利用缺陷型单纯疱疹病毒载体在大鼠中枢神经系统…

本研究利用构建的Ｉ型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－１）扩增子质粒载体ｐＨＳＬ，在辅助病毒ＨＳＶ－１ｔｓＫ（许可温度３１℃）的辅助下，以首尾相连的连接全形成包装成复制缺陷型的ＨＳＶ－１假病毒颗粒，得到一种ＨＳＶ－１混合毒种ｄｖＨＳＬ。将ｄｖＨＳＬ接种体外培养的大鼠胚胎脊髓运动神经元和大脑皮质神经元后均可获得报告基因的表达；接种大鼠角膜后ｌａｃＺ基因三叉神经节中持续表达两个月；直接注射接种到大鼠前脑上质后，可     

质粒型单纯疱疹病毒载体的构建及其在真核细胞中的表达

利用基因工程技术构建成功质粒型Ⅰ型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－１）载体ｐＨＳＶ，其中含有ＨＳＶ－１包装信号序列和ＨＳＶ－１复制起点，以及ＨＳＶ－１ＩＥ６８启动子。为验证其构建是否成功，在其ＩＥ６８启动子下游的多克隆位点上插入了Ｅ．ｃｏｌｉＬａｃＺ基因，构建成ｐＨＳＶＬ质粒。用ＨＳＶ－１温度敏感株（ｔｓＫ株）超感染传代细胞后，将这种质粒转染入该细胞，ｐＨＳＶＬ可在辅助病毒ＨＳＶ－１ｔｓＫ（允许温度为３１℃）存在的条件下被包装成病毒颗粒，由此得到的混合病毒含有ＨＳＶ－１ｔｓＫ和ｐＨＳＶＬ假病毒颗粒，收获后再感染培养的Ｖｅｒｏ细胞，原位检测β－半乳糖苷酶活性呈阳性。同时用ｐＨＳＶＬ病毒接种体外培养的ＳＤ大鼠胚胎脊髓运动神经元，用Ｘ－ｇａｌ原位检测β－半乳糖苷酶的活性，亦发现有阳性的神经元存在。说明载体ｐＨＳＶＬ携带的报告基因ｌａｃＺ在这两种真核细胞中均得以正确表达。报告基因可为其它目的基因所代替，可用于神经生理、病理以及神经系统疾病基因治疗的实验研究。     

利用缺陷型单纯疱疹病毒载体在大鼠中枢神经系统表达外源基因

本研究利用构建的Ⅰ型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－１）扩增子质粒载体ｐＨＳＬ，在辅助病毒ＨＳＶ－１ｔｓＫ（许可温度３１℃）的辅助下，以首尾相连的连接体形式被包装成复制缺陷型的ＨＳＶ－１假病毒颗粒，得到一种ＨＳＶ－１混合毒种ｄｖＨＳＬ。将ｄｖＨＳＬ接种体外培养的大鼠胚胎脊髓运动神经元和大脑皮质神经元后均可获得报告基因的表达；接种大鼠角膜后，ｌａｃＺ基因在三叉神经节中持续表达两个月；直接注射接种到大鼠前脑皮质后，可在注射部位的局部表达报告基因近两个月。研究结果表明上述缺陷型单纯疱疹病毒载体可作为神经系统基因转移的工具，应用于神经系统生理、病理及神经系统疾病基因治疗的实验研究     

乙型肝炎病毒在丁型肝炎病毒包装中的作用机理研究

用含ＨＢＶ全基因和ＨＢＶ大、中、小分子表面蛋白基因的真核细胞表达质粒（ＣＭＶ－ＨＢＶ、ＣＭＶ－ＬＳ、ＣＭＶ－ＭＳ、ＣＭＶ－Ｓ）分别与含ＨＤＶ ｃＤＮＡ三聚体的重组质粒共转染ＣＨＯ细胞。转染后３天在上述４种转染细胞内及培养上清中均检出了ＨＤＶ ＲＮＡ和ＨＤＡｇ表明上述４种转染细胞的培养上清中均有ＨＤＶ病毒颗粒的包装和分泌。提示：ＨＤＶ病毒的包装可能仅需ＨＢＶ Ｓ 基因及其小分子表面蛋白的辅助。     

