骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究

目的探讨将骺板软骨细胞复合三维支架经体外培养,构建组织工程软骨的效果及其生物学特点. 方法将3周龄幼兔第1代骺板软骨细胞与液态的生物凝胶混合,接种于聚磷酸钙纤维/L-聚乳酸(CPPF/PLLA)三维支架材料,构建组织工程软骨组织块,连续培养4周.行大体、倒置显微镜及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组织化学光镜观察,定量检测硫酸糖胺多糖(GAG)含量. 结果构建的组织工程软骨块在培养过程中能保持其初始外形,种子细胞呈稳定的三维均相分布,外观逐渐呈乳白色、半透明,硬度亦不断增加.培养1周有软骨细胞陷窝形成,2周后形成富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的工程化软骨,且Ⅰ型胶原逐渐转为阴性.4周时构建软骨的组织结构与天然骺板软骨相类似,硫酸GAG含量平均为天然骺板软骨的34%以上. 结论骺板软骨细胞复合三维支架体外培养可生成典型软骨,且可形成类似天然骺板软骨的组织结构,能满足修复骺板缺损的基本要求.体外培养1～2周可能是植入体内修复骺板缺损的较佳时机.     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的 研究软骨组织工程中传代软骨细胞与原代的差异。方法 用５个月人胎关节软骨分离培养细胞,观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学的改变。结果 ⑴软骨块在４℃下,３ｄ内细胞存活率可达９３．４％～９７．６％。⑵原代细胞为圆形或三角形;第４代有一半转变成梭形,到第６代全部变为长梭形。⑶传代细胞贴壁时间（２～３ｈ）短于原代（４～７ｈ）。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为７８．７％～８５．５％,原代８．８％。⑷     

软骨细胞移植修复关节软骨的进展

本文扼要介绍了软骨细胞及其影响因素，为软骨细胞提供了立体三维结构的降解材料，并概述了移植软骨细胞与宿主间的免疫学问题，软骨细胞移植的发展前景与存在的问题。     

组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的初步研究

目的 探讨运用组织工程软骨植入修复兔胫骨平台外侧髁全关节软骨浅层缺损的可行性。方法 取2周龄乳兔软骨细胞体外培养传代至第3代后，与人胎盘I型胶原蛋白海绵复合后植入成年兔的胫骨体平台外侧髁浅层完全软骨缺损区，并设立空白对照组，分别于术后4、12和24周取材，观察修复效果。结果 实验组术后4周缺损表面未见明显的新生软骨形成；12周，缺损表面有少量的新生软骨形成，组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的，小蜂窝状结构，软骨细胞周围有软骨陷窝形成；24周，缺损表面的新生软骨较4、12周的新生软骨明显，表面光滑，且与周围组织结合紧密，但仍存在部分缺损尚未修复。组织学切片上可见软骨陷窝形成，并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质。面对照组则均未见明显的修复。结论 制成的组织工程软骨对兔胫骨平台软骨浅层完全缺损有修复作用，但不能完全修复缺损。     

关节软骨源性多孔支架复合自体软骨细胞修复兔关节软骨缺损的长期疗效观察

[目的]对关节软骨源性多孔支架复合自体软骨细胞复合体修复兔膝关节软骨缺损的长期效果进行观察和评价。[方法]实验动物新西兰大白兔共10只,分两组:(1)关节软骨源性支架对照组:缺损内置入关节软骨源性支架;(2)关节软骨源性支架复合细胞组:缺损内置入关节软骨源性支架-自体软骨细胞复合体。手术后15个月取材做大体摄像,甲醛固定、10%EDTA脱钙,石蜡切片,采用四种组织化学染色法(HE、奥新兰(AB)、甲苯胺兰(TO)、藩红花"O"染色)和Ⅱ型胶原免疫组化染色,观察修复后的兔关节软骨组织细胞形态特征。[结果]关节软骨源性支架对照组,大体观察关节表面有凹陷。石蜡切片HE染色见未修复缺损处为梭形细胞,纤维软骨,缺损处AB、甲苯胺兰、藩红花"O"染色为阴性,Ⅱ型胶原染色为阳性;关节软骨源性支架复合细胞组,大体见关节软骨表面修复平整、光滑。常规HE染色镜下见软骨全层修复良好,为透明软骨细胞,可见软骨陷窝潮线排列结构。细胞外基质特染:AB、甲苯胺兰、藩红花"O",Ⅱ型胶原特种染色均为阳性。[结论]组织学观察结果发现,关节软骨源性支架组为纤维软骨组织结构,未能完全修复膝关节软骨缺损;而关节软骨源性支架复合细胞组关节软骨缺损修复良好,未见退变,具有软骨组织的特征。     

