HSV-gB、gD糖蛋白重组串联抗原表位蛋白的表达及鉴定

目的 制备HSV-gB、gD蛋白串联表位重组蛋白,为单纯疱疹病毒(HSV)疫苗的研制提供新型抗原蛋白以及新的抗原制备方法.方法 应用生物信息学软件laser gene DNASTAR分析HSV1-gB、gD和HSV2-gB、gD蛋白的抗原表位.选取9个表位,设计并合成表位串联重组蛋白编码基因X,构建其原核细胞表达重组体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达该重组表位蛋白X,Western blot法(抗His标签)鉴定重组蛋白.结果 构建了HSV-gB、gD蛋白串联表位重组蛋白X的原核表达体,在BL21菌中表达了X蛋白,Western blot法(抗His标签)鉴定了重组蛋白X.结论 建立了制备HSV-gB、gD蛋白重组抗原表位蛋白的方法,为HSV疫苗的研制提供了可能的新型抗原蛋白.     

胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因重组腺病毒载体的构建及其在COS-7细胞的表达

目的:构建含有胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因的腺病毒载体,并转染真核细胞COS-7.方法:多参数分析预测MUC4抗原HLA-A1、HLA-A2限制性CD8 T细胞表位kozac序列、引导序列以及通用Th表位PARDE和多表位基因串连后合成嵌合全基因.嵌合基因克隆到腺病毒穿梭载体pAdshuttle-CMV获得重组质粒pAdshuttle-CMV-PE.酶切鉴定后,将正确的重组质粒转化含有腺病毒骨架载体的BJ5183菌进行同源重组.Pac Ⅰ酶切和测序鉴定正确的重组子,脂质体介导转染Ad293细胞,通过观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达和PCR扩增目的基因的方法鉴定重组腺病毒(rAd-PE).Ad293细胞反复感染冻融扩增病毒,流式细胞仪和TCID50检测病毒滴度.病毒颗粒感染COS-7细胞,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白的表达以及SDS-Page分析多表位嵌合蛋白的表达.结果:成功构建了含有胰腺癌MUC4的多表位嵌合基因重组腺病毒,病毒滴度为1×1010 pfu/ml.SDS-Page发现在16 kD处有一符合预期大小的蛋白表达.结论:该重组腺病毒成功构建并能够在真核细胞COS-7中表达,为下一步胰腺癌的肿瘤疫苗研究奠定相应的基础.     

乙型肝炎病毒多表位治疗性抗原基因的合成、表达及抗原性研究

目的研究乙型肝炎病毒多表位治疗性疫苗基因的合成、表达及其产物的抗原性。方法设计、并合成乙型肝炎病毒多表位抗原基因BPT,克隆入融合表达载体pWR450-1,构建重组质粒PWR/BPT。在大肠杆菌中表达乙型肝炎多表位抗原蛋白并纯化该蛋白,并用Western-blotting方法初步检测该抗原蛋白的抗原性。结果成功构建了融合表达载体PWR/BPT,在大肠杆菌中表达出乙型肝炎多表位抗原蛋白,Western-blotting 检测显示该蛋白具有良好抗原性。结论HBV多表位治疗性抗原基因的设计是成功的,其在大肠杆菌中表达的重组融合蛋白具有良好的抗原性,可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物。     

乙型肝炎病毒多表位治疗性抗原基因的合成、表达及抗原性研究

目的 研究乙型肝炎病毒多表位治疗性疫苗基因的合成、表达及其产物的抗原性。方法 设计、并合成乙型肝炎病毒多表位抗原基因BPT，克隆人融合表达载体pWR450-1，构建重组质粒PWR／BPT。在大肠杆菌中表达乙型肝炎多表位抗原蛋白并纯化该蛋白，并用Westerm-blotting方法初步检测该抗原蛋白的抗原性。结果 成功构建了融合表达载体PWR／BPT，在大肠杆菌中表达出乙型肝炎多表位抗原蛋白，Westem-blotting检测显示该蛋白具有良好抗原性。结论 HBV多表位治疗性抗原基因的设计是成功的，其在大肠杆菌中表达的重组融合蛋白具有良好的抗原性，可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物。     

OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白疫苗的构建表达及其对HBV转基因小鼠的免疫效果研究

目的：构建OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白疫苗来研究对HBV转基因小鼠的免疫效果。方法：将HBsAg‘a’抗原决定簇主要肽段S-（124-147aa）插入到沙门氏菌外膜孔道蛋白OmpC第4 Loop区,并运用DsbA进行辅助二硫键形成,对HBV转基因小鼠免疫,激活固有免疫系统中的B-1细胞产生HBsAb。结果：HBsAg的adr‘a’表位CTSPAQGTSMF-PSCCCTKPSDGNC成功插入OmpC-HBsAg‘a’基因的588~659 bp之间,重组后的载体PCR鉴定和测序结果完全与设计相一致。IPTG诱导表达后,荧光显微镜显示3E7抗体能够识别BL21外膜表面的OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白,用表达该蛋白的BL21直接免疫HBV转基因小鼠,能够产生HBsAb抗体。结论：OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白在原核中表达具有天然构象,以此蛋白为基础的疫苗能够打破HBV转基因小鼠对HBsAg的免疫耐受。     

结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价

  目的  评价结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c的细胞表位融合蛋白的免疫原性,为研制新型多阶段结核疫苗提供可靠的靶抗原。  方法  将Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c基因中的细胞表位串联构成融合抗原基因(命名为msv),克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1中,诱导表达后采用亲和层析纯化表达产物,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用纯化的融合抗原蛋白免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,采用淋巴细胞增殖法检测其免疫原性。  结果  成功构建了能表达融合抗原基因msv的原核表达质粒;SDS-PAGE和Western blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得相对分子质量为41.3×103的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度,结果表明特异性抗体效价约为1:81 920;淋巴细胞增殖实验结果表明,抗原致敏的淋巴细胞经融合蛋白msv刺激后明显增殖。  结论  成功表达并纯化出融合蛋白msv,该融合蛋白可诱导小鼠特异性抗体表达和刺激细胞免疫应答,可作为结核疫苗的抗原组分。     

SARS冠状病毒S蛋白抗原表位串联基因的设计和表达

目的:表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,为研制新型的SARS病毒疫苗提供新思路。方法:应用生物信息学分析软件分析SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,设计全新的抗原表位编码基因序列,构建表达载体并在大肠杆菌中表达该基因。结果:设计并合成了SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列的新基因序列,在大肠杆菌中实现了该基因的高表达。结论:可以重新设计新基因产生新型候选重组疫苗。     

CEA的多表位疫苗基因的设计及构建的表达载体在原核表达系统中的表达

目的 本研究设计肿瘤相关抗原CEA的多表位疫苗基因和构建的重组表达载体在原核表达系统中成功表达融合蛋白.方法 根据预测分析得到的表位氨基酸序列,选取预测分值较高的CTL表位(IMIGVLVGV)和B细胞表位(SNNSKPVEDK),并结合“非选择性”辅助T细胞表位(AKFVAAWTLKAAA)串联起来,按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化,委托生物技术公司合成寡核苷酸,退火获得目的基因,并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内.将此重组载体转化E.coli BL21(DE3)表达融合蛋白,并经SDS-PAGE、Western blot分析鉴定.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表位融合蛋白ozlf-86/87.结果 嵌合有多表位目的基因的原核重组质粒pET32a(+)/ozlf-86/87,进行酶切和测序鉴定,构建成功.SDS-PAGE分析表明,重组质粒在37℃1.0mmol/L IPTG条件下诱导6h能很好地表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为20kDa,与预期Mr大小吻合;蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的20％.,并经Western blot鉴定为目的蛋白.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化成功获得表位融合蛋白,即ozlf-86/87,纯度达到90％以上.结论 本研究获得的多表位融合蛋白对胃肠道恶性肿瘤诊断试剂的研究和进一步的疫苗研究奠定了基础.     

