对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM-CSF基因转染

目的探讨小鼠粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(mGM-CSF)基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果.方法应用脂质体将含有mGM-CSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞,经G418加压筛选后,挑选表达mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞.观察转导或未转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移.结果转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGM-CSF,在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组,二者差异显著(n=5,125.8±34.3vs27.8±24.0,P<0.01).结论mGM-CSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移,提示GM-CSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景.     

阳离子脂质体介导粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子基因转染的黑色素瘤细胞作瘤苗的研究

目的 本研究拟探讨采用阳离子脂质体介导的鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子基因转染的B16F1细胞作为瘤苗的抗肿瘤效果.方法 阳离子脂质体复合mGMCSF DNA转染B16F1细胞,ELISA法检测mGMCSF在B16F1中的表达.[3HTdR]掺入法分析B16F1分泌的mGMCSF生物活性.γ射线照射灭活基因修饰的B16F1细胞皮下免疫小鼠,ELISA分析小鼠血清中的mGMCSF水平.7d后免疫鼠皮下攻击未修饰的B16F1细胞以检测瘤苗在小鼠体内的抗肿瘤效果.51Cr释放实验检测免疫鼠抗B16F1的特异CTL反应.结果 阳离子脂质体介导mGMCSF基因转染B16F1细胞后,未经阳性克隆筛选,mGMCSF得到特异且具有生物学活性的表达.但表达逐步下降由第1天的(135.5±21.1)μg/L下降到第5d的(47.8±5.3)μg/L.随γ射线照射剂量的增加,mGMCSF的表达逐步降低,但仍具有生物学活性.γ射线照射的5×105基因修饰B16F1接种小鼠后,鼠血清中的mGMCSF水平在4h时为(198.4±23.1)ng/L,攻击的B16F1细胞在接种瘤苗的小鼠体内的生长完全被抑制,51Cr释放实验结果显示该瘤苗在小鼠体内诱导了特异的CTL反应.结论 本研究表明阳离子脂质体作为基因载体介导鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子基因转染的黑色素瘤B16F1细胞,作为瘤苗在小鼠体内可有效地激发抗肿瘤免疫.     

基因转移载体脂质体和重组腺病毒介导碱性磷酸酶基因在B16F1细胞中的表达比较

目的：探讨两种基因转移载体脂质体转染的和重组腺病毒收集并转导的SEAP基因在B16F1细胞中的表达动态。方法：脂质体和质粒DNA复合后，转染10^6 B16F1细胞，连续5d收集并换细胞培养液，并检测其中的SEAP酶活性，将重组腺病毒以1000m.o.i,2000m.o,i,3000m.o.i,4000m.o.i接种B16F1细胞，连续5d收集并换细胞培养液，并检测其中SEAP的含量，结果：随着时间的推移，脂质体转染的SEAP的表达逐渐下降，由第1天的821．6μUmit/ml下降到第5天的275．2μUnit/ml，腺病毒转导的SEAP的表达却是逐渐上升，并随接种毒量的增加而上升，且第三，四天表达达最高后，能保持较稳定的水平，接种4000m.o.i组，SEAP的表达由第1天的93．9μUnit/ml上升到第3天1281.1μUnit/ml，到第5天仍为1240．4μUnit/ml，结论：脂质体和重组腺病毒作为不同的基因转移载体都能有效地介导外源基因的转移入靶细胞，并使外源基因在靶细胞内获得有效地表达，但表达的动态过程完全不同。     

肿瘤抗原P1A与细胞因子mGM-CSF共表达载体的构建和表达

目的：构建并鉴定细胞因子mGM-CSF和肿瘤特异抗原PIA共表达载体，为研究新型的肿瘤疫苗提供新的策略。方法：以PCR方法从pCI-neo／PIA中扩增出PIA编码基因片段，构建于pRSC质粒上；再从pORF-mGM-CSF中扩增出mGM-CSF基因片段．插入pRS-PIA重组质粒PIA基因的上游。以酶切和DNA测序进行鉴定。并将鉴定过的重组质粒以脂质体法转染7721细胞．用RT-PCR法鉴定转染细胞中PIA基因和mGM-CSF基因的表达。结果：经酶切鉴定和DNA测序证实mGM-CS17和PIA重组质粒构建正确，并在转染此质粒的7721细胞中检测出了PIA和mGM-CSF基因的表达。结论：成功构建mGM-CSF和PIA的共表达载体，为研制新型肿瘤疫苗奠定了基础。     