乙型肝炎病毒前S蛋白作为“饵”载体的构建及表达(简报)

乙型肝炎 (ＨＢ)是一种全球性疾病 ,病毒携带率约 8%～ 10 % ,ＨＢ又常常发展为慢性肝炎、肝硬化和肝癌。ＨＢＶ属于嗜肝ＤＮＡ病毒 ,有包膜 ,有很强的种属特异性 ,ＨＢＶ只能感染人和大猩猩 ,这有碍于体外模型的建立和研究。但是用ＨＢＶＤＮＡ转染其他哺乳动物细胞系后 ,可获得病毒的复制 ,因此认为ＨＢＶ的种属特异性决定于病毒受体和配体的特异性结合。对病毒特异性受体的研究有利于研究病毒感染机制 ,也有助于阻断病毒受体的入胞。酵母双杂合体系 (ｙｅａｓｔｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ)的基本原理是利用酿酒酵母(Ｓａｃｃｈａｒ…     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因

目前丙型肝炎病毒 (ＨＣＶ)与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制尚不清楚 ,病毒编码的蛋白能够影响多种细胞信号转导途径 ,从而影响肝细胞某些基因的表达、调控 ,可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因。本实验应用抑制性消减杂交(ＳＳＨ) ,构建ＨＣＶＮＳ3反式激活的相关基因ｃＤＮＡ消减文库 ,通过对所得片段进行序列同源性分析 ,筛选相关的靶基因 ,为研究ＨＣＶ致病机制提供资料。应用ＰＣＲ扩增ＨＣＶＮＳ3基因 ,并将其克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ3.1(- )中 ,构建成含有 1893ｂｐ目的基因的质粒ｐｃＤＮＡ3.1…     

核酶对鸭乙型肝炎病毒感染体内抗病毒作用效果的观察

目的观察核酶在体内抗病毒作用效果。方法选择鸭乙型肝炎（ＤＨＢＶＬＪ－７６）及其鸭动物模型作为检测系统，将针对ＤＨＢＶＰｒｅ－Ｓ７３６位点的核酶（ＲｚＤＳ）插入ｐＪ１２０质粒构建成ｐＪ－ＲｚＤＳ。与痘苗病毒天坛７６１株（ＶＶ）同源重组后获得含ＲｚＤＳ的重组痘苗病毒（Ｖ－ＲｚＤＳ）。用ＤＨＢＶ感染１日龄北京鸭，分别在感染的同时、感染后２４小时和７２小时注射Ｖ－ＲｚＤＳ和ＶＶ，１０天后检测血清中ＤＨＢＶＤＮＡ和ＤＨＢｓＡｇ的含量。结果北京鸭在感染ＤＨＢＶ的同时注射Ｖ－ＲｚＤＳ，其ＤＨＢＶＤＮＡ和ＤＨＢｓＡｇ的含量均低于ＶＶ对照组，两组之间有显著性差异。结论提示ＲｚＤＳ对ＤＨＢＶ基因组复制和表达均有抑制作用，其抑制率分别为４５％和６３％。     

乙型肝炎病毒复制过程的研究进展

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）复制周期是Ｓｕｍｍｅｒｓ和Ｍａｓｏｎ在１９８２年观察鸭乙肝病毒（ＨＢＶ）复制后描述的〔１〕。ＨＢＶ的复制首先是ＨＢＶＤＮＡ由不完整环状的补成完整的环状ＤＮＡ,再形成超螺旋ＤＮＡ（Ｓｕｐｅｎ－ｃｏｉｌｅｄＳｃＤＮＡ）,又称共价闭合...     

