PCR-SSO流式荧光微珠法HLA-A~＊02高分辨分型检测模棱两可结果的统计分析

背景：由于HLA的复杂多态性,实际分型过程中难免会出现一些结果判读模棱两可现象。目的：统计分析基于PCR-SSO流式荧光微珠HLA-A＊02高分辨分型方法的模棱两可组合结果种类、比例,探讨解决模棱两可解决方法,提高高分辨分型比例。方法：对河南骨髓库捐献者1100人份HLA分型结果进行统计分析,计数法进行分类统计分析软件给出的包含HLA-A＊02：01／02：09模棱两可组合代码,计算百分比;与确认为A＊02：09的基因多态性分布进行比对,找出与A＊02：09关联性较强的等位基因,用补充实验进行复核、确认,建立A＊02：01／02：09模棱两可组合的判读方法。结果与结论：1039例有效数据中包含A＊02：01／02：09模棱两可组合279例（279/1039,26.853%）,代码种类19种,检出比例较高的有DMDC,DYVK,GMDD,GMDE;34例确认为A＊0209的基因多态性统计显示A＊0209的出现与A＊11：01（0.1471）B＊07：02（0.2647）、DRB1＊01：01（0.2647）、DRB1＊03：01（0.1176）有较强关联,选出高风险标本38例,经检测外显子1～7,并用SBT复核确认有1例结果为A＊02：09（代码组合为GMDC）,其余241例未检出A＊02：09。提示A＊02：09的出现与B＊07：02、DRB1＊01：01、DRB1＊03：01有较强关联,重点对这些关联标本进行外显子1～7检测,可有效地检出A＊02：09。通过统计分析制定合理的判定规则和必要的复核实验可有效地简化操作程序,节省时间,降低费用,提高高分辨比例。     

福建地区造血干细胞捐献者HLA等位基因频率分析

目的了解福建地区HLA-A、B、DRB1等位基因分布的特征。方法采用PCR-SSP和PCR-SSO方法对中华骨髓库福建省分库13817名造血干细胞捐献者样本进行HLA-A、B、DRB1等位基因分型分析。结果HLA-A、B、DRB1等位基因频率较高的分别为:A*11、A*02、A*24、B*40、B*58、B*15、DRB1*04、DRB1*12、DRB1*09。结论福建地区人群HLA-A、B、DRB1等位基因频率具有较丰富的多态性。     

新疆塔吉克族人群HLA-A、B、DRB1等位基因遗传多态性分析

目的研究新疆塔县自治区的塔吉克族人群的HLA等位基因的分布和多态性。方法采用PCR-SSP的方法对500份地处海拔3 000 m以上的塔吉克族聚居地无血缘关系的塔吉克族人群血液标本进行HLA-A、B、DRB1位点等位基因分型分析,并对分型结果做统计学分析。结果 500份标本中HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1座位分别检出17、25、13个等位基因,HLA-A频率较高的等位基因为A*02、A*03、A*24,频率分别为24.73%,15.31%和14.82%;HLAB频率高的有B*51、B*35、B*52,频率分别为20.88%,13.73%和12.65%;HLA-DRB1频率高的有DRB1*13、DRB1*04、DRB1*15,频率分别为15.98%,14.02%和13.63%,并将结果与中国南北方汉族人和回族及维吾尔族等位基因频率的对比。结论获得了中国新疆塔吉克族人群HLA-A、B、DRB1等位基因的分布特征,新疆塔吉克人群等位基因频率分别最高的前5位是A*02、A*03、A*24、A*01、A*11、B*51、B*35、B*52、B*27、B*13、DRB1*13、DRB1*04、DRB1*15、DRB1*09、DRB1*07。塔吉克族人群A*03、A*01、B*52、B*27和DRB1*13的等位基因频率明显较高。     

36380名河北汉族HLA供者基因多态性及其分布特征

目的了解河北省汉族人群人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1基因多态性及分布特征。方法采用序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应(PCR-Sequence Specific Oligonueleotide Probing,PCR-SSOP)方法,对36 380名河北汉族捐献造血干细胞健康志愿者的HLA-A、B、DRB1基因作低分辨基因分型检测,采用方根法计算HLA-AB、DRB1基因频率,并进行群体比较。结果河北汉族人群中共检出18个HLA-A基因43个HLA-B基因和14个HLA-DRB1基因,呈现较高的基因多态性,包括过去很少被检测到的HLA-A*25,A*74,B*42,B*53,B*73,DR*18。,其中A座位最常见基因依次为:A*02、A*11、A*24、A*30、A*01、A*03、A*33 B座位最常见基因依次为:B*13、B*1501(B62)、B*51、B*4002(B61)、B*4001(B60)、B35,B46DRB1座位最常见基因依次为DRB1*15、DRB1*07、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*04、DRB1*11和DRB1*14,结论河北汉族人群HLA-A、B、DRB1基因分布有自己的特点,各基因频率介于南北汉族之间,但更接近于中国北方汉族人群,符合地域分布特征。     