pEGFP-IL-24对B16F0细胞抑制效应的实验研究

目的:构建IL-24真核表达质粒,研究其体内外表达对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-IL-24。用脂质体法将重组质粒及空载体体外转染B16F0细胞后,经激光扫描共聚焦显微镜观察其表达,用MTT法检测B16F0细胞的体外增殖能力。用小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤生长的抑制。结果:pEGFP-IL-24转染B16F0细胞后,LSM可观察到其表达。IL-24基因转染的B16F0细胞体外增殖能力明显受到抑制。转染IL-24的B16F0细胞体内致瘤率降低。结论:IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。IL-24基因转染的肿瘤细胞体内生长能力显著降低。     

pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达

目的：克隆小鼠分泌型Hemopexin (sPEX) 编码区的cDNA序列,构建含Egr-1启动子的pEgr-sPEX真核表达载体,检测辐射诱导重组质粒在B16F10细胞中的表达。 方法：用RT-PCR从NIH3T3细胞中扩增出sPEX,经测序证实后,构建pEgr-sPEX重组质粒,以脂质体转染B16F10细胞,用Western blotting方法检测B16F10细胞上清中辐射诱导PEX的表达。 结果：测序表明扩增的sPEX cDNA序列与GenBank中登录的序列完全一致,sPEX cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1-Egr-1,转染入B16F10细胞内PEX基因在体外辐射诱导下成功获得表达。结论：成功地克隆了小鼠sPEX基因,并在体外证实了pEgr-sPEX具有辐射诱导表达特性。     

IL-24对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑制作用

[目的]研究携带IL-24基因的真核表达质粒对小鼠黑色素瘤B16细胞的凋亡和体外增殖的影响.[方法]采用重组DNA技术构建含有IL-24基因的真核表达质粒pEGFP-N1-IL-24,用脂质体法将pEGFP-N1-IL-24转染B16细胞,用荧光显微镜观察其表达,在生物显微镜下观察细胞的形态学变化,用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）法检测细胞凋亡,用MTT比色法检测B16细胞的体外增殖能力.[结果]荧光显微镜下观察到pEGFP-N1-IL-24可在B16细胞中表达;生物显微镜下显示转染IL-24基因的B16细胞皱缩、成团;AO/EB法检测显示转染IL-24的B16细胞核染色质着橘黄色或橙红色,并呈固缩状;MTT比色法显示IL-24明显抑制B16细胞的生长,与对照组相比较差异有统计学意义（P〈0.05）.[结论]外源性IL-24基因在体外对小鼠黑色素瘤B16细胞有显著的诱导凋亡和抑制增殖的作用.     

RASSF1A基因转染对人肺腺癌细胞株A549增殖的抑制作用

目的：观察外源性RASSF1A基因对人肺腺癌细胞A549增殖及NF- κB亚单位P65表达的影响。方法：利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3.0-RASSF1A质粒和空载体pcDNA3.0质粒分别导入A549细胞，经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆，Western blotting检测RASSF1A基因表达。采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法、流式细胞仪分析转染细胞的生物学行为。 RT-PCR和Western blotting检测基因转染对P65表达的影响。结果：经脂质体转染和筛选，建立了稳定表达RASSF1A基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较，转染RASSF1A基因的细胞生长速度明显减慢（P<0.05），细胞周期中G1/G0期比例明显增加（P<0.05），而S期比例减少；转染组细胞核内P65蛋白表达明显降低（P<0.05），而全细胞P65蛋白及mRNA表达未见明显变化。结论：RASSF1A基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。     

荧光定量PCR检测Kbpala/Alb-ATP7B短暂转染BRL细胞后的转录情况

[目的]明确Kbpala/Alb-ATP7B短暂转染BRL细胞后的表达情况.[方法]将Kbpala/Alb-ATP7B用阳离子脂质体Lipofect AMINETM 2000 Reagent转染BRL细胞后,按转染后不同时间点提取细胞mRNA,逆转录后,使用SYBR Green荧光定量PCR检测其表达情况.[结果]转染后4 h即可检测到外源基因的表达,48 h外源基因的表达最高,可持续7 d以上.[结论]Kbpala/Alb-ATP7B可在BRL细胞中有效表达,表明载体构建成功.     

