脑微血管内皮细胞缺氧模型转化生长因子β1表达与脑溢安的干预

背景：临床及动物实验证实脑溢安能促进脑出血急性期血肿吸收及神经功能恢复,提高生活质量。目的：观察脑溢安血清对体外缺氧培养的大鼠脑微血管内皮细胞转化生长因子β1mRNA表达的影响。方法：用分离培养的大鼠脑微血管内皮细胞移入厌氧培养箱培养18h建立缺氧损伤模型,并随机分为正常组、模型组、正常血清组及含脑溢安血清组。正常组为同一批正常培养的脑微血管内皮细胞;模型组将正常培养的细胞放入厌氧培养箱内培养18h;正常血清对照组细胞在培养液中加5%正常血清后,放入厌氧培养箱中培养18h;脑溢安血清组细胞在培养液中加5%脑溢安血清后,放入厌氧培养箱内培养18h。结果与结论：缺氧培养使脑微血管内皮细胞存活数量减少,其表达的转化生长因子β1mRNA增强,而脑溢安血清能明显增加脑微血管内皮细胞存活数量,降低转化生长因子β1mRNA表达水平（P〈0.05）。说明脑溢安血清下调转化生长因子β1mRNA的表达可能是其抑制脑微血管内皮细胞的凋亡对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用机制之一。     

脑溢安对新生大鼠海马神经干细胞缺氧损伤及白介素-6和白介素-6mRNA表达的影响

目的:探讨中药脑溢安对神经干细胞缺氧损伤的保护作用机制。方法:体外培养神经干细胞来自新生3—5天的SD大鼠海马组织,将神经干细胞移入厌氧培养箱(37℃、95%N2和5%CO2)内培养6h造缺氧损伤,用免疫组化及原位杂交技术研究脑溢安对缺氧损伤神经干细胞及白介素-6(IL-6)和IL-6mRNA表达的影响。结果:脑溢安能促进缺氧损伤神经干细胞存活;缺氧损伤后神经干细胞内IL-6和IL-6mRNA表达增强,脑溢安血清组IL-6及IL-6mRNA表达显著高于模型组和正常血清对照组(P<0.01)。结论:脑溢安可能通过增强IL-6和IL-6mRNA的表达发挥其对缺氧损伤神经干细胞的保护作用。     

血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸抑制脑动静脉畸形血管内皮细胞的增殖

背景:采取反义基因治疗技术控制血管内皮细胞生长因子基因表达,遏止血管生成,是脑血管外科中治疗人脑动静脉畸形的崭新课题。目的:观察血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸对人脑动静脉畸形血管内皮细胞增殖的抑制作用。设计:观察对比实验。单位:解放军沈阳军区总医院神经外科。材料:实验于2006-08/2006-12在解放军沈阳军区总医院的全军神经医学研究所完成。收集2006年解放军沈阳军区总医院神经外科18例脑动静脉畸形患者手术切除的完整人脑动静脉畸形新鲜标本。男12例,女6例;平均40岁。脑动静脉畸形按Spetzler分级:Ⅱ级10例,Ⅲ级8例。全部病例术前均经全脑血管造影证实。人脑动静脉畸形标本获取术前经患者或其家属知情并签同意书。内皮细胞生长添加剂(ECGS;美国Sigma),391型DNA自动合成仪(上海生工利用美国PE公司),厌氧培养箱(浙江产DY-1型),人血管内皮细胞生长因子酶联检测试剂盒购于北京TBD公司,进口分装,96E酶标仪(ERMA,INC)。细胞周期分析试剂盒(BD公司),流式细胞仪(FACSCalibur,BD公司)。方法:①实验过程:采用组织块贴壁法培养人脑动静脉畸形血管内皮细胞,实验用传至3代细胞,随机分成反义组、正义组和对照组,每组4瓶细胞。反义组、正义组分别采用人工合成血管内皮细胞生长因子正义、反义硫代脱氧寡核苷酸,经阳性脂质体包裹后转染体外培养的人脑动静脉畸形血管内皮细胞,对照组不予处理,将各组细胞置于37℃、体积分数0.95N2、0.05CO2厌氧培养箱分别孵育2,4和8h。②实验评估:测定细胞周期。测定细胞血管内皮细胞生长因子蛋白含量。检测细胞血管内皮细胞生长因子mRNA表达。主要观察指标:各组细胞缺氧不同时间点血管内皮细胞生长因子mRNA和蛋白表达及细胞增殖指数。结果:①血管内皮细胞生长因子mRNA表达:对照组细胞缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子mRNA水平高于缺氧前(P<0.05),反义组缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子mRNA水平低于对照组(P<0.05)。②血管内皮细胞生长因子蛋白含量:对照组缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子蛋白含量高于缺氧前(P<0.05),反义组缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子蛋白低于对照组(P<0.05)。③细胞增殖指数:对照组人脑动静脉畸形内皮细胞缺氧4,8h后细胞增殖指数(P<0.05)。反义组缺氧4,8h后低于对照组(P<0.05)。结论:缺氧可能在基因转录水平诱导血管内皮细胞生长因子表达,反义血管内皮细胞生长因子能够显著抑制缺氧诱导的人脑动静脉畸形内皮细胞血管内皮细胞生长因子基因表达和细胞增殖。     