山东省汉族人群HLA-A、B、DRB1位点基因多态性研究

目的分析山东省汉族人群HLA-A、B、DRB1位点基因多态性,获得更完整、准确的群体HLA分子遗传学数据。方法应用PCR-SSP及SSOP技术对7418名山东省汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA-A、B、DRB1位点基因分型。结果共检出低分辨HLA-A基因18种,B基因44种,DRB1基因13种,其中包括一些以前国内未检出的低频率基因。山东汉族人群最常见的HLA基因为A*02、B*13和DRB1*15,其相应基因频率分别为0.2883、0.1431和0.1762;山东汉族人群最常见的A-B单倍型为A*30-B*13,频率为0.0896,最常见的A-B-DRB1单倍型是A*30-B*13-DRB1*07,频率为0.0743。结论山东省汉族人群HLA-A、B、DRB1基因具有显著多态性,大样本和DNA分型有助于低频率基因的检出,适当扩大造血干细胞库志愿捐献者登记人数及各地重新进行HLA多态性分析实有必要。     

江苏骨髓分库汉族造血干细胞捐献志愿者HLA-A、B、DRB1基因多态性和单倍型研究

目的分析中国造血干细胞捐献者资料库(简称江苏分库)汉族人群中HLA-A,B,DRB1基因多态性和单倍型的分布特征。方法用PCR-SSP和PCR-SSOP基因分型技术对江苏分库20 248名无关志愿者作HLA-A、B、DRB1低分辨基因分型,以直接计数法计算等位基因频率,应用Arlequin 3.01软件以最大似然法分析单倍型频率。结果江苏分库汉族志愿者HLA抗原频率分布符合Hardy-Weinberg平衡;共检出HLA-A位点等位基因18个,B位点等位基因34个,DRB1位点等位基因13个;A位点频率最高的是A*02(29.6%),B位点频率最高的是B*15(14.4%),DRB1位点频率最高的是DRB1*09(16.2%);频率最高的HLA-A,-B,-DRB1单倍型是A*30-B*13-DRB1*07(6.92%),频率最高的HLA-A、B单倍型是A*30-B*13(8.04%),频率最高的HLA-B,DRB1单倍型是B*13-DRB1*07(8.07%),频率最高的HLA-A、DRB1单倍型是A*02-DRB1*09(7.70%)。结论对江苏分库汉族人群HLA的分布状况的了解,有助于指导临床寻找HLA匹配的无关骨髓供者,为HLA与疾病相关研究和我国人群群体遗传学研究等提供了有意义的基础性资料。     

云南地区人群HLA-A、B、DRB1等位基因遗传多态性的分析

目的了解中国造血干细胞捐献者资料库云南省分库HLA-A、B、DRB1基因多态性,分析云南地区人群HLA-A、B、DRB1等位基因频率特征。方法采用流式序列特异性寡核苷酸探针(PCR-sequence specific oligonucleotide probes,PCR-SSOP)结合直接测序法(PCR-sequence based typing,PCR-SBT)方法,对来自中国造血干细胞捐献者资料库云南分库的1 000名无血缘关系的捐献者进行基因分型,运用方根法计算HLA-A、B、DRB1基因频率,并与其他人群进行比较。结果在云南地区人群中共检出68种HLA基因特异型。其中HLA-A位点18个,HLA-B位点37个,HLA-DR位点13个。A*11(34.66%)、A*02(34.2%)和A*24(19.63%)3个等位基因为云南分库捐献者HLA-A座位的主要等位基因;B*46(12.83%)、B*40(60)(10.9%)和B*15(62)(9.78%)为HLA-B座位的主要等位基因;HLA-DRB1座位以DRB1*12(16.7%)、DRB1*15(16.46%)、DRB1*09(13.46%)和DRB1*04(12.77%)4个等位基因频率为高。最常见的A-B-DRB1单倍型是A*02-B*46-DRB1*09,频率是3.76%。结论云南地区人群的HLA基因多态性与南方汉族接近,但有其自身的一些特点。有必要在本地区开展造血干细胞捐献者的招募工作。     