GFP-p16融合基因表达载体在BHK HeLa细胞中荧光蛋白表达的研究

本文报道了通过脂质体转染技术将本室构建成的GFP-p16融合基因表达载体——pCp16G和pcGp16分别导入BHK、HeLa细胞中，研究它们在真核细胞中荧光蛋白的表达；结果表明，外源脂质体对BHK、HeLa等真核细胞无损伤，经斑点杂交检测证明，外源基因可以通过脂质体转染技术整合到细胞基因组中。研究结果还表明，p16基因与GFP基因的3′端连接，可以保持GFP的荧光特性，表达荧光蛋白，而与GFP基因的5′端连接，则不能表达荧光。     

脑心肌炎病毒内部核蛋白体进入位点介导白介素-12基因在B16F1细胞中的表达

目的：研究脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的鼠白介素12(mIL-12)的p40和p35双亚基基因在同一启动子的调控下能否得以有效地表达并形成异二聚体p70。方法：采用脂质体法将表达经脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的p40和p35的质粒mEL-12／AD1-1转染B16F1细胞，连续3d收集并换细胞培养液，并检测其中的mIL-12(p70)量。结果：ELISA结果显示，mIL12(p70)的表达量随着时间推移逐步下降，由第1天的15．5ng／ml逐步下降到第3天的9．3ng／ml。表明mIL-12p40和p35双亚基基因得到有效的表达并加工形成了异二聚体p70。结论：脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的双基因p40和p35在同一启动子的调控下得以同时表达。但其上游和下游的基因蛋白质翻译机制是不同的。     

Experimental study on the antitumor effect of mouse B7-1 gene

ＴｗｏｓｉｇｎａｌｔｈｅｏｒｙｆｏｒＴｃｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｕｍｏｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ［１－２］．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｆｅｃｔ...     

人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达

目的　研究人胰岛素基因在体外培养的小鼠成纤维细胞系的基因转染和表达。方法　采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞 (NIH3T3) ,转染后 72h ,经G4 18抗性筛选出阳性克隆并培养到第 2 4d ,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达 ,同时用ELASA法监测转染后 2 4d的细胞培养液的胰岛素水平。结果　转染PCMV .INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组 (P <0 .0 1)及PCMV转染组 (P <0 .0 1) ,未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论人胰岛素基因在NIH3T3细胞系的转染成功和表达说明基因治疗有望成为 1型糖尿病的重要治疗手段 ,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体。     

外源性p16基因稳定转染对喉癌细胞周期和增殖的影响

目的：探索p16基因在喉癌细胞内的表达作用及基因治疗方面的应用前景。方法：采用亚克隆技术，构建p16真核表达载体pCDNA3-p16.利用lipofectamine介导，将外源野生型p16基因导入喉癌细胞系Hep-2，筛选阳性克隆，采用打点杂交技术、免疫荧光、免疫组化、图像分析法观察和分析p16基因的表达。同时以空载体质粒pCDNA3为对照，用流式细胞仪分析瘤细胞生长周期、荧光染色检测细胞凋亡。结果：打点杂交、免疫荧光、免疫组化及图像分析法分析证实转染p16基因的Ｈep-2细胞有外源p16基因的表达，外源基因p16在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。流式细胞仪计数和免疫荧光检测证实p16能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论：导入外源野生型p16基因可抑制喉癌细胞恶性增殖。     

外源性p16基因稳定转染对胶质瘤细胞周期和增殖的影响

目的：研究外源性ｐ１６基因对胶质瘤细胞系ＳＨＧ－４４的抑制作用,探索胶质瘤基因治疗的新途径。方法：利用携带４９０ｂｐ的人ｐ１６全长ｃＤＮＡ真核表达载体,采用脂质体介导法将其导入人恶性胶质瘤细胞系ＳＨＧ－４４中,用Ｇ４１８筛选阳性克隆,以原位杂交,免疫组化方法检测ｐ１６基因在细胞转染前后的表达情况。,应用流式细胞仪,电子显微镜,生长曲线测定等方法研究ｐ１６基因对胶质瘤细胞周期,形态,生长等的影响.     

