单纯疱疹病毒Ⅰ型基因治疗载体的快速构建

背景：单纯疱疹病毒Ⅰ型载体因具有独特的优点目前被广泛应用,但其构建尚缺乏一种快速有效的方法。目的：利用Cre/Loxp高效重组系统构建单纯疱疹病毒Ⅰ型载体。方法：分离单纯疱疹病毒HSV-1,将含Cre重组酶的c66-SV40-cre质粒转染Vero细胞,构建一株带有Loxp位点的重组HSV-1框架载体HSVLoxp。构建穿梭载体pShuttle-SV40-Cre-Loxp-IRES及重组单纯疱疹病毒Ⅰ型载体HSV-GDNF,用HAT培养基筛选出阳性毒株后用GDNF引物做PCR鉴定,扩增培养后测定滴度。结果与结论：成功构建pHV-TK-GFP质粒,并在Vero细胞内发生重组,分离出缺失了Us3基因的重组病毒HSVtk-Loxp-GFP01。成功构建HSV-1框架载体HSVLoxp及穿梭载体pShuttle-SV40-Cre-Loxp-IRES,成功获得GDNF基因,并将其转移到了HSV-1基因组上,成功构建了表达GDNF的单纯疱疹病毒HSV-1载体,测定其滴度约为2.25×106IU/mL。     

柯萨奇病毒B3VP1重组腺病毒载体疫苗rAd/VP22-L-VP1的构建及表达

背景：VP22是单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type1,HSV-1）UL49基因编码的碱性蛋白质,具有蛋白转导结构域（protein transduction domain,PTD）,能够把与之融合的蛋白或与之结合的DNA等大分子跨膜送递到邻近细胞,在基因靶向预防中表现出优势。目的：构建表达单纯疱疹病毒1型VP22与柯萨奇病毒B3主要中和抗原VP1融合蛋白的重组腺病毒载体疫苗,观察外源基因在HEK293细胞中的良好表达。方法：PCR法扩增目的基因HSV-1VP22和CVB3VP1,经Linker连接,将VP22-L-VP1插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒AdTrack-CMV/VP22-L-VP1。再将此载体与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,生成重组腺病毒质粒pAd/VP22-L-VP1,脂质体介导pAd/VP22-L-VP1转染HEK293细胞包装重组腺病毒rAd/VP22-L-VP1。HEK293细胞上进行病毒扩增和滴定并检测外源基因的表达。结果与结论：构建的重组腺病毒载体pAd/VP22-L-VP1经过第4轮扩增,其滴度达到6.77×107pfu/mL,体外感染293细胞可见VP22和VP1融合蛋白的表达。说明实验成功构建并包装重组腺病毒rAd/VP22-L-VP1。     

重组腺病毒rAd-mIL-15的构建及表达

目的构建并制备鼠白细胞介素-15(mIL-15)重组腺病毒(rAd-mIL-15),感染HEK293细胞,为肝细胞肝癌的免疫治疗奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增mIL-15,将扩增产物连接到穿梭载体pDC316上,构建重组穿梭质粒pDC316-mIL-15。在Lipofectamine2000脂质体介导下将腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-mIL-15共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-mIL-15。随后在HEK293细胞中包装扩增病毒并测定病毒滴度。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果重组腺病毒质粒经PCR鉴定,证实含有mIL-15基因,重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25×1010 PFU/mL。结论采用细胞内同源重组方法可成功构建含mIL-15基因的重组腺病毒,并可获得高滴度病毒,其能高效感染HEK293细胞,能为进一步研究奠定基础。     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景:RNA干扰技术的应用,关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞,目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体.目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体.设计、时间及地点:开放性实验,于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成.材料:穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品;AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.(Canada)公司产品.方法:选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列,设计合成为相应的双链DNA,并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接,构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒.主要观察指标:对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定.结果:构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析,证实与设计一致.重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功,测定滴度为1.4×109 nfu/L.结论:实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒.     

重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定

背景:基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向,目的基因和载体是基因治疗的关键.目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brai-denved neurotrophic factor,hBDNF)基因重组腺病毒载体.设计、时间及地点:单.一样本观察,实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成.材料:感受态大肠杆菌DH-5 α购自美国Stratagene公司;pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre 、腺病毒包装系统AdMax 和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobixg- Biosysrerms公司.方法:以pDC316-hBDNF为模板,聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段,连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上,构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP.利用AdMax包装系统.穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.主要观察指标:①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定.②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定.③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化.④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定.⑤纯化病毒的滴度测定结果.结果:经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP/mL,A260/A280值约为2.0,滴度为0.8×1010 CCID50/mL.结论:已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础.     