中国满族人群HLA-A、B、DRB1基因和单倍型的多态性分析

目的研究中国满族人群HLA-A、B、DRB1等位基因和单倍型的多态性。方法根据2 183名满族骨髓捐献者的HLA-A、B、DRB1基因分型数据,采用最大似然性方法计算HLA-A、B、DRB1等位基因和单倍型频率。结果满族人群中共检出18个HLA-A、44个HLA-B和15个HLA-DRB1等位基因,其常见等位基因为A*02、A*11、A*24、A*30、A*33、B*13、B*35、B*46、B*51、B*40(B60)、B*40(B61)、B*15(B62)、DRB1*04、DRB1*07、DRB1*08、DRB1*09、DRB1*11、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14和DRB1*15。A*30-B*13、A*02-DRB1*15、B*13-DRB1*07和A*30-B*13-DRB1*07分别为其最常见A-B、A-DRB1B-DRB1和A-B-DRB1单倍型,31条A-B、24条A-DRB1和27条B-DRB1单倍型频率≥0.01,32条A-B-DRB1单倍型频率≥0.005。14条A-B、3条A-DRB1、14条B-DRB1和38条A-B-DRB1单倍型呈现强连锁不平衡格局(ALD≥0.40)。结论中国满族人群HLA-A、B、DRB1等位基因和单倍型的分布比较接近北方汉族人群并具有其自身分布特点。     

基于二代测序的HLA-Ⅱ类等位基因多态性研究及等位基因丢失防范策略

目的：研究二代测序技术（NGS）检测深圳地区随机健康无关汉族人群HLA-DRB1、DQB1、DQA1、DRB3、DRB4、DRB5、DPA1、DPB1等位基因多态性的精确性,探讨HLA-DRB1等位基因丢失的原因及室内关键质控体系建立策略。方法：采用Mi Seq DxTM NGS平台对1 012例样本完成HLA-II类等位基因分型。对质控体系软件提示的疑难样本和HLA-DRB1纯合子样本采用PCR-SSOP法或PCR-SBT法进行确认。结果：检出HLA-DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1、DPB1等位基因分别有45、7、5、7、17、21、10、27种。常见等位基因（频率>10%）有HLA-DRB1*09:01(17.09%)、15:01(10.72%);DRB3*02:02(25.99%)、03:01(10.18%);DRB4*01:03(36.46%);DRB5*01:01(15.42%);DQA1*01:02(20.01%)、03:02(17.19%);DQB1*03:01(19.47%)、03:03(17.98%)、05:02(11.66...     

中国人群人类白细胞抗原A、B和DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的鉴别

背景:人类白细胞抗原基因测序分型中,当某些等位基因间的差异碱基位于测序范围外时,无法得到清晰的等位基因结果.目的:分析中国人群人类白细胞抗原A,B,DRB1基因测序分型中模棱两可等位基因的分布规律,探讨其在中华骨髓库大样本人类自细胞抗原A、B、DRB1基因的测序分型中的解决方案.设计、时间及地点:采用随机抽样方法对研究样本进行人类白细胞抗原A、B、DRB1基因的测序分型,并对其中的模棱两可等位基因进行验证性实验,于2006-01/2008-06在深圳市血液中心完成.材料:658名深圳骨髓库汉族供者乙二胺四乙酸盐抗凝血5 mL.方法:采用聚合酶链式反应-测序分型方法对658名深圳骨髓库供者的人类白细胞抗原A、B和DRB1基因进行高分辨分型,并采用针对相应位点的高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物方法对其中由于碱基差异位于检测区外而产生的模棱两可等位基因进行鉴别.主要观察指标:模棱两可等位基因的分布及确认.结果:658份标本中,人类白细胞抗原A、B和DRB1三个基因座的模棱两可等位基因分别为9个(2种)、140个(5种)、406个(8种),占等位基因总数的14.06%(565/3 948).高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物鉴定结果显示,中国报道的DRB1*1401被全部确认为DRB1*1454;12例B*0705/B*0706中,有1例被确认为B*0706,其他13种等位基因的鉴定结果分别为A*6801、A*7402、B*2705、B*3501、B*4402、B*5801、DRB1*0101、DRB1*0406、DRB1*0803、DRB1*1101、DRB1*1201、DRB1*1302和DRB1*1502.结论:在中华骨髓库大样本人类白细胞抗原基因的测序分型中可以应用直接鉴别的方法区分模棱两可等位基因,但在临床移植前的高分辨确认试验中则需要采用实验方法进行精确分型.     