人多药耐药基因1在CHO细胞中的表达及功能研究

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的真核表达载体,转染CHO细胞,研究MDR1基因在真核细胞中的表达及功能.方法:将MDR1全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1( ),利用阳离子脂质体转染CHO细胞,RT-PCR检测MDR1转染阳性细胞,并用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,通过测定细胞对Rh123的外排作用以及对阿霉素的耐受性确定MDR1基因在正常细胞中的功能.结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-MDR1序列正确.RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该重组表达载体已在CHO细胞中有效转录并稳定表达.Rh123外排和MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-MDR1的CHO细胞对Rh123外排作用显著高于未转染的CHO细胞,并且转染后的CHO细胞对阿霉素的耐药性也有显著提高.结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药功能的细胞株,有望成为多药耐药性药物研究的细胞模型.     

外源性p16基因对人前列腺癌的作用

目的:研究外源性p16基因对人前列腺癌PC-3M细胞系生长及致瘤性的抑制作用,探索前列腺癌基因治疗的新途径.方法:利用携带约800 bp的外源性p16 cDNA的真核表达质粒,通过脂质体介导将其导入人前列腺癌PC-3M细胞系中,用G418筛选阳性克隆,经流式细胞仪及细胞生长曲线测定等方法研究p16基因对人前列腺癌细胞周期生长特性的影响,并观察导入外源性p16基因的人前列腺癌细胞PC-3M对裸鼠致瘤能力的影响.结果:野生型p16基因转染到有p16基因缺失的人前列腺癌细胞PC-3M上,细胞周期明显变化,细胞从G1期到S期发生抑制,细胞增殖活性降低.结论:转染外源性p16基因可阻止人前列腺癌细胞由G1期进入S期,并使肿瘤恶性增殖受到抑制.     

稳定高效表达p21~(WAF1/CIP1)的HCT/8-WAF1细胞株的建立

目的 :建立高效、稳定表达 p2 1 WAF1/ CIP1大肠癌细胞株 HCT/8- WAF1。方法 :应用阳离子脂质体分别将带有目的基因 WAF1的 pc DNA3及空白 pc DNA3质粒转染大肠癌细胞株 HCT/8,经G41 8进行阳性筛选 ,将筛选的阳性细胞连续传代培养 ,应用免疫荧光技术监测 p2 1 WAF1/ CIP1的表达。结果 :经 G41 8筛选后 ,空白对照细胞全部死亡 ,转染目的基因及空质粒组的细胞存活 ,可连续传代培养 30代以上 ,并选择 HCT/8作对照 ;免疫荧光技术监测 p2 1 WAF1/ CIP1表达结果显示转染目的基因的 HCT/8细胞 p2 1 WAF1/ CIP1表达阳性细胞率 ( 89.96% )显著高于转染空质粒组 ( 8.0 2 % )和空白对照组 ( 3.39% ) ( F=1 6 60 8.99,P<0 .0 0 1 ) ;各代间差异无显著性 ( F=2 .1 71 ,P>0 .0 5 )。结论 :HCT/8- WAF1是一株高效、稳定表达 p2 1 WAF1/ CIP1的大肠癌细胞株     

外源性p16基因对人原发性肝癌细胞生物学行为的影响及其机制

目的:探讨导入外源性p16cDNA真核表达载体对人原发性肝癌细胞系SMMC- 772 1生物学行为的影响及其分子机制。方法:构建外源性p16基因真核表达载体并转染SMMC- 772 1细胞,经G4 18抗性筛选和扩增,得到稳定的表达株,并经RT -PCR及免疫细胞化学鉴定。通过生长曲线,流式细胞术,免疫细胞化学及Western -Blot等实验方法,对转基因后肿瘤细胞生物学行为及细胞周期调控因子CDK4 ,CyclinD1及pRb进行观察。结果:转染外源性p16基因的SMMC- 772 1细胞有外源性p16基因的整合及表达,细胞生长速度明显减慢,倍增时间明显延长,G1期细胞明显多于转基因前(P <0 .0 5 ) ;免疫细胞化学显示外源性p16表达可下调CDK4及cylinD1的表达(P <0 .0 5 ) ,Western -Blot提示转染外源性p16基因后细胞中磷酸化pRb表达明显降低。结论:外源性p16基因导入人肝癌细胞株SMMC -772 1中可稳定表达并使细胞停滞在G1期,抑制细胞生长,其机制可能为下调CDK4、cyclinD1的表达和抑制pRb磷酸化有关。