清开灵对小胶质细胞缺氧活化诱导的脑微血管内皮细胞Toll样受体4、gp91~(phox)和闭锁小带蛋白-1表达的影响

目的探讨清开灵注射液抑制小胶质细胞缺氧活化后,脑微血管内皮细胞Toll样受体4 (TLR4)、gp91~(phox)和闭锁小带蛋白-1 (ZO-1)的表达。方法小鼠BV2小胶质细胞分为6组。正常组和模型组用无血清DMEM培养基培养,低、中、高浓度清开灵组用含清开灵注射液0.0625%、0.125%和0.25%的无血清DMEM培养基培养,米诺环素组用含米诺环素200 nmol/L的无血清DMEM培养基培养。除正常组外,其余各组缺氧24 h后复氧24 h,各组培养液分别加入Balb/c内皮细胞培养液中培养24 h。CCK-8检测内皮细胞活力,比色法检测一氧化氮浓度,Western blotting检测共培养模型内皮细胞TLR4、gp91~(phox)和ZO-1表达。结果与正常组比较,模型组细胞存活率和ZO-1蛋白的表达明显降低(P 0.01),一氧化氮浓度、TLR4和gp91~(phox)蛋白表达升高(P 0.05);与模型组比较,各清开灵组和米诺环素组细胞存活率和ZO-1蛋白表达升高(P 0.05),一氧化氮浓度、gp91~(phox)和TLR4蛋白表达降低(P 0.05)。结论清开灵注射液可通过抑制小胶质细胞缺氧活化,降低脑微血管内皮细胞TLR4和gp91~(phox)蛋白表达,提高ZO-1蛋白表达,提高脑微血管内皮细胞的生存和功能。     

