三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较

背景:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性.以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态,但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题.目的:制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层,观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态.设计:多样本观察比较.单位:海南医学院附属医院生殖医学中心.材料:实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成.包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定.清洁级孕12.5～14.5 d的胎鼠11只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.方法:胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏,按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素C处理2.0～3.0 h后,按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层.人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上.上述两种成纤维细胞分别计数后,按1∶0,3∶1,1∶1,1∶3,0∶1比例混合,然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层.观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态,并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测.撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况.主要观察指标:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较.②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较.③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测.④体外分化实验.结果:①:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层.②:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按1∶1混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按1:3混合时无明显变化,优于其余3种混合比例.③:碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性,分别在200～300 bp和300～400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带.④:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞.?＃ 结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,两者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态.②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好.     

小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态

目的:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性.欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题,观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态.方法:实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成.①对象:包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定.清洁级孕12.5～14.5 d的胎鼠11只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素C处理2.0～3.0 h后,按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层.人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上.上述两种成纤维细胞分别计数后,按1∶0,3∶1,1∶1, 1∶3,0∶1比例混合,然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层.③实验评估:观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态.并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测.撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况.结果:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层.②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按1∶1混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按1∶3混合时无明显变化,优于其余3种混合比例.③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测:碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性,分别在200～300 bp和300~400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带.④体外分化实验:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞.结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,二者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态.②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好.     

鼠胚成纤维细胞的培养条件及滋养层制备

背景:鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理或Y射线照射阻断其有丝分裂后,铺层的细胞可保持活力但不增殖,并能够在生长过程中产生促进胚胎十细胞生长的因子和抑制胚胎干细胞分化的因子,但其生命期有限.目的:探讨分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄与培养条件,以及用其制备细胞饲养层的效果.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-11/2006-07在广东省计划生育专科医院实验室完成.材料:清洁级昆明系孕7.5,10.5,13.5,16.5,19.5 d雌鼠各5只.方法:无菌取上述各孕龄小鼠胚胎分离鼠胚成纤维细胞,调整细胞浓度为1×107L-1、1×109L-1 1×1011 L-1,胰酶消化传代.当胚胎成纤维细胞生长并相互接触时,加入丝裂霉素C作用2-4 h,用无钙无镁PBS配制的胰蛋白酶液消化2～5 min,终止后用吸管吹打皿底,使细胞充分分离,以含10%胎牛血清的DMEM液调整细胞浓度为5×108 L-1,将该悬液移入明胶处理的培养皿内常规培养,制备鼠胚成纤维细胞饲养层.主要观察指标:胎龄、细胞浓度、传代次数对鼠胚成纤维细胞生长增殖的影响.不同胎龄鼠胚成纤维细胞饲养层制备效果.结果:7.5～19.5 d鼠胚均可分离出成纤维细胞,但7.5 d.10.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞数最少,寿命短,且混有大量杂细胞:13.5d鼠胚分离所得成纤维细胞数量多,增殖快,所含杂细胞少:16.5～19.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞生长状态不良,增殖缓慢,杂细胞较多.同等条件下与1x107 L-1、1×1011 L-1浓度比较,1×109 L-1浓度的鼠胚成纤维细胞生长状况良好,铺层时间适中,细胞寿命最长(P＜0.05).以13.5 d鼠胚成纤维细胞经初代培养后传4代,成功建立了成纤维细胞株,相同条件下1～代细胞形态,体积、生长状况无明显差别.7.5～19.5 d鼠胚成纤维细胞制备的饲养层,铺层时间基本相似(P＜0.05),细胞寿命均可维持一二周.结论:分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄及细胞浓度分别为13.5d与1×109 L-1,4代以内传代次数不影响鼠胚成纤维细胞的生长增殖,且不同胎龄所制备的饲养层细胞寿命无差别.     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景:到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克降技术制造人体胚胎并提取干细胞.目的:尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成.材料:妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层.收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六_人后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养.主要观察指标:成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势.结果:光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1:4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力.小鼠囊胚孵出透明带的时间为24～72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3～5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈"鸟巢"状.组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞.结论:小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异

