UC-MSC培养上清的促CD34+细胞粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）的集落形成能力（P<0.01）。 结论: IL-4可以抑制UC-MSC增殖,促进UC-MSC造血支持能力。     

AGM区来源的基质细胞促进造血干细胞扩增的体外实验研究

目的： 探讨主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros，AGM）来源的基质细胞对造血干细胞（HSC）增殖的促进作用，为探寻HSC的体外扩增方法奠定实验基础。 方法： 分别从孕11 d BALB/c小鼠胚胎AGM区及6周龄小鼠骨髓分离、培养基质细胞，流式细胞仪等对基质细胞进行鉴定；利用小鼠胚胎干细胞（ESC）向造血细胞定向分化的模型，结合高增殖潜能集落（HPP-CFC）、原始细胞集落（BL-CFC）形成实验及流式细胞仪分析CD34+、CD34+Sca-1+细胞比例，对比研究AGM及骨髓基质细胞对ESC来源的HSC的扩增作用。 结果： 小鼠AGM和骨髓基质细胞在形态及表型上基本相似，均符合基质细胞的特征。AGM和骨髓基质细胞均可促进ESC来源的HPP-CFC的形成，但AGM基质细胞还可促进ESC来源的 BL-CFC的形成；流式细胞仪检测发现：在骨髓基质细胞支持下，CD34+细胞增加了3-4倍，但CD34+/Sca-1+却无明显增加；而在AGM基质细胞支持下CD34+、CD34+Sca-1+细胞均明显增加了4-5倍。 结论： AGM基质细胞在有效扩增小鼠HSC同时，能很好地维持HSC自我更新及多向分化的潜能。     

FK228促进IL-3介导的人红系前体细胞的增殖与分化

目的:探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂FK228在IL-3介导的人红系前体细胞增殖与分化中的调节作用.方法:经粒细胞集落刺激因子动员的肿瘤患者外周血单核细胞中分离CD34 细胞,用含干细胞生长因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)或SCF IL-3及不同浓度FK228的无血清培养液培养7 d,分别用抗CD14、GPA、CD15及CD36单克隆抗体(mAb)染色并行流式细胞术(FCM)检测;将CD34 细胞用含SCF、IL-3或SCF IL-3及FK228的半固体培养液培养,并行细胞集落分析;将CD34 细胞用含SCF IL-3的培养液培养7 d,然后分离CD36 GPA-细胞,将细胞用含有IL-3 FK228的半固体培养液中培养,并行细胞集落分析.结果:FK228以一种剂量依赖方式促进CD36 细胞的产生,对CD14 细胞及CD15 细胞的产生无明显影响;0.5 μg/L FK228可明显增加含IL-3培养体系中CD36 细胞的数量;FK228可明显增加含IL-3的半固体培养基中集落形成的数量及组成单个集落的细胞数;FK228可明显促进CD36 GPA-细胞在含IL-3的半固体培养基中形成红细胞集落.结论:FK228可促进白细胞介素3介导的人红系前体细胞的增殖与分化.     

转FL、GM-CSF基因的人骨髓基质细胞促进脐血CD34+细胞体外扩增

研究转FL、GM-CSF基因的基质细胞对脐血CD34+细胞的扩增效应.将转FL、GM-CSF基因的入骨髓基质细胞系与脐血CD34+细胞共培养,观察细胞总数、CD34+细胞数、CFU-GM的变化情况.培养到第4周时,第(4)组(SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+FL)和第(8)组(HFCL/hGM-CSF+HFCL/hFL+SCF+IL-3+IL-6)的细胞总数增加到最大,分别扩增了717±24.47和709±63.63,第1周,第(5)组(HFCL+SCF+IL-3+IL-6)扩增了10.5±2.08倍,较第(8)组减少(P＜0.05).第1周时,CD34+细胞总数第(4)组和第(8)组分别扩增了8.44倍和11.5倍(P＜0.05),CD34+细胞百分率第(7)组(FCL/hFL+SCF+IL-3+II,-6)为50.2%,第(6)组(HFCL/hGM-CSF+SCF+IL-3+IL-6)为28.95%(P＜0.01).第2周,各组CFU-GM增加显著,以第(4)组和第(8)组增加最为明显,以后随扩增时间延长,造血细胞集落数、集落体积逐渐减少.表明转FL、GM-CSF基因的基质细胞,能有效的协同其他细胞因子对脐血CD34+细胞产生明显的扩增作用,能显著改变基质细胞造血功能.     