脑微血管内皮细胞对体外缺氧神经干细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察脑微血管内皮细胞对体外培养缺氧神经干细胞增殖、凋亡的影响。方法:实验于1996-01/1996-12在佳木斯大学神经科学所完成。实验材料:同一基因背景新生的Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供(黑动字第99102001)。实验方法:①取新生24hWistar大鼠大脑培养神经干细胞,采用免疫组织化学方法鉴定神经干细胞。②取出生1～7dWistar大鼠大脑培养脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定。③将培养传代纯化的脑微血管内皮细胞,用0.25%胰酶消化成单细胞液后接种于涂有多聚赖氨酸包被的盖玻片上,接种传3代后用胰酶消化的神经干细胞,以1∶10接种比例加入神经细胞完全培养液共培养。④用无菌石蜡油覆盖于低糖细胞培养液表面,制备低氧低糖溶液。对照组:正常神经干细胞置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养。缺氧共培养组:取共培养3d细胞,吸出培养液,用无菌Hank’s缓冲液清洗2次,加入低氧低糖溶液共同作用2,4,8,16h后换液,用PBS缓冲液冲洗3次后,换神经细胞完全培养液,置于细胞培养箱中复氧培养。缺氧单纯神经干细胞组:取传3代神经干细胞,用无菌Hank’s缓冲液清洗2次后,方法同上。实验评估:免疫组织荧光鉴定缺氧条件下神经干细胞的增殖与凋亡。结果:①免疫组织化学方法检测Nestin及Ⅷ因子相关抗原分别鉴定为神经干细胞及脑微血管内皮细胞。②对照组细胞胞体饱满,折光性强,周围有光晕。缺氧单纯神经干细胞组细胞胞体肿胀,折光性差,有大量细胞碎屑,仅有少量活细胞,并出现悬浮死细胞。缺氧共培养组细胞形态有所改善,细胞折光性仍较好,大部分细胞突起仍未见回缩,仅少数细胞肿胀,坏死。③随着缺氧时间的延长,细胞死亡明显增多,存活数明显下降。缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组与对照组(321.76±22.20,180.00±17.89,255.33±10.33,P<0.01)。④缺氧条件下脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖及凋亡的影响:缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组,细胞凋亡细胞数低于缺氧单纯神经干细胞组(P<0.05)。结论:脑微血管内皮细胞可以促进缺氧神经干细胞的增殖、减少其凋亡。     

脑溢安对大鼠缺氧神经干细胞保护作用

目的:观察脑溢安对大鼠神经干细胞缺氧损伤后天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(activatedcysteinylaspartatespecificprotease-3,Caspase-3)活化及细胞凋亡的影响,探讨该药抗脑损伤的作用机制。方法:用分离、培养的神经干细胞(neuralstemcellsNSC)造成缺氧模型,以正常大鼠血清、含脑溢安的大鼠血清对缺氧后的神经干细胞进行干预,用脑溢安血清、正常血清、无血清干预缺氧的神经干细胞,以及未受缺氧损伤的正常神经干细胞进行实验,检测神经干细胞缺氧损伤后Caspase-3的活化情况并用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法犤terminal(TdT)-mediateddUTP-biotinnickendlabeling,TUNEL犦检测细胞凋亡情况。结果:正常血清缺氧神经干细胞组、无血清缺氧神经干细胞组有较多TUNEL阳性细胞,脑溢安血清缺氧神经干细胞组TUNEL阳性细胞数较少,而未缺氧的神经干细胞没有表达,脑溢安血清缺氧神经干细胞组与正常血清缺氧神经干细胞组、无血清缺氧神经干细胞组比较TUNEL细胞阳性细胞减少,差异有显著性意义(t=6.5826,6.6245,P<0.05)。脑溢安血清缺氧神经干细胞组与正常血清缺氧神经干细胞组及无血清缺氧神经干细胞组比较活化Caspase-3光密度比值减少,差异有显著性意义(t=4.2653,5.0131,P<0.05)。无血清、正常血清缺     