SARS-Cov M蛋白的真核表达及其免疫原性研究

目的初步研究SARS-Cov病毒M蛋白基因的真核表达效率和免疫原性为进一步的疫苗研究奠定基础。方法以PCR方法在全病毒基因组文库中获得全长M基因,分别克隆至pcDNA4-his／myc和pVAON33载体获得重组质粒pcDNA4-his／myc-M和pVAON33-M。以Western Blot方法利用融合分子羧基段的myc表位检测pcDNA4-his／myc-M转染的293T细胞中M蛋白的真核表达。以ELISA方法检测pVAON33-M质粒基因免疫小鼠诱导产生特异性抗血清。结果pcDNA4-his／myc-M转染后48h可检测到SARS-Cov M蛋白表达。pVAON33-M基因免疫能够诱导产生M特异的体液免疫应答。结论本研究的结果表明SARS-Cov M蛋白可以在真核细胞中有效表达并有良好免疫原性,可以作为SARS-Cov疫苗研制的候选抗原之一。     

恶性疟原虫红前期多表位融合抗原基因的构建及其高效表达

目的:构建一个恶性疟原虫红前期多表位融合抗原基因(PfCP-TCL),并在毕氏酵母中进行高效分泌表达.方法:选取了疟原虫红外期疫苗候选抗原CSP、TRAP和LSA-1中的一些重要T、B细胞表位,按一定的次序加以串联连接,并全合成该融合基因.在毕氏酵母中进行分泌表达,并纯化表达产物.结果:合成的基因在毕氏酵母中高水平分泌表达,产量达1 g/L以上.经离子交换和凝胶过滤2步纯化过程,获得纯度在95%以上的重组蛋白.结论:全合成的多表位融合抗原基因能在毕氏酵母中高水平分泌表达,并产生一种工艺简易的纯化方法.大量获得该重组蛋白为探讨其免疫学功能及作为多价联合疫苗的成分提供了基础.     

复合T辅助细胞表位基因质粒的构建及测序

目的制备复合T辅助细胞表位基因。方法复合T辅助细胞表位由5个T辅助细胞表位组成(结核杆菌热休克蛋白65p120、风疹蛋白E2-4p5465、人工合成T辅助细胞表位PADRE、沙眼衣原体热休克蛋白60p3548、破伤风类毒素p830843),其基因序列由219个核苷酸组成。人工合成4条69bp的DAN片段,各片段首尾之间有19bp的互补序列,应用DNA互补延伸拼接技术将4条DNA片段拼接成复合T辅助细胞表位,通过克隆、测序进行筛选。结果通过人工合成基因片段,应用DNA互补延伸拼接技术,成功制备了219个碱基的复合T辅助细胞表位基因,构建了复合T辅助细胞表位基因质粒。结论复合T辅助细胞表位基因的成功制备为研究复合T辅助细胞表位高效疫苗奠定了基础。     

恶性疟多表位疫苗在鼠疟的保护性试验

为寻找恶性疟原虫基因工程多表位疫苗保护性评价的模型动物,利用鼠约氏疟原虫（Plasmodium　yoelii）及伯氏疟原虫小鼠（Phasmodium　bergher）模型对本实验室构建的恶性疟原虫（Plasmodium　falciparum）多表位基因工程候选疫苗进行了体内保护性及免疫模式试验。结果在约氏疟原虫,先用该疫苗基因的大肠杆菌表达蛋白免疫、后用含同一基因的重组痘苗病毒加强免疫组与野生型痘苗病毒免疫组及空白对照相比,小鼠的死亡时间延长（P<0.01）。结果初步显示,约氏疟原虫鼠模可用作该基因工程多表位恶性疟原虫候选疫苗的保护性评价。     

2-型猪链球菌保护性抗原RfeA的B细胞表位预测

以2-型猪链球菌(SS2)保护性抗原RfeA推定的氨基酸序列为基础,采用Kyte-Doolittle法分析蛋白的亲水性,Emini法预测蛋白的表面可能性,以及Jameson-Wolf法预测蛋白的抗原指数;辅以Garnier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法对蛋白二级结构中柔性区域...     

TS-Fe3O4介导丙型肝炎病毒多表位基因疫苗的研究

目的 研发能诱导有效免疫应答的丙型肝炎病毒(HCV)基因疫苗候选者及探索磁性纳米材料作为基因载体的应用前景.方法 选择5个HCV保守性T/B细胞识别的抗原表位基因,克隆入pcDNA3.1(+),鉴定重组质粒,测定其细胞水平的表达以及在小鼠体内诱导的免疫反应.同时合成壳聚糖(CTS)修饰的Fe3O4磁性纳米微粒(CT...     