中华骨髓库造血干细胞捐献志愿者HLA基因分型中模棱两可结果解决方案的探讨

目的 探讨中华骨髓库造血干细胞捐献志愿者HLA基因分型中模棱两可结果的解决方案。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)-测序分型技术(SBT)对20621名中华骨髓库供者的HLA-A、B、DRB1基因进行高分辨分型，并对其中的模棱两可分型结果进行精确分型。根据精确分型后的HLA等位基因频率计算模棱两可结果中真基因型的相...     

反向PCR—SSOP技术行HLA—AB分型与临床应用

建立快速,准确的DNA分型技术并用于临床移植前HLA-AB配型,以弥补血清学分型技术的局限性。采用反向聚合酶链反应-序列特异寡核苷酸探针杂交技术（反向PCR-SSOP）进行DNA分型,可检出HLA-A（*0101-8001）和B（*07021-8201）等等位基因。结果表明,发现利用反向PCR-SSOP技术对所有样本分型均获成功,无假阳性和假阴性结果出现;美国洛杉矶加州大学（UCLA）质控细胞DNA分型结果与UCLA公布的测序结果一致。血清学与基因分型相比。血甭学结果HLA-A错检率6.4%和HLA-B错检率为7.4%。2例白血病病人分别有一个HLA抗原血清学方法不能检出。结论提示,反向PCR-SSOP技术用于HLA分型分辨率高,简单快速。结果直观、准确。分型结果较血清学方法更加精确,可适用于临床应用。     

High-resolution HLA-A*0201 subtyping using directed heteroduplex analysis.

HLA-A02* has become an important target for cytotoxic T lymphocyte-based immunotherapy reflecting the high prevalence of this allele in patient populations. There are at least 26 different A*02 alleles, and their subtype specificity has significant functional implications for T-cell-mediated recognition of immunologic targets. We have developed a novel method for HLA-A*02 allelic screening using directed heteroduplex analysis (DHDA). DNA samples from Epstein-Barr virus (EBV)-transformed B lymphoblastoid cell lines (EBV-B) representing 10 different HLA-A*02 alleles (0201, 0202, 0204, 0205, 0206, 0208, 0210, 0211, 0216, 0217) were prepared. In addition, DNA was prepared from 81 individuals representing a wide variety of A*02 subtypes previously determined by sequence specific primer (SSP) polymerase chain reaction (PCR) including individuals heterozygous for two A*02 specificities. Probes and samples were generated by PCR amplification using HLA-A*02 specific primers encompassing exons 2 and 3, where most of the functionally significant allelic polymorphism is clustered. DHDA was performed by generating heteroduplex molecules composed of a fluorescein-labeled allelic probe sequence and an unlabeled allelic PCR product. Gel retardation was consistent for allele-probe combinations. We were able to identify several A*02 alleles prepared from EBV-B cell lines that, when used as probes, had very impressive specificity and sensitivity. Combinations of two probes were identified (0205 + 0211 and 0208 + 0211) that allowed differentiation of A*0201 alleles from all other A*02 alleles tested. All samples typed by probe combinations had DHDA typing and SSP typing confirmed by DNA sequencing. This study expands the molecular typing repertoire available to the modern HLA laboratory, and shows that DHDA has significant promise as a reliable screening method for HLA A*02 subtyping.     

WHO HLA命名委员会命名的新等位基因HLA-A*24:327序列分析及确认

目的 发现一个人类白细胞抗原(HLA)-A新等位基因并对其核苷酸序列进行分析及确认。方法 采用序列特异性寡核苷酸探针技术(SSO)对2015年中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)陕西分库入库数据进行HLA常规检测,针对罕见结果进一步选择多聚酶链反应-测序(PCR-SBT)和组序列特异性引物(GSSP)进行确证试验,明确突变位点。结果 SSO分型结果显示为罕见等位基因,经PCR-SBT复核无完全匹配结果,提示疑似新等位基因,经GSSP确证发现该基因与同源基因HLA-B*24:02:01:01相比,在第3外显子544位置发生碱基变异由G>A,该突变造成氨基酸序列158位由丙氨酸(GCC)变成苏氨酸(ACC)。结论 确认了一个新的HLA-A等位基因,2015年12月31日被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA-A*24:327。     