脑溢安对大鼠缺氧神经干细胞保护作用

目的：观察脑溢安对大鼠神经干细胞缺氧损伤后天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(activated eysteinyl aspartate specific protease-3，Caspase-3)活化及细胞凋亡的影响，探讨该药抗脑损伤的作用机制。方法：用分离、培养的神经干细胞(neural stem cells NSC)造成缺氧模型，以正常大鼠血清、含脑溢安的大鼠血清对缺氧后的神经干细胞进行干预，用脑溢安血清、正常血清、无血清干预缺氧的神经干细胞，以及未受缺氧损伤的正常神经干细胞进行实验，检测神经干细胞缺氧损伤后Caspase-3的活化情况并用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法[terminal(TdT)-mediatedd UTP-biotin nick end labeling，TUNEL]检测细胞凋亡情况。结果：正常血清缺氧神经干细胞组、无血清缺氧神经干细胞组有较多TUNEL阳性细胞，脑溢安血清缺氧神经干细胞组TUNEL阳性细胞数较少。而未缺氧的神经干细胞没有表达，脑溢安血清缺氧神经干细胞组与正常血清缺氧神经干细胞组、无血清缺氧神经干细胞组比较TUNEL细胞阳性细胞减少，差异有显著性意义(t=6．5826，6．6245，P(0.05)。脑溢安血清缺氧神经干细胞组与正常血清缺氧神经干细胞组及无血清缺氧神经干细胞组比较活化Caspase-3光密度比值减少，差异有显著性意义(t=4．2653，5．0131，P&;lt;0.05)。无血清、正常血清缺氧神经干细胞组比较差异无显著性意义(t=0．5190，0.2657，P&;gt;0．05)。结论：脑溢安血清干预缺氧损伤的神经干细胞后，可下调活化的Caspase-3，减少缺氧的神经干细胞凋亡，发挥脑保护作用。     

应用分离微血管段方法培养人脑微血管内皮细胞及对血管内皮细胞生长因子基因表达和细胞超微结构的观察(英文)

背景:观察缺氧状态下脑血管内皮细胞的血管内皮细胞生长因子表达及细胞超微结构变化,可为从细胞和分子水平认识血管生成及其相关的细胞因子参与缺血性脑血管疾病的病变过程。目的:构建分离微血管段体外培养人脑微血管内皮细胞的方法,并观察血管内皮细胞生长因子基因表达与细胞超微结构变化。设计:随机对照的技术方法研究。单位:一所军区总医院的神经外科,一所大学医院的神经外科。对象:2002年沈阳军区总医院神经外科脑动静脉畸形患者18例(SpetzlerⅡ～Ⅲ级),全部病例术前均经全脑血管造影证实。取材于手术中切除的完整脑动静脉畸形新鲜标本周围粘连的新鲜脑组织,采用匀浆、过滤和酶消化技术分离微血管内皮细胞。将在培养瓶内生长良好的细胞分成缺氧2,4,8h组和对照组4组,每4瓶为1组。方法:缺氧条件模拟:体积分数0.95N2,体积分数0.05CO2。免疫组化方法检测细胞中第八因子相关抗原(FⅧ-RA)表达。选用RT-PCR技术观察每组内皮细胞血管内皮细胞生长因子mRNA表达,同时以ELISA方法检测每组细胞上清液中血管内皮细胞生长因子蛋白含量,透射电镜观察细胞超微结构的变化。主要观察指标:对照组和各缺氧组血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子mRNA表达和细胞上清液中血管内皮细胞生长因子蛋白含量,以及细胞超微结构的变化。结果:相差显微镜下,培养的活细胞具有单层“卵石样”排列的典型特征,90%以上的细胞为FⅧ-RA阳性染色。缺氧4h细胞血管内皮细胞生长因子mRNA和蛋白表达为0.98±0.19,(180.77±20.15)ng/L,较对照组显著升高[0,(26.20±6.33)ng/L,P<0.01],8h后表达下调[0.35±0.07,(31.68±8.34)ng/L],并出现线粒体肿胀、内质网扩张及溶酶体多囊泡形成。结论:采用分离微血管段方法培养人脑血管内皮细胞,操作简便易行,细胞纯度可靠。缺血缺氧早期血管内皮细胞生长因子表达不足以维持细胞超微结构完整,随缺氧时间延长细胞可发生损伤性变化。     