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞发育为造血干/祖细胞方法的初步研究

目的:探讨体外定向诱导胚胎干细胞(ESC)发育为造血干细胞(HSC)的方法。方法:将小鼠E14胚胎干细胞在含干细胞生长因子(SCF)和血管内皮生长因子(VEGF)的甲基纤维素培养基中首先诱导发育为胚胎体(EB),再将EB置于均含SCF、VEGF、IL-3、IL-6及促红细胞生成素(EPO)的3种不同培养体系中定向分化为HSC,并观察HSC表面标志性抗原、造血集落形成及瑞氏-姬姆萨染色的结果。结果:经两阶段诱导ESC分化为HSC,发现在甲基纤维素半固体培养体系中HSC发育缓慢,分化14d后CD34+/Sca-1+细胞数最高为(31.5±4.7)%;而在骨髓基质细胞饲养层上HSC发育较快,细胞数量较多,分化第10dCD34+/Sca-1+细胞数即达到峰值,为(47.8±6.3)%;骨髓基质细胞饲养层+胎肝基质细胞上清培养体系中HSC发育同样迅速,所产生的CD34+/Sca-1+细胞数量在3个体系中最高,为(53.6±7.2)%。经瑞氏-姬姆萨染色证实上述细胞为早期造血细胞,均有形成各系造血细胞集落的能力。结论:使用骨髓基质细胞饲养层+胎肝基质细胞上清培养体系及SCF、VEGF、IL-3、IL-6及EPO等细胞因子,通过两阶段诱导分化,可从小鼠ESC获得较高比例的HSC。     

Hematopoietic differentiation of embryoid bodies derived from the human embryonic stem cell line SNUhES3 in co-culture with human bone marrow stromal cells

Human embryonic stem (ES) cells can be induced to differentiate into hematopoietic precursor cells via two methods: the formation of embryoid bodies (EBs) and co-culture with mouse bone marrow (BM) stromal cells. In this study, the above two methods have been combined by co-culture of human ES-cell-derived EBs with human BM stromal cells. The efficacy of this method was compared with that using EB formation alone. The undifferentiated human ES cell line SNUhES3 was allowed to form EBs for two days, then EBs were induced to differentiate in the presence of a different serum concentration (EB and EB/high FBS group), or co- cultured with human BM stromal cells (EB/BM co-culture group). Flow cytometry and hematopoietic colony-forming assays were used to assess hematopoietic differentiation in the three groups. While no significant increase of CD34+/CD45- or CD34+/CD38- cells was noted in the three groups on days 3 and 5, the percentage of CD34+/CD45- cells and CD34+/ CD38- cells was significantly higher in the EB/BM co-culture group than in the EB and EB/high FBS groups on day 10. The number of colony-forming cells (CFCs) was increased in the EB/BM co-culture group on days 7 and 10, implying a possible role for human BM stromal cells in supporting hematopoietic differentiation from human ES cell-derived EBs. These results demonstrate that co-culture of human ES-cell-derived EBs with human BM stromal cells might lead to more efficient hematopoietic differentiation from human ES cells cultured alone. Further study is warranted to evaluate the underlying mechanism.     

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景：前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。 目的：模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。 方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL和EB/AGM+FL+BM共4组。共培养6 d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。 结果与结论：①EB/AGM+FL组和EB/AGM+FL+BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+ 细胞明显升高(P < 0.05)。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P < 0.05), 而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM+FL和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。     

人胎骨髓MSCs的分离鉴定及其向肝细胞样细胞的分化

目的: 分离鉴定人胎骨髓中的间质干细胞(MSCs),探索其体外培养的生物学特性，并在化学因子作用下诱导其向肝细胞分化。方法: 利用细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎骨髓MSCs；利用流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志；添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨方向分化;采用DMSO、β-Me和5-aza联合预诱导24 h,换用H-DMEM和 rh-HGF正式诱导人胎骨髓MSCs向肝细胞分化，并从形态学和特异性细胞化学染色等方面加以鉴定。结果: 从人胎骨髓中成功分离、纯化得到MSCs，P4代MSCs有92.3%的细胞处于G₀/G₁期；P5代MSCs有96.1%的细胞处于G₀/G₁期。流式细胞仪检测P3代MSCs结果显示：人胎骨髓MSCs表达CD29、CD44、CD105和CD106 ,不表达造血细胞标志CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L。在经典的诱导条件下，人胎骨髓MSCs可快速向脂肪及成骨细胞分化；在上述诱导条件下，人胎肝MSCs可分化为类肝细胞,表达特异性抗原甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）。结论: 人胎骨髓中含有丰富的MSCs,人胎骨髓来源的MSCs具有较强的多向分化潜能，经DMSO、β-Me和5-aza联合预诱导及rh-HGF、nictinion等化学因子的作用，易向肝细胞样细胞分化，且免疫原性弱,是组织工程（生物型人工肝）的较为理想的种子细胞。     