HLA新等位基因HLA-A~*2451的认定

目的发现和认定1个HLA新等位基因。方法应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因,PCR产物测序和基因克隆DNA测序,通过软件分析基因序列及与最同源HLA等位基因序列的差异。结果检出1样本,其HLA-A位点显示出多种不一致的结果,其中包括与已知所有HLA-A等位基因谱型不一致的新谱型,其HLA-A位点第3外显子序列与所有已知HLA-A等位基因序列不一致。软件分析表明该基因序列与同源性最高等位基因A*2415的差异只是在外显子3区域中的363位碱基发生了G→A1个碱基替代,并导致相应的121密码子由ATG(M)→ATA(I)。结论该等位基因为HLA-A位点的1个新等位基因,已被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*2451。     

HLA-Cw位点低分辨基因分型"纯合子"的等位基因特性研究

目的 研究HLA-Cw位点低分辨基因分型"纯合子"的等位基因特性,为临床移植配型提供精确资料.方法 在43例血缘关系造血干细胞移植(HSCT)供受者中,对中国最常见的低分辨基因分型Cw*03和Cw*07的"纯合子"个体采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)高分辨基因分型方法 进行等位基因定型,并采用自主研制的三维结构匹配软件系统(HLA StrucMark version1.0)对其等位基因产物进行三维结构匹配,以预测不同分辨率分型结果 对移植物抗宿主病(GVHD)发生的影响.结果 低分辨基因分型Cw*03、Cw*07"纯合子"个体的高分辨基因分型结果 显示Cw*03及Cw*07的纯合子分别为14%和43%,其余均为Cw*03及Cw*07杂合子个体.可见其低分辨基因分型易造成供受者问等位基因的错配;在有家系校正的情况下,标本的低分辨模糊结果 可以通过家系遗传分析来校正定型;在无家系校正的情况下,应通过高分辨基因分型来确定等位基因,三维结构差异分析则显示这些错配有可能造成HSCT后GVHD的发生.结论 当低分辨基因分型结果 只出现Cw位点"纯合子"时,有家系的标本应当以家系分型结果 校正定型,无家系校正的标本应当用高分辨基因分型方法 进行核实,从而为临床移植提供准确的配型报告,以防止无关供-受者HSCT后因等位基因错配而引起的严重GVHD.     

PCR—SBT法HLA基因分型模棱两可结果的判读及解决对策

目的研究PCR—SBT法HLA基因分型结果判读中出现的模棱两可问题并提出解决策略。方法对306名随机抽取的组织配型患者的DNA采用PCR-序列特异性引物（Sequence Specific Primer,SSP）低分辨方法检测,同时采用PCR—SBT法进行HLA—A,B,DRB1高分辨基因分型。PCR—SBT法模棱两可结果用PCR—SSP高分辨方法复核确认。结果所有306例检测标本的高低分辨血清学抗原一致,经PCR—SBT基因测序方法检测有111份模棱两可结果,占36．3％（111／306）。其中HLA—A座位有30对等位基因存在模棱两可结果,占所有检测标本等位基因总数的3．3％;HLA—B座位有66对,占7．2％;HLA—DRB1座位有36对,占3．9％。所有模棱两可标本经PCR—SSP HLA基因高分辨分型试剂PCR—SSP等方法复核确认。结论针对PCR—SBT法进行HLA—A,B,DRB1高分辨基因分型模棱两可结果所建立的解决策略,对于提高HLA数据分型的速度和分型准确性有重要意义。     

HLA typing and transplantation

Clinical trial of organ transplantation was renal transplantation by Voronoy at 1936. The discovery of HLA in the 1950s was one of the most important new findings in the area of transplantation. Nowadays, developing HLA genotyping methods, the serum analysis does not use for donor and recipient HLA typing but for cross-matching test. Because each of HLA genotyping methods has its merits and demerits, it is important to choice right methods for avoiding type error. PCR-Luminex method using fluorescence microsphere was developed for high-resolution HLA-A, HLA-B and HLA-DRB1 genotyping in the Japanese population. This genotyping method allows to define all the possible combinations of alleles at each loci existing in Japanese at the four-digital level. In hematopoietic stem cell transplantation, to match high resolution level of HLA between donor and recipient lead an improvement of recipient's survival. In organ transplantation, removed organ has to be so immediately transplanted into recipient that no time is left for HLA genotyping. In order to have good survival of transplanted organ, HLA, cytokine promoter lesion and immunoglobulin like receptor genotyping might be helpful. We focused on this review at HLA genotyping, especially new SSO methods.