应用分离微血管段方法培养人脑微血管内皮细胞及对血管内皮细胞生长因子基因表达细胞超微结构的观察

背景观察缺氧状态下脑血管内皮细胞的血管内皮细胞生长因子表达及细胞超微结构变化,可为从细胞和分子水平认识血管生成及其相关的细胞因子参与缺血性脑血管疾病的病变过程.目的构建分离微血管段体外培养人脑微血管内皮细胞的方法,并观察血管内皮细胞生长因子基因表达与细胞超微结构变化.设计随机对照的技术方法研究.单位一所军区总医院的神经外科,一所大学医院的神经外科.对象2002年沈阳军区总医院神经外科脑动静脉畸形患者18例(SpetzlerⅡ～Ⅲ级),全部病例术前均经全脑血管造影证实.取材于手术中切除的完整脑动静脉畸形新鲜标本周围粘连的新鲜脑组织,采用匀浆、过滤和酶消化技术分离微血管内皮细胞.将在培养瓶内生长良好的细胞分成缺氧2,4,8 h组和对照组4组,每4瓶为1组.方法缺氧条件模拟体积分数0.95 N2,体积分数0.05 CO2.免疫组化方法检测细胞中第八因子相关抗原(FⅧ-RA)表达.选用RT-PCR技术观察每组内皮细胞血管内皮细胞生长因子mRNA表达,同时以ELISA方法检测每组细胞上清液中血管内皮细胞生长因子蛋白含量,透射电镜观察细胞超微结构的变化.主要观察指标对照组和各缺氧组血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子mRNA表达和细胞上清液中血管内皮细胞生长因子蛋白含量,以及细胞超微结构的变化.结果相差显微镜下,培养的活细胞具有单层"卵石样"排列的典型特征,90%以上的细胞为FⅧ-RA阳性染色.缺氧4 h细胞血管内皮细胞生长因子mRNA和蛋白表达为0.98±0.19,(180.77±20.15)ng/L,较对照组显著升高[0,(26.20±6.33)ng/L,P＜0.01],8 h后表达下调[0.35±0.07,(31.68±8.34)ng/L],并出现线粒体肿胀、内质网扩张及溶酶体多囊泡形成.结论采用分离微血管段方法培养人脑血管内皮细胞,操作简便易行,细胞纯度可靠.缺血缺氧早期血管内皮细胞生长因子表达不足以维持细胞超微结构完整,随缺氧时间延长细胞可发生损伤性变化.     

脑溢安对大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的：应用血清药理学方法研究脑溢安对体外培养促神经干细胞的分化作用，旨在进步阐明脑溢安的脑保护机制。方法：从新生3d大鼠海马中分离神经干细胞，按不同培养方法进行分组，加神经干细胞基础培养液为空白组。于神经干细胞基础培养液中加50mL／L脑溢安血清为实验组。于神经干细胞基础培养液中加50mL／L正常血清为对照组。加入含50mL／L脑溢安血清的培养基中培养。在培养的第2天和第7天，用免疫细胞化学法计数Nestin，NF-200，GFAP，04四类免疫阳性细胞的变化。结果：在培养的第2天，空白组Nestin阳性细胞最多，占数细胞总数的96．1％是实验组和对照组的8～11倍，其次是胶原纤维酸性蛋白细胞(glialfibrillery acidic protein，GFAP)、04细胞，NF-200细胞最少，仅占细胞总数的3．83％；实验组以NF-200阳性细胞最多，占细胞总数的42．83％，分别为空白组11．3倍和对照组的1．2倍，其次是GFAP细胞，但较对照组少。培养的第7天，空白组仍以Nestin阳性细胞为最多，其他三类细胞与第2天比较无明显差异；实验组仍以NF-200为最多，占细胞总数的43．85％，其次是GFAP，04细胞，Nestin细胞最少。培养7d后，实验组细胞的凋亡率(4．85％)与对照组(15．32％)比较差异有显著性意义(x^2=6．04，P&;lt;0．05)。结论：脑溢安具有促进神经干细胞向神经元方向分化及促进神经细胞存活的作用。     