人胎盘贴壁细胞定向诱导神经样细胞

目的 探讨胎盘组织培养贴壁细胞的分离培养以及定向诱导神经细胞分化的生物潜能,从而研究胎盘贴壁细胞与神经发育的相互关系。方法 用胰酶消化分离培养人胎盘组织中的贴壁细胞,并应用抗体Nestin、MAP2、MBP、CD133、CD34等进行免疫细胞化学染色,用2-巯基乙醇和反式维甲酸进行体外向神经细胞诱导分化。结果 分离培养出胎盘组织贴壁细胞,是一异质性细胞群体。培养的贴壁细胞表达CD133,不表达CD34,同时表达Nestin和MAP2。经定向神经诱导后的人胎盘贴壁细胞出现神经样细胞的形态,强表达Nestin和MAP2,弱表达MBP和GFAP。结论 人胎盘贴壁细胞经体外定向诱导可分化为神经样细胞,其具有间充质干细胞（MSC）性质,胎盘组织是一个MSC的重要来源。     

人AGM区及胎肝基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向造血干细胞分化和体内造血重建

目的: 探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)经人主动脉-性腺-中肾(AGM)区及胎肝(FL)基质细胞程序诱导后,向造血干细胞(HSCs)分化的效率及其造血功能。方法: 将E14 ESCs诱导为拟胚体(EB),并在人AGM区及FL基质细胞饲养层上进一步诱导分化,培养6 d后收集细胞检测Sca-1⁺c-Kit⁺细胞含量、分析造血细胞集落形成能力及致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植经致死量 γ射线辐照的BALB/c雌鼠,观察生存率、植入状况和造血重建。结果: (1)EB来源细胞经人AGM区及FL基质细胞程序诱导后Sca-1⁺c-Kit⁺细胞含量为(21.96±2.54)%,造血集落总数为(520±52)/10⁵cells,明显优于诱导前及人AGM区基质细胞初步诱导者(P＜0.05)。(2)NOD-SCID小鼠接种经人AGM区及FL基质细胞诱导的ESCs未见畸胎瘤。(3)BALB/c雌鼠移植经人AGM区及FL基质细胞诱导的EB来源细胞后生存率77.8%,14 d外周血细胞计数明显改善,存活受鼠均检测到供体来源sry基因,而移植人AGM区基质细胞诱导的EB细胞者15 d内全部死亡。结论: 人AGM区及FL基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs,有效重建体内造血功能。     

体外诱导羊膜来源间充质干细胞分化为血管内皮细胞

背景：羊膜来源间充质干细胞植入机体不同类型组织后是否可以分化为相应组织靶细胞呢？ 目的：检测血管内皮细胞生长因子在体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。 方法：分离培养羊膜间充质干细胞,鉴定其表面抗原表达,用含体积分数2%胎牛血清以及50 μg/L血管内皮生长因子的条件培养基诱导,诱导后细胞通过内皮细胞标志物血管内皮生长因子受体2以及v-WF染色鉴定。 结果与结论：羊膜间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变,内皮细胞标志物血管内皮细胞生长因子受体2以及v-WF染色结果阳性。提示羊膜间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力。     

Simian immunodeficiency virus infection of hematopoietic stem cells and bone marrow stromal cells

Using a well-characterized fetal rhesus monkey model, simian immunodeficiency virus (SIV) infection of hematopoietic stem cells (HSCs) and stromal cells was investigated to characterize bone marrow abnormalities in SIV-infected animals in vivo. Fetuses (n = 4) were inoculated in utero with pathogenic SIVmac251 using established techniques at 65 days; gestation (early second trimester), then harvested for tissues 65 days after inoculation (late third trimester), and compared with findings from controls of a comparable age (n = 11). Sorted bone marrow CD34CD38, CD34CD38, and marrow stromal cells were analyzed for the SIV genome. Results indicate that CD34CD38 HSCs were not infected, whereas the SIV genome was detected in the CD34CD38 hematopoietic cell population by PCR analysis. The SIV proviral sequence was not detected in stromal cells from SIV-infected fetuses, although SIVmac251 was found to readily infect these cells when assessed in vitro. Flow cytometric analysis revealed that stromal cells express low levels (1 in 600 total cells) of CD4 and CCR5 viral receptors, whereas CXCR4 expression was not observed. These data suggest the following: (1) SIV infection of HSCs requires some degree of differentiation for viral entry similar to findings for humans infected with HIV type 1, and (2) SIV can infect bone marrow stromal cells that express CD4 and CCR5 in vitro, but infected stromal cells are not readily found in vivo.