人负重关节软骨细胞的体外分离与培养

目的　研究人负重关节软骨细胞的分离培养技术。方法　对 10例手术切除的负重关节软骨进行0 2 %Ⅱ型胶原酶分离、10 %DMEM中培养 ,观察软骨细胞获得率、贴壁率、增殖状况及形态学改变。结果　① 0 2 %Ⅱ型胶原酶消化尽 2 0 0～ 70 0mg软骨标本需 4～ 14h ,细胞获得率 (1 82± 0 5 7)× 10 6/g ,存活率(79 4± 9 9) %。②细胞可传 6～ 12代 ,前 4代培养时间平均 (33± 10 )d ,生长倍数平均 198倍 ,倍增时间(4 13± 1 34)d。③第 3、4代细胞呈多角形、部分梭形 ,8、9代后细胞梭状铺平。结论　 30 0～ 5 0 0mg软骨标本 ,经该方法培养 3～ 4周后可达第 4代 ,细胞数可达 (0 6～ 1 0 )× 10 8个 ,可满足临床上修复 15～ 2 5cm2软骨缺损的需要。     

间充质干细胞体外诱导生成软骨细胞的研究进展

<正>关节软骨是一种特殊的结缔组织,具有连接、支持、分散应力、减小振荡等功能。关节软骨缺损通常由创伤及关节炎等原因引起,是一种常见的骨科疾病,由于软骨组织无血管、神经和淋巴管,同时软骨细胞代谢率低,加之在基质纤维网中的增生和迁移受限。     

兔胚胎关节软骨细胞体外培养的研究

目的 探讨兔胚胎软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 对孕4周兔胚胎关节软骨用酶消化法分离培养细胞。观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学改变。结果 兔胚胎软骨细胞可从胚胎软骨组织中消化分离出来，经鉴定具有软骨细胞的特性。原代兔胚软骨细胞存活率达97％以上，细胞贴壁率达80％以上，从原代到第4代都有高增殖力，到第8代时增殖力降低。到第12代时几乎丧失细胞增殖。结论 体外培养的胚胎软骨细胞前4代适合于作修复关节软骨缺损的组织工程细胞。     

关节软骨细胞移植及其生物学行为体外调控研究

自体软骨细胞移植是美国FDA批准的关节软骨缺损修复的组织工程方法。本文就其临床应用、体外培养方面的研究作一综述。     

EGF和IGF对体外培养兔关节软骨细胞的影响

目的　了解表皮生长因子 (EGF)和胰岛素样生长因子 (IGF)对体外培养兔关节软骨细胞存活数目和分裂增殖百分数的影响。方法　体外培养兔关节软骨细胞传至第 2代 ,分别以EGF、IGF ,以及二者不同的浓度组合作用于软骨细胞。通过酶联免疫检测仪 (MTT)测定软骨细胞存活数 ,流式细胞仪测定软骨细胞分裂增殖百分数。结果　不同浓度EGF对兔关节软骨细胞存活和分裂增殖均有促进作用 ,作用浓度强度次序为 :10ng/ml>0 1ng/ml>10 0ng/ml。不同浓度IGF对兔关节软骨细胞的存活和分裂增殖均有较强促进作用 ,浓度为 5 0ng/ml时 ,刺激效果最显著。EGF与IGF联合使用时 ,刺激效果优于任何一种因子单独使用 ,而以EGF 10ng/ml和IGF 5 0ng/ml为最佳浓度组合。 结论　EGF和IGF都可促进兔关节软骨细胞存活和分裂增殖 ,但以协同作用效果最佳。     

关节软骨细胞的凋亡

细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD),为Kerr于1972年首次描述,是一种不同于坏死的细胞死亡方式.通常认为导致细胞凋亡的程序(即自杀程序)事先就装配在细胞中,如该程序在机体的内、外因素作用下被启动,细胞凋亡即开始发生.     