姜黄素对缺氧再给氧大鼠心脏微血管内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的：研究姜黄素对缺氧再给氧大鼠心脏微血管内皮细胞粘附分子ICAM－1表达的影响。方法：培养大鼠心脏微血管内皮细胞，建立细胞缺氧再给氧模型，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定内皮细胞粘附分子ICAM－1的蛋白表达，Northern blot分析测定ICAM－1mRNA的表达。结果：缺氧后内皮细胞ICAM－1的蛋白和mRNA表达明显升高，缺氧再给氧后增高更明显，姜黄素组ICAM－1的蛋白和mRNA的表达较缺氧再给氧组明显下降，呈剂量依赖效应。结论：姜黄素能明显下调缺氧再给氧大鼠心脏微血管内皮细胞ICAM－1的表达，抑制内皮细胞的激活。     

左旋四氢巴马汀对大鼠脑微血管内皮细胞缺氧-复氧时细胞间粘附分子-1的影响

目的：探讨左旋四氢巴马汀（L－THP）对缺氧－复氧时脑微血管内皮细胞细胞间粘附分子－1（ICAM－1）表达的影响。方法：采用流式细胞仪检测脑微血管内皮细胞在缺氧、缺氧－复氧及加入L－THP后ICAM－1的阳性细胞百分率。结果：缺氧12h，脑微血管内皮细胞ICAM－1的表达与常氧时差异无显著意义，缺氧12h再给氧12h,ICAM-1的表达明显增加，加入L－THP后，ICAM－1的阳性细胞百分率明显降低。结论：L－THP可减少缺氧－复氧时脑微血管内皮细胞ICAM－1的表达。     

山莨菪碱对脑微血管内皮细胞缺氧-复氧时细胞间黏附分子-1的影响

目的：探讨山莨菪碱（Ani）对缺氧－复氧时脑微血管内皮细胞间黏附分子－1（ICAM－1）表达的影响。方法：采用流式细胞仪检测脑微血管内皮细胞在缺氧、缺氧－复氧及加入Ani后ICAM－1的阳性细胞百分率。结果：缺氧12h，脑微血管内皮细胞ICAM－1的表达与常氧时差异无显著意义，缺氧12h再给氧12h，ICAM－1的表达明显增加，加入Ani后，ICAM－1的阳性细胞百分率明显降低。结论：Ani可减少缺氧－复氧时脑微血管内皮细胞ICAM－1的表达。     

肝细胞生长因子对腹膜透析腹膜纤维化防治作用的研究

目的探讨肝细胞生长因子对腹膜透析腹膜纤维化的防治作用及其机制。方法①MTT法测定肝细胞生长因子对腹膜间皮细胞增殖的影响；②酶联免疫（ELISA）法检测细胞培养液中纤连蛋白（FN）、转化生长因子-β1（TGF-β1）及纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）水平；⑧逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）法检测FN、PAI-1及TGF-β1 mRNA的表达。结果肝细胞生长因子浓度〉30ng／ml时，可以改善高糖对腹膜间皮细胞增殖的抑制作用。腹膜透析液组FN、PAI-1、TGF-β1蛋白水平显著升高，肝细胞生长因子组FN、PAI-1、TGF-β1蛋门水平均显著减少。腹膜透析液组高糖上调腹膜间皮细胞FN、PAI-1、TGF-β1 mRNA的表达，肝细胞生长因子组使FN、PAI-1、TGF-β1 mRNA的表达水平下调。结论肝细胞生长因子能改善高糖对腹膜间皮细胞增殖的抑制作用，同时可以使腹膜间皮细胞FN、PAI-1、TGF-β1的表达水平下调。     