目的:观察不同条件对人脐血间充质干细胞培养的影响。方法:实验于2004-10/2005-10在首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。①用复方枸橼酸血液保存液和肝素钠两种不同的抗凝血剂保存的人脐带血,经密度梯度离心法分离新鲜脐带血,获取的单个核细胞,经椎虫蓝染色进行活细胞计数,比较所获得的单个核细胞数。②用不同密度1×109L-1,2×109L-1,5×109L-1接种单个核细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。用流式细胞仪检测所培养的细胞免疫表型。③分别用高糖和低糖DMEM培养液(含体积分数0.1的胎牛血清)培养单个核细胞,其他条件相同,从72h后对所形成的细胞克隆进行计数,对两种培养基形成的细胞克隆和生长状况进行比较。结果:①不同抗凝血剂抗凝的人脐带血所获得的单个核细胞数及细胞生长状态:用肝素钠抗凝血剂保存的人脐带血所获得的单个核细胞数和细胞生长状态明显优于用复方枸橼酸血液保存液保存的人脐带血(P<0.05)。②不同接种密度人脐血间充质干细胞的贴壁生长状态及人脐血间充质干细胞的免疫表型:较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞,而以5×109L-1密度接种,72h后单个核细胞开始贴壁并开始形成细胞克隆,在10d后出现梭形细胞,培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。用流式细胞仪检测所培养的细胞为非造血间充质干细胞。③两种培养基形成的细胞克隆数和生长状况:在10d以后,用低糖DMEM组培养的单个核细胞形成的细胞克隆数与高糖DMEM组相比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论:①肝素钠作为人脐带血保存液能获得大量的单个核细胞,有利于人脐血间充质干细胞的培养。②5×109L-1细胞接种密度有利于人脐血间充质干细胞贴壁生长。③用低糖DMEM作为培养人脐血间充质干细胞的培养基有利于细胞克隆的形成和维持,对保持人脐血间充质干细胞特性有良好作用。     

人脐静脉间充质干细胞体外诱导分化为神经元的可行性

目的:探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下层间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性,分析体外分离纯化、原代及传代培养的最佳条件,为神经组织修复选择理想的种子细胞来源.方法:实验于2006-04/12在辽宁医学院解剖学实验室完成.①对象:取正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由辽宁医学院附属第一医院提供,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下用1 g/LⅠ型胶原酶消化脐静脉内皮及内皮下层,收集的细胞按5×107 L-1,1×108 L-1,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1密度接种进行原代培养,待细胞80%融合时胰酶消化传代.取第2代细胞,诱导组经含有3 μmo/Lβ-巯基乙醇、20%胎牛血清的DMEM预诱导液处理后,换成含10 g/L二甲基亚砜、100 mmol/L丁化羟基茴香醚的无血清DMEM诱导液进行诱导.未诱导组将诱导液更换为无血清DMEM.③实验评估:记录原代培养过程中不同接种密度细胞贴壁所需时间.免疫细胞化学检测诱导前细胞表面抗原血管性血友病因子、CD166的表达及诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白的表达,倒置相差显微镜下计数阳性细胞分化率.结果:①不同接种密度细胞贴壁所需的原代培养时间比较:5×107 L-1组仅有1孔细胞贴壁呈克隆样生长,但培养至28 d时仍不能传代,其余培养孔均无细胞贴壁生长.与1×108 L-1组比较,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1组细胞贴壁生长的原代培养时间均明显缩短(P < 0.05),且后3组比较差异无显著性意义(P > 0.05).②贴壁细胞表面抗原检测:CD166呈阳性,血管性血友病因子呈阴性.③诱导分化:诱导组脐静脉间充质干细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达,不表达胶质纤维酸性蛋白.巢蛋白阳性细胞率为(9.5±1.2)%,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率为(15.6±2.6)%.未诱导组以上3种标志均不表达.结论:①在体外可以成功分离培养获得人脐静脉内皮及内皮下层的间充质干细胞,其原代培养细胞的种植密度以5×108 L-1～ 1×109 L-1为佳.②细胞传2代后性质相对均一,基本无造血细胞和内皮细胞污染,达到纯化目的,具有间充质干细胞特点.③在化学诱导剂β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基茴香醚联合作用下,其可以向神经元样细胞分化.     

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养

背景:小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6 小鼠与雄性M. spretus 小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提.目的:建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系.方法:从孕12.5～14.5 d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取 3～5 代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达.结果与结论:从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3～5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长.染色体核型检测 SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性.实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对 SF1-G细胞保持正常未分化状态培养.     