A recombinant multi-epitope, multi-stage malaria vaccine candidate expressed in Escherichia coli

Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍａｌａｒｉａｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｖｉｄｅｓａｃｏｓｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｆｏｒａｄｄｉｔｉｏｎｔｏｃｕｒｒｅｎｔｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｍａｌａｒｉａｃｏｎｔｒｏｌｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ１　Ｈｏｗｅｖｅｒ,ｓｅｖｅｒａｌｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｓ,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｐａｒａｓｉｔｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ,ｎｏｎｒ…     

恶性疟疾多价疫苗的构建及表达

目的 构建恶性疟原虫多表位融合抗原基因(PfCP2E9),并在毕氏酵母中进行高效分泌表达.方法 选取本实验室前期构建的融合蛋白PfCP-2.9与疟原虫红内期疫苗候选抗原EBA175IIF2,按一定的次序拼接成该融合基因,并克隆至酵母表达载体,用电转化方法将拼接基因导入毕氏酵母中进行分泌表达.结果 拼接的基因在毕氏酵母中高水平分泌表达.结论 构建的恶性疟原虫多表位融合抗原基因能在毕氏酵母中高水平分泌表达,为探讨其免疫学功能及作为多价联合疫苗的成分提供了基础.     

最低限度免疫定义基因表达的HCV多表位DNA疫苗对小鼠细胞免疫的诱导作用

目的：探讨采用最低限度免疫定义基因表达法制备丙型肝炎病毒（HCV）多表位DNA疫苗的可行性,阐明该方法在疫苗领域可能的应用价值。方法：采用人工合成和PCR方法制备长度为1 346 bp的含有CMV启动子、HCV 1b亚型多表位和牛生长激素（BCG）多聚腺苷酸序列的最低限度免疫定义基因表达DNA疫苗,命名为M-HCV-epi;同时制备结构基因被非HCV同源的DNA序列替换的相同长度DNA片段作为对照,命名为V-pcDNA3.1。12只ICQ小鼠随机分为实验组（n=6）和对照组（n=6）,分别采用M-HCV-epi DNA和V-pcDNA3.1 DNA各20 μg皮下注射。QRT-PCR法检测免疫后小鼠脾细胞中干扰素γ（IFN-γ）mRNA的表达水平;人工合成3个HCV 1b亚型表位多肽和1条对照多肽。用上述合成的多肽刺激免疫后小鼠脾细胞,ELISA法检测脾细胞刺激上清中IFN-γ水平。结果：与对照组比较,实验组小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达水平升高（1.50±0.18）倍（P<0.05）;加入aa35-44多肽的实验组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平较对照组明显升高（P<0.05）。结论：最低限度免疫定义基因表达法制备HCV多表位DNA疫苗可诱导细胞免疫反应,该方法在DNA疫苗领域可能具有应用价值。     

CEA串连表位-HSP70融合基因疫苗诱导小鼠的表位特异性免疫应答

目的：观察癌胚抗原(CEA)串联表位-HSP70融合基因疫苗诱导的免疫应答，为开发新型肿瘤特异性基因疫苗奠定基础。方法：在已经构建含有变异热休克蛋白(HSP)序列的基础上，插入重组CEA串联表位的编码片段获得CEA串联表位-HSP融合基因疫苗。3次肌肉注射免疫Balb/c小鼠，设立注射生理盐水的阴性对照组、注射氢氧化铝佐剂混悬CEA串联表位的阳性对照组及注射pCITriCEA_625-667-mtHSP70的实验组。FCM分析脾脏T细胞亚群；体外培养脾细胞，ELISA检测培养上清中干扰素γ(IFNγ)的相对含量；同时测定小鼠血清CEA特异性抗体的滴度。结果：阴性对照组脾细胞中CD3⁺和CD4⁺T细胞分别为55.1%±6.1%和30.2%±4.1%；实验组脾细胞中CD3⁺和CD4⁺T细胞分别为78.7%±9.2%和48.9%±4.7%，两组比较差异有显著性(P<0.01)。其体外特异性抗原肽诱导的IFNγ分泌处于本底水平，可视为生理性参数，体外非特异性和特异性的IFNγ分泌分别增加3和6倍(P<0.01)。血清中CEA表位特异性抗体滴度阴性对照组为0，阳性对照组＜1∶500,而融合基因疫苗免疫组达到1∶4 000。结论：CEA串联表位-HSP融合基因疫苗在体内诱导以激发辅助性T细胞为特征的免疫应答。