遗传性凝血因子缺陷症的基因诊断

正常人体凝血和抗凝血的平衡是维持凝血生理状态的重要机制,凝血因子基因缺陷会导致相应的出血性疾病。本文就遗传性凝血因子(纤维蛋白原、凝血酶原、因子Ⅴ、因子Ⅶ、因子Ⅷ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、因子Ⅺ和因子ⅩⅢ)缺陷症,结合我们的研究结果作一简述。     

遗传性易栓症相关抗凝因子的研究进展

易栓症可定义为血栓形成的倾向性增高,主要由于凝血系统和抗凝血系统两方面因素造成。易栓症分为遗传性易栓症与获得性易栓症。现就遗传性易栓症的相关抗凝因子进行研究,从分子生物学水平上对抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、蛋白C(PC)、蛋白S(PS)缺陷的病理机制、疾病的诊断及其相应的实验室检查予以综述。同时,结合近年来相关国内外研究报道提出两个观点:①遗传性AT-Ⅲ、PC、PS缺陷在东西方人群的分布可能存在较大差异;②遗传性易栓症患者中存在联合缺陷。     

抗凝因子测定影响因素的探讨

本文观察了不同温度，不同时间，不同采血条件对保存的血浆中抗凝血酶－Ⅲ，蛋白Ｃ，收白Ｓ的活性影响。结果显示蛋白活性最不稳定，在３２℃条件下，硅化管与普通玻璃管保存血浆２４小时其活性分别于相当于即刻的５５％和４２％，在室温，冰箱硅化管与玻璃管保存２４ｈ，则分别为９％和５６％，７６％，８０％，８７％和８７％。     

V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C与脑静脉窦血栓抗凝有效性相关性分析

目的: 分析V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C低下与脑静脉窦血栓行抗凝治疗有效性的关系。方法: 选取2017年5月至2022年2月蚌埠市第三人民医院收治的脑静脉窦血栓的103例患者为研究对象,根据DNA检测及酶联免疫吸附沉淀检测判定患者是否存在V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C水平,分别以单纯V因子突变为观察A组33例,单纯蛋白S、蛋白C低下为观察B组34例,无V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C低下为对照组36例,记录三组在给予抗凝治疗的第3、7、15 d的血栓弹力图参数及INR、APTT的水平,研究比较V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C与脑静脉窦血栓抗凝有效性的关系。结果: 观察A组在抗凝治疗第3、7、15 d时凝血反应时间(R)延长水平不明显、血凝块形成速率(K)延长水平不明显、最大血凝块强度(MA)减少水平不明显及凝血功能指标INR升高水平不明显、APTT延长水平不明显,与对照组及观察B组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05),而观察B组仅在抗凝治疗3 d R延长水平、K延长水平与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),观察B组在抗凝治疗第7、15 d时R延长水平明显、K延长水平明显、MA减少水平明显及INR升高水平明显、APTT延长水平明显,但和对照组相比,两者差异无统计学意义(P＞0.05)。结论: 对于V因子Leiden突变的脑静脉窦血栓的患者行抗凝治疗效果较差,对于蛋白S、蛋白C低下的患者行抗凝治疗效果较好,对于无V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C低下的患者抗凝治疗效果最好,V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C低下与脑静脉窦血栓的抗凝有效性存在相关性。     

中国汉族人群的遗传性活化蛋白C抵抗症遗传特点观察

目的:研究中国汉族遗传性易栓症家系的遗传基础,探索汉族人群的遗传性活化蛋白C抵抗(Resistance ofactivated protein C,APCR)症遗传特点。方法:通过临床检查和家系调查,分析该家系发病的分子基础。结果:易栓症相关基因(FV)第10号外显子均不存在FVLeiden突变。但发现存在FVrs6020A-G纯合突变。结论:该遗传性APCR症家系中排除了FVLeiden突变,提示APCR存在遗传异质性;发现了FVrs6020A-G纯合突变,提示在中国汉族人群中存在与APCR相关新的FV基因突变。     