携带外源基因的HBV在HepG2细胞中的表达与复制

我们以体外能够表达野生ＨＢＶ的质粒ｐＨＢＶ30 91为研究对象 ,用ＧＦＰ基因替代ＨＢＶ的Ｓ读码框构建携带外源基因的重组ＨＢＶ载体ｐＨＢＶ Ｓ ＧＦＰ。为了保证重组载体中外源基因能够有效表达及整个ＨＢＶ基因读码框的顺利通读 ,在改造ＨＢＶ时保留了Ｓ基因的前 9个核苷酸使ＧＦＰ与之融合 ,从而保证Ｓ基因起始密码子附近的ＤＮＡ结构尽可能与野生ＨＢＶ一致 ,保持ＨＢＶ自身基因表达调控元件的特性。结果表明 :(1)将构建的重组ＨＢＶ基金项目 :国家自然科学基金资助项目( 30 170 85 4) ;全军医药卫生科研基金资助项目( 0 1ＭＡ0 10 )…     

乙型肝炎患者HBV M和HBV DNA的相关性研究

目的 探讨乙型肝炎患者的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）血清学标志（ＨＢＶ Ｍ）与ＨＢＶ ＤＮＡ检测结果的相关性与临床意义。方法 对４１４例乙型肝炎的ＨＢＶ Ｍ和ＨＢＶ ＤＮＡ检测结果进行比较。ＨＢＶ Ｍ用ＥＬＩＳＡ定量分析法检测,ＨＢＶ ＤＮＡ用斑点杂交法检测。结果 急性、慢性乙型肝炎患者中ＨＢＶ ＤＮＡ的阳性率与乙型肝炎肝硬化患者的ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率比较,差异有显著性;ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｅ、抗－ＨＢｃ阳性和ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢｃ阳性组的ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率比较,差异无显著性;ＨＢｓＡｇ和／或ＨＢｅＡｇ的滴度与ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率呈正相关关系。结论 ＨＢＶ ＤＮＡ是评价ＨＢＶ活动最理想的标志;抗－ＨＢｅ的出现不能作为ＨＢＶ复制停止的指标;ＨＢｓＡｇ的滴度和ＨＢｅＡｇ的滴度变化可作为临床评价病毒复制程度和     

鸭乙型肝炎病毒DNA体内转染的研究

利用两种鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ双体质粒及环化的ＤＨＢＶＤＮＡ体内转染２ｄ龄鸭及４～２０ｄ龄鸭，大多数鸭产生了短暂病毒血症，少数鸭产持续病毒血症，转染鸭血清中检测得ＤＨＢｓ／ｐｒｅＳＡｇ，ＤＨＢＶＤＮＡ及ＤＨＢＶ病毒颗粒，转染鸭血清腹腔注射１ｄ龄鸭可感染成功，转染鸭肝组织检测到复制型ＤＨＢＶＤＮＡ，提示转染后既有抗原有的表达，又有病毒的复制。另外，用两种ＤＨＢＶＤＮＡ单体质粒体内转染２ｄｘ     

乙型肝炎病毒S基因129Leu和145Arg变异株的抗原表达？…

目的 研究我国发现的乙型病毒Ｓ基因突变株表达ＨＢｓＡｇ及ＤＮＡ免疫的特性。方法 用自乙肝疫苗免疫无保护婴儿血清中克隆的２株变异Ｓ基因片段,置换已知核苷酸序列并可表达及复制的ＨＢＶ１．２个拷贝全基因野毒株重组质粒Ｐ３．８Ⅱ的Ｓ基因,将重组质粒转染ＨｅｐＧ２细胞,用Ａｂｂｏｔｔ试剂和２４种单抗检测染细胞培养上清中ＨＢｓＡｇ的结合力。用重组质粒ＨｅｐＧ２细胞,用Ａｂｂｏｔｔ试剂和２４种单抗检测转染细胞培     

HBV血清免疫学标志和PHSAR与HBV DNA关系的研究

随ＰＣＲ技术的推广应用 ,以ＨＢＶＤＮＡ作为判断ＨＢＶ感染、病毒的复制状态、传染性及监测抗病毒疗效的一个重要标志 ,越来越受到人们的重视。本研究应用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ ,对 1484例ＨＢＶ感染者的ＨＢＶＤＮＡ和人血清白蛋白受体 (ＰＨＳＡＲ)进行了检测 ,旨在探讨ＨＢＶ血清免疫学标志物 (ＨＢＶ Ｍ )常见模式、ＨＢＶＤＮＡ和ＰＨＳＡＲ三者之间的相互关系及其临床检测的意义。1　材料和方法1.1　材料　ＨＢＶ血清免疫学标志物 (ＨＢＶ Ｍ )阳性血清标本 1484份 ,来自 1996 0 9～ 2 0 0 0 0 7本院门诊和住院乙肝患者 ,其中男性 1…     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