STO转基因小鼠饲养层细胞的最佳预处理条件

目的:为保持胚胎干细胞的高度未分化状态,饲养层细胞成为胚胎干细胞体外培养中不可缺少的条件。本实验分析STO转染白血病抑制因子小鼠饲养层细胞的最佳预处理条件。方法:实验于2006-09/2006-11在中国医科大学病理生理学教研室完成。实验材料:DMEM、FBS、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青链霉素、β-巯基乙醇、丝裂霉素C均购于美国Sigma公司;STO转染白血病抑制因子小鼠饲养层细胞和D3系小鼠胚胎干细胞由日本信州大学惠赠。实验方法:将STO转基因小鼠饲养层细胞和D3系小鼠胚胎干细胞分别培养于10%DMEM中,其中含体积分数为0.1FBS、0.1mol/L非必需氨基酸、2mol/LL-谷氨酰胺、100u/mL青链霉素、0.1mol/Lβ-巯基乙醇。向10%DMEM中加入终浓度为100u/mL的白血病抑制因子,保持D3系小鼠胚胎干细胞的未分化状态。用6,10,20,30mg/L丝裂霉素C处理STO转基因细胞,同时设置未经丝裂霉素C处理的STO转基因细胞为对照。将经丝裂霉素C处理过的各组单细胞悬液分别以6×103,7×103,8×103,9×103,1×104,2×104,3×104,4×104,5×104,6×104/cm2细胞密度接种于12孔板内,培养过夜。次日取预处理效果最佳组的STO转基因细胞作为饲养层细胞培养D3系小鼠胚胎干细胞,将D3系小鼠胚胎干细胞以1×104/cm2接种于上述经过丝裂霉素C处理过的STO转基因细胞上,观察D3系小鼠胚胎干细胞附壁、增殖情况及有无分化。结果:①丝裂霉素C对STO转基因细胞生长的影响:不同质量浓度丝裂霉素C均能抑制STO转基因细胞增殖,其中6mg/L处理组STO转基因细胞虽有增殖能力,但较对照组增殖速度明显减慢,10mg/L以上处理组细胞数量不但没有增加,反而稍有下降。②丝裂霉素C对STO转基因细胞形态的影响:6mg/L丝裂霉素C处理组STO转基因细胞形态未见明显变化;10mg/L以上丝裂霉素C处理组STO转基因细胞,随着丝裂霉素C质量浓度的增加,形态变异逐渐明显,以星形细胞和裂解大泡居多。③饲养层细胞密度对胚胎干细胞培养的影响:本实验中10mg/L丝裂霉素C处理组预处理效果最佳,取该处理组作为饲养层培养D3系小鼠胚胎干细胞。次日于显微镜下观察,以不同细胞密度接种的饲养层培养的小鼠胚胎干细胞形态无明显差异,随着饲养层细胞接种密度的增加,形成的干细胞集落逐渐增多、增大,集落细胞排列逐渐紧密,以2×104/cm2密度饲养层组最佳。随着饲养层细胞密度的继续增加,形成的干细胞集落相对减少,集落细胞排列渐疏散。结论:10mg/L丝裂霉素C作用的STO转染白血病抑制因子细胞3h即可达到较好的处理效果,适宜STO转基因小鼠饲养层细胞的接种密度为2×104/cm2。     

不同接种密度骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复大鼠桡骨缺损

背景:在构建种子细胞与载体材料的复合体时,种子细胞的接种密度是影响复合体成骨能力的一个重要因素,目前关于种子细胞的接种密度认识尚不统一.目的:构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体,观察构建复合体骨髓间充质干细胞的最适接种密度.方法:体外单层培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,以不同的细胞密度将骨髓间充质干细胞接种到异种骨基质明胶上,构建骨髓间充质干细胞,骨基质明胶复合体,通过扫描电子显微镜观察细胞在骨基质明胶中的黏附生长情况.制备SD大鼠双侧桡骨骨干5 mm节段性骨缺损模型.随机分成4组,采用骨髓间充质干细胞,骨基质明胶复合体修复骨缺损,所用的接种细胞密度分别为1×108 L-1、5×108L-1、1×109L-1、5×109L-1.各组于第2,4,8,12周取材,通过大体观察大鼠的术肢活动情况,X射线放射学、组织学,免疫组织化学等检测方法,对骨缺损的修复情况进行评价.结果与结论:4种细胞密度与骨基质明胶复合培养24 h,骨髓间充质干细胞在骨基质明胶上的黏附率随着细胞接种密度的增高而增高,当密度为1×109L-1时,黏附率最高为(76.00±2.94)%,继续增加细胞密度其黏附率反呈下降趋势.复合培养7 d,扫描电子显微镜观察结果显示,材料上均有细胞黏附生长.X射线放射学评分显示,同一组别8,12周评分均高于2周评分(P＜0.01):第4,8,12周1×109L-1组与5×109L-1组差异无显著性意义(P＞0.05),均高于其余两组(P＜0.01).组织学评分结果表明,同一组别8,12周评分均高于2周评分(P＜0.01).结果提示,在构建骨髓间充质干细胞,骨基质明胶复合体时,骨髓间充质干细胞接种密度维持在1×109L-1最佳.     