Time-dependent aggrecan gene expression of articular chondrocytes in response to hyperosmotic loading

OBJECTIVE: To investigate the effects of increasing extracellular osmolality on aggrecan gene expression and cell size in cultured chondrocytes. DESIGN: Aggrecan promoter activity and mRNA levels were measured in bovine monolayer chondrocytes subjected to hyperosmotic loading for different time periods, using transient transfection assays or RT-PCR. Cell size changes were also determined using an epifluorescence microscopy system. RESULTS: Hyperosmotic loading for 24 h suppressed aggrecan promoter activity and mRNA levels approximately two-fold. However no suppression of promoter activity was observed when exon 1 was deleted from the human aggrecan promoter construct. Osmotic regulation of aggrecan gene expression was time-dependent and found to correlate with cell shrinking and swelling. No suppression in promoter activity was observed when the hyperosmotic stimulus was applied in a cyclic manner, or when serum was present in the culture medium. CONCLUSION: Hyperosmotic loading regulates aggrecan gene expression and cell size in isolated chondrocytes. Osmotic regulation of gene expression is also affected by the time-varying nature of loading and the presence of serum.     

Species differences in cell culture of mammalian articular chondrocytes

Summary Articular chondrocytes from eight mammalian species (rabbit, opossum, woodchuck, cat, dog, sheep, rhesus and cebus monkeys) were grown in monolayer culture using a single regimen. The animals were immature or young adult. ham's F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum was employed for the primary cultures and Dulbecco-Vogt medium, for the secondary. Marked species differences were found with respect to cell morphology, growth in primary and secondary cultures, incorporation of radiosulfate into macromolecules, adhesion to the flask surface, response to vitamin C, and chondroid expression in spinner bottles. Under these particular conditions, rabbit chondrocytes grew most rapidly and incorporated several times more sulfate than did the others. Additional experiments carried out with other media on four of the species indicate that optimal conditions for culturing mammalian chondrocytes must be determined for each species individually.     

胶原/羟基磷灰石支架负载软骨细胞修复兔膝关节骨软骨缺损

目的 探讨胶原复合梯度羟基磷灰石(Col/HA)双相支架负载软骨细胞修复兔膝关节骨软骨缺损的可行性及疗效.方法 构建Col/HA双相支架,将软骨细胞种植于支架培养1周,再将软骨细胞-支架复合体移植修复兔膝关节股骨髁的骨软骨缺损,并对骨软骨缺损的修复进行检测.结果 光镜及扫描电镜观察显示软骨细胞在Col/HA支架中贴附良好,表型维持稳定,分泌胞外基质.大体观察和组织学检测显示,植入体内16周后实验组软骨层呈透明软骨样修复,软骨下骨缺损有新骨构建;对照组骨软骨缺损修复不良,组织学检测以纤维性组织或纤维软骨组织形成.Wakitani评分显示实验组修复组织优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 双相Col/HA复合支架可作为骨软骨组织工程支架,负载软骨细胞可修复兔膝关节骨软骨缺损,重建关节软骨的结构和功能.     

胶原海绵与兔软骨细胞体外三维培养的实验研究

目的 观察用人胎盘Ⅰ型胶原海绵作为兔软骨细胞体外三维培养支架时，软骨细胞形态学特征和功能及该支架的吸附性和组织相容性。方法 将新生兔原代和传代软骨细胞接种于人胎盘Ⅰ型胶原海绵进行体外培养，用光镜和扫描电镜观察细胞形态和结构及支架的吸附性和组织相容性，用免疫组化观察细胞Ⅱ型胶原合成。结果 以胶原海绵作为支架的传代软骨细胞能维持其形态学特征及细胞功能，该支架有较好的吸附性和组织相容性。结论 人胎盘Ⅰ型胶原海绵可作为软骨细胞体外三维培养较好的支架材料。     