一个遗传性蛋白C缺陷症家系表型与基因突变分析

目的：对一个遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系进行实验室表型检测和基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法：对先证者及其家系成员（共3代6人）进行血浆蛋白C活性（PC:A）、蛋白C抗原（PC:Ag）含量及其他相关凝血指标检测。采用DNA直接测序法分析先证者蛋白C基因（PROC）9个外显子及侧翼序列,发现突变位点,再对其家系成员进行该位点的突变检测。用ClustalX-2.1-win软件分析氨基酸突变位点的保守性;用PolyPhen-2在线生物信息学软件分析突变对蛋白质功能的危害程度;用Swiss-PdbViewer软件和PIC程序进行蛋白模型分析。结果：先证者、其儿子和二姐的血浆PC:A与PC:Ag均平行下降,介于39%～58%。这3人的PROC基因第9外显子携带c.997G＞A杂合错义突变（p.Ala291Thr）。生物信息学软件分析提示：p.Ala291Thr为有害突变;Ala291在同源物种间不高度保守;蛋白模型分析显示：p.Ala291Thr突变导致Thr291与Pro327之间新增一氢键,改变了氨基酸的空间构型,使PC的稳定性下降。结论：该先证者PROC基因第9外显子存在c.997G＞A杂合错义突变,导致p.Ala291Thr;p.Ala291Thr为未报道过的新突变,是该家系遗传性PC缺陷症的主要原因。     

遗传性凝血因子XIII缺陷症分子机制的研究

目的 研究两种遗传性凝血因子(FXIII)A基因的缺陷(FXIIIA Arg77→Cys,Ser413→Trp)以了解其致病的分子机制。方法 构建正常人FXIIIA重组表达质粒(wt-PCI／FXIIIA),通过定点突变获得上述2种突变的FXIIIA重组表达质粒(mut-PCI／FXIIIA),并分别将它们转染到COS7细胞表达,PCR、RT-PCR和Western印迹检测转染细胞中人FXIIIA的DNA水平、RNA水平及其蛋白质的表达量。用脉冲追踪试验追踪人FXIIIA蛋白在细胞内的变化。通过生物素化戊胺的掺入检测细胞内、外人FXIIIA的活性。结果 wt-PCI／FXIIIA和mut-PCI／FXIIIA稳定转染的COS7细胞内FXIIIA在RNA水平表达量相同;而两种mut-PCI／FXIIIA转染的细胞内未检测到人FXIIIA蛋白质,且蛋白活性Ser413→Trp突变者仅为正常的8．7％,Arg77→Cys突变者则为0％。用脉冲追踪法显示正常FXIIIA蛋白质各时间点含量无减少,而两种突变的人FXIIIA在0．5h和1h虽存在,但很快消失。结论 两种FXIIIlA基因突变导致FXIIIA在细胞内不稳定,迅速被降解,从而FXIIIA蛋白量减少和活性丧失。     

抗凝血酶基因C2757T杂合突变致Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症

遗传性抗凝血酶(antithrombin,AT)缺陷症是由AT基因突变引起,可分2型：Ⅰ型主要表现为AT抗原(AT：Ag)和活性(AT：A)水平的同步减低,Ⅱ型由AT结构异常所致。国外已报道300余例,基因突变种类超过130种;但国内仅我们报道过1例。本文对另一个AT缺陷症家系进行研究。发现此家系为Ⅰ型遗传性AT缺陷症,由AT基因C2757T杂合突变引起。     

遗传性乳酸脱氢酶缺陷症1例

男,2天。因哭声弱1天以新生儿败血症由婴儿室转入小儿科。患儿系第八胎第八产,出生后哭声洪亮,翌日哭声小,不吃不哭不动,强刺激后无反应,伴口吐白沫,口周青,面色变黄,尿少,已排胎便。患儿长兄3人均于生后第三天天折,生后症状与本患儿相同。其姐三人均健在,父母健康,非近亲婚配。     

新型口服抗凝药物在遗传性易栓症中的应用

遗传性易栓症的主要临床表现为静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism, VTE）,因此抗凝治疗在遗传性易栓症患者血栓形成的防治管理中至关重要。传统的抗凝药物肝素以及维生素K拮抗剂（华法林）等在使用过程中也存在一定的局限性：如给药途径不便利、需要频繁监测等,影响长期用药的依从性。新型口服抗凝药物（novel oral anticoagulants, NOACs）目前已广泛用于血栓性疾病的预防和治疗,在临床试验和真实世界应用中展示出其独有的优势。然而NOACs应用于遗传性易栓症这一特殊人群的研究和报道相对较少,关注程度较为缺乏。本文总结了NOACs的基本特点及其优势与劣势,以及应用于遗传性易栓症患者抗凝治疗的安全性及有效性,评述其临床应用价值。     