三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较

背景：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态，但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题。 目的：制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层，观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态。 设计：多样本观察比较。 单位：海南医学院附属医院生殖医学中心。 材料：实验于2006—04／2007—07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系HN—1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕12．6-14．5d的胎鼠11只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 方法：胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏，按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素c处理2．0—3．0h后，按1 × 10^8 L^-1密度接种于明胶包被的中心皿内，UPd,鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按1：0，3：1，1：1，1：3，0：1比例混合，然后以1 × 10^8 L^-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态，并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 主要观察指标：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长?     

Transplantation of embryonic kidneys

The number of kidney allotransplants performed per year is limited by the availability of human donor organs. Xenotransplantation of a vascularized organ, such as the kidney, as an alternative to allotransplantation presents formidable immunological challenges. One novel solution to this conundrum is to use embryonic kidneys taken from animal donors early during organogenesis when metanephroi can be transplanted in 'cellular' form. We and others have shown that developing embryonic kidneys (metanephroi) transplanted into the omentum of animal hosts undergo differentiation and growth in situ, become vascularized by blood vessels of host origin and exhibit excretory function. Metanephroi can be stored for up to 3 days in vitro prior to transplantation with no impairment in growth or function post-implantation. Metanephroi can be transplanted across both concordant (rat to mouse) and highly disparate/discordant (pig to rodent) xenogeneic barriers. This review summarizes experimental data relating to the transplantation of embryonic kidneys.     

胚胎干细胞与胚胎生殖细胞的生物学特性及应用前景

目的:分析胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的生物学特性、体外培养条件、周围微环境对其增殖分化的影响,了解胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的关系和应用前景。方法:应用计算机检索万方数据库2000/2007有关生殖细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞的相关研究文章,检索词:生殖细胞,胚胎干细胞,胚胎生殖细胞,并限定文章语言种类为中文;同时应用计算机检索PUBMED2000/2006相关文章,检索词:Germ Cells,Primordial germ cells,Embryonic stem cells,Embryonic Germ Cells,限定文章语言种类为“English”。对资料进行初审,纳入标准为有关生殖细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞的生物学特性、体外培养及生长抑制因子的作用等相关文章,并查找全文。主要选择基础研究类文章,无论有无对照组均纳入。结果:共检索到相关文章59篇,排除比较陈旧的文章,最后纳入38篇进行总结分析。胚胎干细胞与胚胎生殖细胞分别从附置前早期胚胎内细胞团和早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞分离克隆出来,均具有自我更新、无限增殖能力及多向分化潜能,在体外培养条件下可保持稳定的二倍体核型,诱导分化后可形成3种胚胎生殖层。饲养层细胞是人胚胎生殖细胞体外培养的必要条件,常用饲养层细胞有鼠STO细胞系、鼠胚胎成纤维细胞,体外生长所需主要细胞因子包括干细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和白血病抑制因子,然而只要在培养基中加入鼠成纤维细胞的上清液和碱性成纤维细胞生长因子,胚胎干细胞可在无饲养层的条件下进行体外培养。结论:胚胎干细胞和胚胎生殖细胞具有相似的增殖特性,一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有功能细胞,并可相互转变,在胚胎发育、基因治疗、药物筛选、新药开发、生殖医学及人类疾病的移植治疗中具有广泛的应用前景。     

Imaging the embryonic kidney

The structural and functional development of the permanent mammalian kidney or metanephros is a complex process involving the actions of thousands of gene products, complex cell movements and tissue patterning in three dimensions (3D). This review focuses on the recent advances made in imaging technology, processing and analysis combined with mouse genetics and the generation of protein-reporter mice which has enabled us to monitor the development and movement of defined cell populations within the developing kidney in 3D and over time (4D).     

FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性的作用

学术背景：胚胎干细胞无论对转基因动物的制备还是对疾病的治疗都具有巨大的潜能，但前提是用于治疗的胚胎干细胞具有其特有的多能性和全能性，而FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性都具有重要作用。目的：了解FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性的作用。检索策略：应用计算机检索Pubmed1996—09／2007—05期间的相关文章，检索词为“FoxD3”，限定语言种类为英文。检索到67篇文章，排除重复的和与胚胎发育和胚胎干细胞相关性不大的文章，共纳入32篇文献。文献评价：32篇文献中分别涉及胚胎干细胞转录调节、FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性的作用及其Foxd3在其他细胞中（骨髓细胞、神经嵴细胞、色素细胞）的功能等方面的内容,资料综合：胚胎干细胞具有其他细胞不可比拟的特性使胚胎干细胞应用广泛，要合理控制胚胎干细胞在体内和体外的分化，关键要了解那些控制胚胎干细胞命运的基因。FoxD3是叉头框（Forkheadbox，Fox）家族中的一个转录调控因子，它对胚胎上胚层及其衍生物的形成和建立多潜能胚胎干细胞系具有重要作用，并与控制胚胎发育和胚胎干细胞多能性的其他转录调控因子有一定的联系。结论：FoxD3是维持胚胎上胚层细胞多潜能性和在体外建立胚胎干细胞系所必需的。     

人胚胎干细胞的保存方法

目的:胚胎干细胞经传代长期培养后会导致核型出现异常、未分化细胞的克降数减少,因此经低温保存后复苏的胚胎干细胞必须要保持其未分化状态及生物学特性.实验拟比较程序降温法、改良慢速冻存法及传统慢速冻存法对人胚胎干细胞冷冻保存的效率,以及解冻后细胞生长与分化的状态.方法:实验于2006-07/2007-04在解放军军事医学科学院野战输血研究所完成.①材料:清洁级孕13.5 d的ICR小鼠由军事医学科学院动物中心提供,用于制备鼠成纤维细胞饲养层,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.人胚胎干细胞系PKU由北京大学第三医院生殖中心建立并提供:kryo-550.16程序降温仪为英国planner公司产品,由液氮压力泵、液氮罐、层流冷冻箱、温度传感器组成.②实验方法:将人胚胎干细胞系PKU接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上,胶原酶Ⅳ消化传代,分3组冷冻保存人胚胎干细胞.程序降温法:用吸管将消化后人胚胎干细胞吹成若干团块,取65个团块移入配制的冻存液中,装入麦管进行三段式降温,即22℃～-7℃,每分钟降温2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃～-30℃,每分钟降温0.3℃ 30℃～-150℃,每分钟降温10℃.降至-150℃时置液氮中保存.改良慢速冻存法:A管含人胚胎干细胞培养基和血清替代品,B管含人胚胎千细胞培养基和二甲亚砜,将60个团块置入A管,再将B管液体移入A管,混匀后-70℃过夜,第2天移入液氮中保存.传统慢速冻存法:将60个团块直接放入添加二甲亚砜的人胚胎干细胞培养基中混匀,分装入冻存管,-4℃放置1 h,-70℃过夜,第2天移入液氮长期保存.③实验评估:解冻后,将保持完整形态且细胞未散离的人胚胎干细胞团块回收,比较3组细胞复苏率、复制生长状态、克隆分化程度.鉴定程序降温组人胚胎干细胞的生物学特性.结果:①复苏率:程序降温组、改良慢速冻存组、传统慢速冻存组的细胞复苏率分别为78.5%、56.7%和23.3%,组间比较差异有显著性意义(x2=6.81～13.89,P＜0.01).②复制生长与克隆分化程度:解冻后第7天与传统慢速冻存组比较,程序降温组及改良慢速冻存组细胞克隆均明显增大(t=7.36,P＜0.05:t=6.89,P＜0.05),且解冻后克隆不易分化(x2=20.47,P＜0.01:x2=9.69,P＜0.01).③生物学特性鉴定:程序降温组解冻后第10代人胚胎干细胞染色体核型正常,人胚胎干细胞特异性表面抗原SSEA-4及TRI-1.81表达呈阳性,RT-PCR可检测到nanog基因表达,SSEA-4及OCT-4阳性表达率分别为83.44%、89.38%.结论:①程序降温法是冷冻保存人胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和生物学特性.②在不具备程序降温仪的条件下,采用改良慢速冻存法保存胚胎干细胞也是可行的.     