表达降钙素基因相关肽的单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体的构建、包装和扩增

目的对单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质料装载降钙素基因相关肽,并进行包装和扩增。方法分别钓取pac基因和γ134.5基因,克隆入pMD18-T载体中。pSV载体经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,获得lacZ片段,自身环化形成pUPO-γ134.5-lacZ。合成CGRP基因序列,将此基因替换pUPO-γ134.5-lacZ质粒中的lacZ基因,插入γ134.5基因位点中,即pUPO-Δγ134.5-CGRP。再用单纯疱疹病毒温敏株辅助在BHK细胞中包装、扩增,通过检测lacZ的表达反映扩增子病毒滴度。结果酶切鉴定证实重组子构建成功。重组扩增子质粒的包装、扩增由BHK细胞的形态变化和X-gal原位检测载体lacZ的表达证实。扩增子假型病毒滴度达3.5×105TU/ml。结论本研究构建、包装、扩增的携带降钙素基因相关肽的假型病毒有较高感染性,这种扩增子病毒可作为实验研究的有力工具。     

人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达

目的构建HSP75基因重组腺病毒载体,观察HSP75蛋白在C17.2神经干细胞中的表达。方法采用PCR方法从含人HSP75基因质粒中扩增HSP75基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域,构建重组穿梭质粒p HBAd-MCM-HSP75-GFP,在LipofiterTM转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒p HBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞,整合包装成重组腺病毒,TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blotting观察重组腺病毒在C17.2细胞中的感染情况及HSP75蛋白的表达水平。结果通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定,HSP75基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒整合包装成重组腺病毒;重组腺病毒滴度为1.0×1010PFU/ml;Western blotting检测,转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论 HSP75重组腺病毒载体成功构建,对C17.2神经干细胞具有较高的表达效力。     

大鼠黏结蛋白聚糖1基因重组腺病毒载体的构建及感染效率

背景:重组腺病毒质粒的构建方法主要有体外连接法和同源重组法。同源重组法有操作复杂、耗时长、效率低、纯化难的缺点。体外连接法又不可避免非特异性的基因重组及基因突变。目的:应用改良体外连接法构建携带黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体,测定其在心肌成纤维细胞中的感染效率。设计、时间及地点:单一样本实验,于2007-08/2008-02在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。材料:穿梭载体pShuttle-CMV(含绿色荧光报告基因)和腺病毒骨架质粒pAdxsi购自诺赛基因组研究中心有限公司。方法:核苷酸序列鉴定pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒;用KpnⅠ XhoⅠ从质粒pCMV-Sport6.1-Sdc1切出黏结蛋白聚糖1基因片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,形成重组穿梭质粒。用I-CeuI I-SceI双酶切出重组穿梭质粒中CMV-Sdc1片段,亚克隆至腺病毒基因组质粒中,得到重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVSdc1,转化体外培养的心肌成纤维细胞。主要观察指标:用DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的滴度和感染效率。结果:①核苷酸序列分析表明,pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒正确携带大鼠黏结蛋白聚糖1cDNA;黏结蛋白聚糖1基因被克隆于载体pShuttle-CMV上,以KpnⅠ XhoⅠ双酶切可回收3kb的克隆片段和5.1kb的载体片段;重组腺病毒质粒用XhoⅠ酶切得到7个片段而空载体仅得到6个片段。②重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;提取病毒DNA行聚合酶链反应鉴定可扩增出1.13kb的特异性片段;用病毒上清多次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度检测达2.0×1011PFU/mL。③用纯化浓缩后的重组腺病毒以感染复数为100感染心肌成纤维细胞,24h后所有细胞均表达绿色荧光。结论:成功构建了携带大鼠黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体,经纯化浓缩后具有较高的滴度,能有效转染心肌成纤维细胞。     

重组腺病毒载体Ad5-Olig1-eGFP的构建与鉴定

目的:转录因子Olig1调控了少突胶质前体细胞的分化和成熟,并参与了脱髓鞘损伤后的修复,是治疗脱髓鞘疾病的候选基因,在缺血性脑血管病的治疗中具有极大的应用价值。本实验旨在构建携带Olig1基因的重组腺病毒载体。方法:pDC315-Olig1为模板,聚合酶链反应扩增酶切Olig1片段,连接到带有eGFP标记基因的载体质粒pDC315-eGFP上,构建穿梭质粒pDC315-Olig1-eGFP,经PCR,酶切及测序鉴定后,利用AdMax包装系统,通过脂质体2000的介导与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组后产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-Olig1-eGFP,应用PCR对毒种进行鉴定,传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒。以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度。结果:经聚合酶链反应,酶切鉴定和测序分析,得到大小700bp(Olig1)目的片段,证实正确构建重组穿梭质粒pDC315-Olig1-eGFP和重组腺病毒Ad5-Olig1-eGFP,测得重组腺病毒颗粒数为2.3×1011v.p./mL。结论:成功构建携带Olig1的重组腺病毒载体Ad5-Olig1-eGFP,为缺血性脑血管病的基因治疗提供基因载体并奠定实验基础。     

重组腺病毒载体pDC316-hIL-24的构建及病毒滴度测定

目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达hIL-24基因的重组腺病毒载体（pDC316-hIL-24）,获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体（pDC315-hIL-24）的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。