蛋白C p.Ala333Thr突变引起遗传性蛋白C缺陷症的分子机制

目的：探讨蛋白C（PC）p.Ala333Thr突变导致遗传性蛋白C缺陷症（IPCD）的分子机制。方法：使用氨基酸多序列比对工具T-Coffee评估突变氨基酸位点的保守性,使用突变有害性评分工具PolyPhen-2预测突变对PC结构和功能的危害性。利用定点突变试剂盒QuickMutationTM构建PC基因（PROC ）野生型和p.Ala333Thr突变型质粒,并瞬时转染入HEK-293T细胞进行体外表达,RT-qPCR检测突变PC转录24 h后的mRNA水平变化,利用蛋白印迹法（Western blot）和ELISA分别检测突变PC胞内外水平变化,并对细胞内质网、高尔基体PC进行免疫荧光染色,初步探讨p.Ala333Thr突变导致IPCD的分子机制。结果：多序列比对结果显示PC的Ala333位点保守性不高,PolyPhen-2对PROC 的p.Ala333Thr突变评分为0.763。成功转染野生型与p.Ala333Thr突变型PROC 质粒后,突变型PROC 转录水平无明显变化;Western blot结果显示,突变型PROC的PC表达量明显下降;免疫荧光染色结果显示,野生型PC在内质网和高尔基体均有大量分布,而p.Ala333Thr突变型PC主要分布于内质网。结论：PROC p.Ala333Thr突变可能导致了PC的错误折叠和加工障碍,造成胞外PC表达量下降,最终引起了IPCD的发生。     

蛋白C基因C5498T致Ⅰ型遗传性蛋白质C缺陷症

目的 对一个遗传性Ⅰ型蛋白C(PC)缺陷症家系进行基因突变的检测。方法 分别用ELISA和发色底物法测定血浆蛋白Ｃ活性和抗原。用PCR法对先证者PC基因的9个外显子及其侧翼、内含子2序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。突变位点经限制性内切酶分析证实。结果先证者的蛋白C活性和抗原分别为26％和1．43g／L。先证者表现为PＣ基因外显子3区杂合错义突变Ｃ5498T,引起Arg15→Ｔrp。在基因启动子区存在2405C／T、2418A／G、2583A／T多态性。结论 该突变导致遗传性Ⅰ型PC缺陷症。     

一个遗传性出血性毛细血管扩张症家系的临床和基因诊断

目的：探讨一个遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia,HHT)家系的临床特征 及基因诊断的可行性。方法：收集先证者及家系成员的病史资料并进行临床诊断。同时,对先证者进行致病基因突 变检测;鉴定出可能致病性变异后,对家系成员进行特定致病基因突变检测及基因诊断。结果：该家系中4代有5例 个体以鼻衄为突出临床表现。先证者临床诊断为HHT;2例在世家系成员为临床疑诊个体。ENG(endoglin)基因5'非编 码区c.1-127C>T突变见于先证者和2例临床疑诊个体,未见于其他家系成员;综合临床与基因突变分析2例临床疑诊个 体确诊为HHT。结论：HHT临床表现个体差异大,ENG基因c.1-127C>T突变是此HHT家系的可能致病性变异。临床 与基因诊断相结合可提高HHT的诊治水平。     

蛋白C P275S突变导致遗传性蛋白C缺陷症的分子机制研究

目的研究蛋白C（PC）基因P275S突变导致遗传性PC缺陷症的分子机制。方法构建PC基因野生型和P275S突变型表达质粒,并瞬时转染HEK293T细胞和COS 7细胞进行体外表达。ELISA检测转染细胞上清液和细胞裂解液的PC抗原;实时荧光RT-PCR（real time,RT-PCR）检测转染细胞PC mRNA表达量的改变;细胞免疫荧光染色检测PC在内质网和高尔基体内的分布。结果转染细胞上清液和细胞裂解液中的PC P275S抗原分别为野生型PC抗原的22.6%和78.9%;实时RT-PCR结果显示,与野生型PC相比,PC P275S突变体在mRNA水平没有减少;细胞免疫荧光染色显示,野生型PC蛋白在内质网和高尔基体中均有大量分布,而PC P275S突变蛋白主要位于内质网中。结论分泌障碍和细胞内降解是PC P275S导致PC缺陷症的原因。     