生长因子对成人关节软骨细胞的促增殖作用

目的观察不同生长因子对成人关节软骨细胞（adult human articular chondrocytes，AHAC）增殖的影响，探索AHAC体外大量扩增的方法。方法以酶消化法从成人关节软骨分离细胞，条件培养基培养；传2代细胞分别用不同浓度成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）、转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、血小板衍生因子bb（platelet derived growth factor-bb，PDGF-hb）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）或其不同组合作用。用MTT法比较细胞增殖情况，用组化和免疫组化检测观察细胞表型变化。结果FGF-2、TGF—β1、PDGF—bb、HGF均有促AHAC增殖的作用，其最大效应剂量分别是50ng/ml、1ng／ml、1ng／ml、20ng／ml。5ng／ml FGF-2＋1ng/ml TGF-β1有最强的促增殖作用，继续加用PDGF—bb和（或）HGF无进一步促进作用；用这一因子组合培养AHAC，可以传10代以上，细胞扩增2000倍以上，且传9代细胞仍弱表达Ⅱ型胶原和aggrecan。结论FGF-2、TGF-β1、PDGF—bb、HGF均对AHAC有一定的促增殖作用；5ng／ml FGF-2＋1ng/ml TGF-β1有最大的促增殖效应，细胞短期内大量扩增，且在大量扩增的同时维持了一定的软骨细胞表型，因此是合适的AHAC体外大量扩增促进剂。     

三步酶消化法高效分离兔原代关节软骨细胞及体外培养观察

目的　观察设计的三步酶消化法分离原代关节软骨细胞的效果,并对体外培养不同代次细胞的生物学活性进行评价。方法　三步酶消化法设计为以培养液配制的1g/L胰蛋白酶及1g/LEDTA混合液、1g/L透明质酸酶和2g/LⅠ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞收获效率和存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长及胞外基质中Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化。结果　(1)关节软骨经三步酶消化基质逐步解离和降解,细胞得以完全释放和分离,每克软骨的细胞收获量平均为50 3×106 个细胞,细胞存活率平均为98. 8%。(2)原代和第一代细胞附壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均呈阳性,原代细胞外基质有高的硫酸糖胺多糖含量为(92±10)μg/cm2;第三代后细胞逐渐变为梭形,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性,甲苯胺蓝异染反应明显减弱,第四代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量为(48±12)μg/cm2。结论　(1)三步酶消化法可使关节软骨基质完全消化降解,具有高细胞收获率、高细胞存活率和操作简便等特点。(2)原代和第一代软骨细胞具有良好的生物学活性,而第三代以后的细胞生物学活性低下。     

Chondroitin sulphate impedes the migration of a sub-population of articular cartilage chondrocytes

OBJECTIVE: To determine whether chondroitin sulphate (CS) impedes the migration of primary articular chondrocytes. DESIGN: Articular chondrocytes were isolated from young and skeletally mature bovine animals. Boyden chambers were used to quantify chondrocyte migration on aggrecan in the presence and absence of CS chains. A novel in vitro model of cell migration into articular cartilage explants was designed to visualise and quantify the migration of labelled chondrocytes into cartilage matrix which had been treated with chondroitinase ABC to remove CS chains present. RESULTS: A consistent trend of increased migration with both age groups of a sub-population of chondrocytes was demonstrated on aggrecan in the absence of CS. These data were supported by results from the in vitro model of chondrocyte migration which demonstrated increasing numbers of a chondrocyte sub-population from both age groups of cartilage migrating into the chondroitinase ABC digested cartilage explants with time in culture. Minimal migration of these chondrocytes was demonstrated into phosphate buffered saline (PBS) treated control explants. CONCLUSIONS: We confirm that a sub-population of chondrocytes isolated from both young and skeletally mature articular cartilages have the ability to migrate. We also demonstrate that CS chains inhibit the migration of these articular chondrocytes and that their removal by chondroitinase ABC digestion enhances the migration of these chondrocytes. Such findings may provide a clinical application for improving cell-based cartilage repair strategies by enhancing integration between endogenous and repair tissue.