重组HBsAg免疫逃逸突变体的表达及其抗原性分析

为了深入研究乙型肝炎病毒S基因变异所致的包膜抗原抗原性的改变，从含ＨＢＶＤＮＡ双拷贝的质粒载体ｐＥｃｏｂ６，获得一个８３７ｂｐ的ＨＢＶ－Ｓ基因片段，将其插入至载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ~＋的ＳｍａⅠ位点，通过体外寡核苷酸介导的人工定点突变分别获得第１４５位、１２６位和第１４５位＋１２６位氨基酸三种Ｓ基因变异型。然后将这些Ｓ基因变异片段克隆到真核表达载体ｐＭＥｐ４上，从而构建了含ＨＢＶ－Ｓ基因及其突变型的表达载体ＰＭＥｐ４ＨＢＶＳＭ。用其转染人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２，获得稳定分泌ＨＢｓＡｇ及其变异体的抗性细胞系。经体外初步研究表明，ＨＢｓＡｇ １４５位氨基酸变异体可影响ＨＢｓＡｇ的“ａ”抗原决定簇的结构。     

杜氏利什曼原虫热休克蛋白70的DNA疫苗表达载体构建及体内 …

以多聚酶链反应技术扩增获得了杜氏利什曼原虫热休克蛋白７０全长基因序列，构建ＤＮＡ疫苗表达载体ＰＶＲ１０２０－ＨＳＰ７０。以脂质体法我转染小鼠成纤维细胞系ＳＶＴ２，应用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法证产构建的表达载体具有表达ＨＳ宾能力，以１０μｇ的ＤＮＡＵ凤苗表达载体质粒经肌肉、皮下注射进行免疫，２周后即可出现抗ＨＳＰ７０的抗体应答。建立了ＤＮＡ疫苗免疫应答的模型。     

吸毒人群中HGV和HBV的同步检测

ＨＢＶ、ＨＣＶ和ＨＧＶ有共同的感染途径,ＨＢＶ为ＤＮＡ病毒,ＨＧＶ为ＲＮＡ病毒。我们建立了ＨＧＶＨＢＶＰＣＲ同步检测法,并用该方法和ＥＬＩＳＡ法检测血清中ＨＧＶＲＮＡ、ＨＢＶＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ和抗ＨＣＶＩｇＧ以及谷丙转氨酶(ＡＬＴ)水平,调查武汉市第一戒毒所106名吸毒者ＨＧＶ与ＨＢＶ、ＨＣＶ感染情况。通过改变ＲＮＡ提取液的ｐＨ值,可同时提取ＨＧＶＲＮＡ和ＨＢＶＤＮＡ,基金项目:湖北省教委资助项目作者单位:湖北医科大学病毒研究所(郑义,伍欣星,赵,赵文先);湖北省嘉鱼县血防站(高胜君)通信作者:郑义,430022武汉市第…     

杜氏利什曼原虫热休克蛋白70的DNA疫苗表达载体构建及体内应答研究

以多聚酶链反应技术扩增获得了杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）全长基因序列，构建ＤＮＡ疫苗表达载体ｐＶＲ１０２０－ＨＳＰ７０。以脂质体法体外转染小鼠成纤维细胞系ＳＶＴ２，应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法证实构建的表达载体具有表达ＨＳＰ７０的能力。以１０μｇ的ＤＮＡ疫苗表达载体质粒经肌肉、皮下注射进行免疫，２周后即可出现抗－ＨＳＰ７０的抗体应答。建立了ＤＮＡ疫苗免疫应答的模型。     

乙肝抗体阳性患者中检测HBV-DNA的意义

乙肝抗体阳性患者中检测ＨＢＶ┐ＤＮＡ的意义潘韶霞李守炳刘茂林徐静山葛汝村单独抗ＨＢｓ阳性者６８例，ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ有５例阳性，阳性率７．３６％。说明血液中ＨＢｓＡｇ向抗ＨＢｓ转换后仍有部分患者存在ＨＢＶ的复制，可能与ＨＢＶ亚型的双重感染或病毒...     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。