羊水干细胞分泌细胞因子及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

背景:关于细胞移植的功效,重点在于其分泌的促增殖或抗凋亡的细胞因子,羊水干细胞能否分泌相关细胞因子有必要深入分析.目的:观察分离培养的羊水于细胞分泌细胞因子情况,及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-12/2009-06在南昌大学第一附属医院高血压病研究所完成.材料:10例剖宫产孕妇足月羊水,50 mL/例,用于分离培养羊水干细胞,同时留取其产后脐静脉用于分离培养内皮细胞,取前均获孕妇知情同意.方法:①贴壁法分离培养羊水干细胞,达80%融合时胰酶消化传代,取传至第3代细胞,调整细胞密度为5×10~8L~(-1),分为2组:缺氧羊水干细胞组通入体积分数为2%O_2+体积分数为5%CO_2+体积分数为93%N_2,常规羊水干细胞组通入体积分数为5%CO_2+体积分数为95%空气,两组细胞37℃培养24 h,收集各自培养上清液及细胞以备分析.②取体外分离培养的第2代人脐静脉内皮细胞,以2×10~4细胞/孔的密度接种于12孔板,分为3组:对照组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液2 mL,常规羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL+羊水干细胞培养液1 mL,缺氧羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL+缺氧诱导羊水干细胞培养液1 mL,培养3d,加入10 μg/L肿瘤坏死因子α诱导细胞凋亡.主要观察指标:流式细胞仪测定羊水干细胞表面抗原表达,ELISA法测定羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子情况,RT-PCR法测定细胞因子mRNA的表达,检测内皮细胞增殖率及凋亡率.结果:培养7 d后羊水干细胞呈长梭形,以漩涡状、辐射状排列,第3代羊水干细胞呈CD29~+,CD105~+,CD34~-.常规培养的羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子;缺氧诱导条件下血管内皮细胞生长因子水平明显增加(P＜0.01),其mRNA表达明显上调(P＜0.05),而肝细胞生长因子含量及mRNA的表达均无明显变化(P＞0.05).与对照组比较,培养3 d后常规羊水干细胞组、缺氧羊水干细胞组内皮细胞数均明显增加(P＜0.05),肿瘤坏死因子α诱导凋亡24 h后内皮细胞凋亡率均明显降低(P＜0.05),且缺氧羊水干细胞组变化幅度大于常规羊水干细胞组(P＜0.05).结论:羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子,羊水干细胞培养液能促进内皮细胞增殖,抑制内皮细胞凋亡.经缺氧处理后,羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子的能力增加,对内皮细胞的增殖和凋亡干预作用增强.     

缺氧与复氧对脑动脉内皮细胞一氧化氮合酶Ⅲ表达的影响

目的：用原代培养的脑动脉内皮细胞(CAEC)进行缺氧、复氧，观察一氧化氮合酶Ⅲ(NOSⅢ)基因表达的变化，探讨缺氧、复氧影响NO生成的分子机制。方法：将原代培养的CAEC进行缺氧1h，复氧2、6、12和24h，用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法检测NOSⅢ mRNA和蛋白质表达的变化。结果：①CAEC缺氧1h，NOSⅢ mRNA和蛋白质表达明显高于正常对照组；②缺氧1h后复氧2、6和12h，NOSⅢ mRNA和蛋白质表达下调，其中复氧6h，其表达降至最低，24h后表达恢复至正常。结论：缺氧引起脑动脉内皮细胞NOSⅢ基因表达上调，而复氧使其表达明显下调。     

辛伐他汀对炎症状态下人腹膜间皮细胞促纤维化细胞生长因子TGF-β1和CTGF表达的影响

目的探讨辛伐他汀对体外培养的人腹膜间皮细胞在肿瘤坏死因子-a（tumor necrosis factor-a,TNF-a）诱导后转化细胞因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）表达的影响。方法胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离间皮细胞进行原代培养并传代,分为五组（每组设3个样本）：空白对照组（完全培养液）、单纯TNF-a（1000ng/L）诱导组和TNF-a（1000ng/L）诱导加低、中、高剂量辛伐他汀（2.5、5和10μmol/L）组。采用MTT（单四唑）检测各组间皮细胞的活性;半定量RT-PCR检测细胞内TGF-β1和CTGFmRNA表达;ELISA检测细胞上清液中TGF-β1和CTGF的蛋白质水平,细胞沉淀用BCA蛋白检测方法测定细胞蛋白质含量,用以校正ELISA结果。结果辛伐他汀能显著改善TNF-a诱导后人腹膜间皮细胞的活性（P〈0.05）,并能显著降低TNF-a诱导后人腹膜间皮细胞TGF-β1和CTGF的表达（P〈0.05）,两者在蛋白质和基因水平均呈剂量依赖关系。结论辛伐他汀能抑制炎症状态下人腹膜间皮细胞TGF-β1和CTGF的表达。     