小鼠胚胎后肾移植的胚龄选择

目的:观察小鼠不同胚龄的后肾植入同种异体远交系成年宿主体内后的生长变化,分析小鼠胚胎后肾移植的胚龄选择、血管起源。方法:实验于2003-06/2004-06在锦州医学院组织与胚胎学教研室完成。实验选用普通级昆明系小白鼠24只,同笼饲养。以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄0d,以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0d。以随机数字表法取胚龄13,14,16d的胎鼠及生后1d的仔鼠,即胚龄13d组、胚龄14d组、胚龄16d组、生后1d组,每组8只。受体动物选择普通级体质量20g～25g的成年健康雄性小白鼠32只。对胚龄13d的小鼠胚胎离体后肾4只进行组织培养,观察10d后肾小体的发育情况。选择胚龄13,14,16d及生后1d的小鼠后肾植入同种远交系成年宿主大网膜内10d后,采用光镜及电镜技术观察后肾脏各部(特别是肾小体)的发育情况。结果:各组进行实验的后肾及宿主小白鼠32只均进入结果分析。①胚龄13d的小鼠肾脏中无成熟的肾小体,此胚龄的离体后肾经组织培养和移植后均可以生长和分化,产生成熟的肾小体。②胚龄14,16d及生后1d的小鼠肾脏中,已出现了成熟肾小体,后肾移植后则出现了排斥反应,间质水肿、出血区及淋巴细胞浸润,肾小体萎缩,甚至完全被纤维组织所取代;且排斥反应强弱与胚龄有关,胚龄越大,排斥反应越强。③培养前的后肾结构与移植前胚龄13d小鼠胚胎的后肾结构相同;培养10d后,可见出现了发育中各个阶段肾小体,电镜下可见血管球结构完整。结论:在供体后肾肾小体出现之前移植,其排斥反应轻微,生长发育良好,表明血管球形成之前是移植的最佳时间。     

胚胎干细胞的鉴定方法

目的:胚胎干细胞具有全能性及核型正常的特征是其作为研究哺乳动物胚胎发育、细胞分化、外源基因的表达、以及利用基因突变的胚胎干细胞建立人类遗传病动物模型的理论基础。因而,胚胎干细胞的鉴定工作对于研究和利用胚胎干细胞具有重大的意义。资料来源:应用计算机检索Medline数据库1980-01/2003-12相关胚胎干细胞的文章,检索词“embryonicstemcell,embryo,Alkalinephos-phatase,Oct-4”,限定文章语言种类为英文。同时计算机检索中国期刊全文数据库1980-01/2003-12相关胚胎干细胞的文章,检索词“胚胎干细胞”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审。纳入标准:与胚胎干细胞鉴定有关的文献。排除标准:文献中重复研究、综述类文章。资料提炼:主要收集了16篇有关胚胎干细胞鉴定的文献。查找全文。资料综合:将所选的资料按以下顺序归纳总结:①形态和生长特性的初步鉴定。②免疫学方法鉴定。③染色体相关鉴定。④全能性和多能性鉴定。结论:胚胎干细胞的鉴定并不是用某一种方法就可以的,而是一个鉴定过程。在这个过程中,我们应先检查碱性磷酸酶和核型,然后鉴定干细胞的表面标志物,当胚胎干细胞达到一定数量后再鉴定干细胞的发育全能性,每种鉴定都要重复多次。     

胚胎干细胞的鉴定方法

目的：胚胎干细胞具有全能性及核型正常的特征是其作为研究哺乳动物胚胎发育、细胞分化、外源基因的表达、以及利用基因突变的胚胎干细胞建立人类遗传病动物模型的理论基础。因而。胚胎干细胞的鉴定工作对于研究和利用胚胎干细胞具有重大的意义。资料来源：应用计算机检索Medline数据库1980-01／2003-12相关胚胎干细胞的文章，检索词“embryonic stem cell，embryo，Alkaline phosphatase，Oct-4”，限定文章语言种类为英文。同时计算机检索中国期刊全文数据库1980-01／2003-12相关胚胎干细胞的文章，检索词“胚胎干细胞”，限定文章语言种类为中文。资料选择：对资料进行初审。纳入标准：与胚胎干细胞鉴定有关的文献。排除标准：文献中重复研究，综述类文章。资料提炼：主要收集了16篇有关胚胎干细胞鉴定的文献。查找全文。资料综合：将所选的资料按以下顺序归纳总结：①形态和生长特性的初步鉴定。②免疫学方法鉴定。③染色体相关鉴定。④全能性和多能性鉴定。结论：胚胎干细胞的鉴定并不是用某一种方法就可以的，而是一个鉴定过程。在这个过程中，我们应先检查碱性磷酸酶和核型，然后鉴定干细胞的表面标志物，当胚胎干细胞达到一定数量后再鉴定干细胞的发育全能性，每种鉴定都要重复多次。