肺血栓栓塞症患者抗凝系统变化的研究

[目的]探讨肺血栓栓塞症(PTE)患者抗凝系统的变化及其对诊断的价值。[方法]选取35例确诊的急性PTE患者和30例正常人为研究对象,分别测定血浆抗凝血酶Ⅲ活性(AT-Ⅲ)、蛋白C(PC)活性、蛋白S(PS)活性。[结果]PTE患者血浆中抗凝血酶Ⅲ活性,蛋白C活性及蛋白S活性均显著低于对照组(P<0.05);这些指标在单纯PTE组和PTE 深静脉血栓形成(DVT)组间无统计学意义;吸烟对其影响不大。[结论]PTE患者存在抗凝系统活性减低;部分患者可能存在抗凝血系统的缺陷;这些指标对于PTE的诊断有一定价值。     

一个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型与基因突变分析

目的：对一例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者及其家系成员进行凝血指标和基因表型分析,初步探讨其分子发病机制。方法：在Stago仪器上检测家系各成员外周血的血浆AT活性（AT:A）、AT抗原（AT:Ag）等凝血指标;提取外周血DNA并测序,定位基因突变位点;利用生物信息学软件分析突变对蛋白功能的影响。结果：先证者及其外祖母、父亲、母亲和弟弟的AT:A均有不同程度降低,且AT:Ag同步下降,所有家系成员蛋白S活性（PS:A）和蛋白C活性（PC:A）指标均无明显异常,表现为I型AT缺陷症。基因分析显示：先证者SERPINC1 基因存在第1号外显子c.1A＞G杂合错义突变（p.Tyr2stop）以及第5号外显子c.1005G＞A杂合同义突变;其父亲携带c.1A＞G杂合错义突变,其外婆、母亲和弟弟携带c.1005G＞A杂合同义突变。保守性分析显示,Tyr2在同源物种间高度保守;MutationTaster、PolyPhen-2和LRT三个在线生物信息学软件分析均显示p.Tyr2stop突变为“致病的、有害的”;蛋白模型分析显示,p.Tyr2stop突变会引起AT基因翻译过程提前终止,产生截短蛋白。结论：该先证者及家系成员AT:A和AT:Ag不同程度降低与SERPINC1 基因上存在的c.1A＞G杂合错义突变和c.1005G＞A杂合同义突变有关。     

同一等位基因复合杂合突变导致Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症

目的对1例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断。方法采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员的AT抗原（AT：Ag）和AT活性（AT：A）,抽提外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因（SERPINC1）7个外显子及其侧翼序列,应用直接测序法对先证者进行AT基因序列分析。针对先证者中发现的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测,同时在100例正常人中筛查以排除多态性。结果先证者AT：Ag和AT：A分别为114 mg/L和54.8%。其AT基因外显子2区发现了2个杂合点突变,分别为c.134G〉A和c.342T〉G。其家系部分成员检测到相应的杂合突变。家系遗传分析表明,2个杂合突变位于同一等位基因。结论同一等位基因复合杂合突变是导致该家系Ⅰ型遗传性AT缺陷症的分子原因。     

伴Leiden V因子突变和狼疮抗凝物的恶性萎缩性丘疹病（Degos病）死亡1例

恶性萎缩性丘疹病（Degos病）是一类非常罕见的疾病，其皮损特点是萎缩性丘疹和多种系统症状。作者描述了1例33岁的男性患者，其表现为泛发性皮损，与恶性萎缩性丘疹病的体征一致。患者病程中甚至发生阴茎溃疡，此症状以往仅有少数报道。患者发病2．5年后死于小肠复穿孔。实验室检查显示Leide nV因子突变和狼疮抗凝物的出现，但未发现抗心肌磷脂抗体。患者先后接受了窄波紫外线（UV）、强的松龙和阿司匹林、己酮可可碱、华法林的治疗。尽管接受了这种强抗凝血和抗血小板治疗，患者皮损和系统症状仍未得到改善。     

113例静脉血栓栓塞症患者遗传性抗凝蛋白缺陷分析

目的 探讨静脉血栓栓塞症(VTE)患者的遗传性抗凝蛋白缺陷及其临床特点.方法 选取2019年6月至2020年4月温州医科大学附属第一医院收治的无明显诱因VTE患者113例,检测患者3种抗凝蛋白即蛋白C(PC)、蛋白S(PS)及抗凝血酶(AT)活性并计算缺陷发生率,分析临床表现特点.采用DNA测序法进行相关基因突变的分析...