不同质量浓度时转化生长因子β1将如何诱导大鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞的分化

背景:在内膜损伤后炎症反应的过程中,间充质干细胞可以从骨髓释放到病灶处,参与损伤修复.但目前尚缺乏在细胞水平对转化生长因子β1如何促进骨髓间充质干细胞转化为平滑肌样细胞的分子机制研究.目的:揭示体外实验条件下,血管急性损伤时不同质量浓度转化生长因子β1如何诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,体外诱导细胞观察,于2008-01/2009-05在上海交通大学医学院附属第九人民医院SPF级实验动物中心和上海交通大学医学院附属第九人民医院组织工程实验室完成.材料:雄性SD大鼠24只,随机分为正常对照组、模型组,12只/组.另取4周龄雄性SD大鼠6只,用于分离制备骨髓间充质干细胞.方法:①模型组大鼠建立颈总动脉急性损伤模型.取正常对照组及模型组大鼠损伤后1,3,7 d的血清,运用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中转化生长因子β1的水平.②第1次传代后的大鼠骨髓间充质干细胞以(1.0～3.0)×10~5个/100 mm培养皿的密度接种,设立2组:常规培养组仅加入含体积分数为20%的胎牛血清高糖DMEM基础培养液;转化生长因子β1诱导组在常规培养组基础上,分别给予1,3,5,10 μg/L转化生长因子β1诱导1周.主要观察指标:损伤后血清中转化生长因子β1的表达;相差倒置显微镜观察诱导后细胞形态学变化:平滑肌细胞标志物α-肌动蛋白的表达.结果:①正常对照组大鼠血清中转化生长因子β1的质量浓度较低;模型组大鼠损伤后1 d血清中转化生长因子β1的质量浓度即已升高,损伤后3 d达高峰,损伤后7 d明显下降,但仍未完全恢复到基础水平.②骨髓间充质干细胞经转化生长因子β1诱导1周后,细胞融合成片,形成峰谷样外观.③免疫细胞化学检测结果显示,与常规培养组比较,1,3,5,10 μg/L转化生长因子β1诱导组平滑肌细胞分化率均明显增加,尤其是5,10μg/L转化生长因子β1诱导组差异有显著性意义(P＜0.01).实时定量PCR结果与免疫细胞化学检测结果相似.结论:急性血管损伤后大鼠血清中转化生长因子β1呈高表达,并在损伤后3 d达高峰.在体外,经类似此高峰浓度的转化生长因子β1诱导后,对骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化有较好的促进效应.     

肌腱细胞转化生长因子β及其受体表达:6-磷酸果糖的抑制效应

背景:转化生长因子β在肌腱愈合与粘连形成中具有重要的作用,抑制转化生长因子β及其受体表达可起到一定的防止肌腱术后粘连作用.目的:探讨转化生长因子β天然抑制剂6-磷酸果糖对兔屈趾肌腱腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞转化生长因子β及其受体的影响.方法:取兔屈趾肌腱分离培养腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞.3种细胞分别加入6-磷酸果糖(实验组)或不加6-磷酸果糖(对照组)培养.采用酶联免疫吸附实验定量检测转化生长因子β及其受体的表达,原位杂交和免疫组织化学观察观测转化生长因子β1的表达. 结果与结论:实验组细胞转化生长因子β及其受体的表达均较对照组下降(P < 0.05).实验组3种细胞阳性转化生长因子β1 mRNA表达率及细胞内转化生长因子β1 mRNA表达强度均较对照组明显降低(P < 0.05).免疫组化显示加入6-磷酸果糖培养后,3种细胞转化生长因子β1表达均明显降低.