超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠骨骼肌

目的 探讨增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性.方法 20只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为裸质粒组(P)、质粒 超声组(P U)、质粒 微泡组(P M)和质粒 超声 微泡组(P U M)共4组进行实验.选择增强绿色荧光蛋白质粒与白蛋白微泡相混合,以超声介导白蛋白微泡破裂的方法 对大鼠骨骼肌行基因转染,转染7 d后,荧光显微镜下观察质粒在大鼠脊斜肌组织中的表达情况.结果 P、P M组大鼠脊斜肌组织中均未见增强型绿色荧光蛋白表达;P U组可见少量微弱绿色荧光,荧光强度较P和P M组明显增强(P<0.05),P U M组可见明显特异性增强型绿色荧光蛋白表达,荧光强度约为P、P M组的10倍,P U组的3倍(P<0.05);P U M组转染率为(42.72±10.07)%较之P U组(13.62±6.17)%明显增高(P<0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂造成的脊斜肌组织毛细血管通透性的增加,是血管内基因成功跨越内膜屏障的主要途径之一.     

脉冲超声辐照微泡增强脂质体介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨脉冲超声辐照微泡超声造影剂提高脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒在肝癌,细胞(HepG2)中转染率的可行性.方法 将HepG2接种在24孔板中,随机分为以下6组:①空白对照组;②质粒+脂质体组;③超声+质粒组;④超声+质粒+微泡组;⑤超声+质粒+脂质体组;⑥超声+质粒+脂质体+微泡组.荧光显微镜及流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白表达及转染效率;MTT法检测此转染方法对HepG2生长活性的影响.结果 超声+质粒+脂质体组的转染效率最高,并对细胞活性无明显影响;而超声+质粒+脂质体+微泡组转染效率与超声+质粒+脂质体组比较差异无统计学意义(P＞0.05),但细胞活性与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脉冲超声辐照可介导基因转染,并能提高脂质体基因转染效率.同时,在一定条件下,超声微泡造影剂可提高超声介导基因转染效率,此方法可为基因转染提供新的思路.     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。     

超声微泡造影剂介导EGFP对兔视网膜的转染效率

目的 探讨在不同能量超声和一定剂量微泡作用下,超声微泡造影剂介导下增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒对兔视网膜转染的效率、安全性以及可行性.方法 将30只新西兰大白兔随机分为6组:质粒组(A组)、质粒+微泡组(B组)、质粒+超声照射组①(C组)、质粒+超声照射组②(D组)、质粒+微泡+超声照射组①(E组)、质粒+微泡+超声照射组②(F组).将1 ml pEGFP-C1质粒与1 ml SonoVue微泡造影剂混合,由耳缘静脉注入,分别用0.5、1.0 W/cm2超声波辐照眼球.转染7天后行视网膜光镜及透射电镜检查,观察质粒、微泡及超声照射对视网膜有无损害,并在荧光显微镜下观察pEGFP-C1质粒表达情况.结果 光镜及透射电镜结果显示质粒、微泡及超声照射对视网膜无损害.A～D组均可见少量绿色荧光表达(P均＞0.05),E、F组的荧光表达较强,明显高于其他4组(P均＜0.05),E、F组荧光强度差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 在一定能量的超声照射下,超声微泡造影剂能够提高携带EGFP质粒在兔视网膜的转染效率.     

评价超声联合白蛋白微泡造影剂实现基因转染靶向性的研究

目的 评价超声联合白蛋白微泡造影剂实现基因转染的靶向性.方法 选择增强型绿色荧光蛋白质粒为报告基因,经股静脉输入黏附质粒的白蛋白微泡的同时在大鼠背部脊斜肌区域经皮辅予一定强度的超声照射对大鼠脊斜肌行基因转染,转染7 d后,取脊斜肌、肝、肾、心肌组织快速冷冻切片,荧光显微镜下观察各组织内的荧光表达.结果 脊斜肌组织中可见较多特异性绿色荧光,多位于微血管周围,荧光强度较其余组织明显增强(P<0.05),肝脏、肾脏组织中见少量特异性绿色荧光,肝脏荧光强度约为肾脏的4倍(P<0.05),心肌组织中未见特异性绿色荧光.结论 静脉注射黏附质粒的微泡声学造影剂同时经体表给予一定强度的超声辐照,可以较好地实现基因的靶向转染.     

超声波介导微泡破裂促EGFP基因转染大鼠脑组织的实验研究

目的 探讨超声波介导微泡造影剂破裂促外源基因在中枢神经系统转染的可行性.方法 15只大鼠分3组,1组经股静脉输入含绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)的造影剂0.8 ml,立即用超声波照射大鼠颅骨3 min;第2组输入相同的造影剂0.8 ml,不采用超声波照射;第3组输入不含造影剂的pEGFP 0.2 ml,立即超声波照射3 min.48 h后处死大鼠,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 只在股静脉输入含pEGFP的造影剂,并经超声波照射的大鼠微血管壁上观察到绿色荧光蛋白表达.结论 以微泡造影剂为基因载体,通过超声波靶向破坏微泡,有可能在脑血管内皮细胞中获得基因转染.     

超声介导击破微泡增强型绿色荧光蛋白转染正常大鼠关节滑膜组织

目的 探讨超声击破微泡介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染大鼠关节滑膜组织的可行性。 方法 将20只正常清洁级Wister大鼠分为4组,每组5只(10个膝关节)。单纯质粒组:10 μg EGFP注射入大鼠关节腔内;超声+质粒组:EGFP注射入大鼠关节腔内,超声持续照射10 min;微泡+质粒组:300 μl SonoVue与10 μg EGFP混合注射入大鼠关节腔内;超声+微泡+质粒组:将300 μl SonoVue与10 μg EGFP混合后注射入大鼠关节腔内,超声持续照射10 min。3天后取出大鼠膝关节滑膜组织,直接贴在载玻片上,在荧光显微镜480 nm波长激发状态下观察EGFP转染效果。 结果 单纯质粒组、超声+质粒组和微泡+质粒组的大鼠膝关节滑膜组织EGFP的荧光强度稍有增强;超声+微泡+质粒组EGFP的荧光强度明显增强。 结论 超声介导微泡可以实现EGFP质粒对正常大鼠关节滑膜组织的转染。     

超声介导白蛋白微泡破裂对外源性基因在ECV304细胞和BALB/c鼠心肌中的表达

目的 探讨经超声介导白蛋白微泡破裂对外源性基因在体外ECV304细胞的转染效率及表达情况和在BALB／c鼠心肌中的表达及显像效果。方法 18只BALB／c小鼠分为裸质粒组（P组）、质粒＋超声介导转化组（P＋U组）、质粒＋白蛋白微泡＋超声介导转化组（P＋M＋U组），每组6只。选择携带增强绿色荧光蛋白基因（EGFP）的质粒DNA并与自制的白蛋白微泡相混，以超声介导白蛋白微泡破裂方法分别在体外对ECV304细胞及体内对BALB／c鼠心肌细胞进行基因转染，并测定基因转染和表达效率。结果 体内和体外研究表明，超声介导的白蛋白微泡破裂组（P＋M＋U组）与P和P＋U组相比可明显提高外源性基因转染及表达效率（P〈0．01）。体外采用频率0．8MHz、声强1．0W／cm^2、10％占空比，并30s两次的超声介导白蛋白微泡破裂可有效稳定地转染EGFP基因在ECV304细胞中的表达，并对细胞无毒副作用；体内超声介导白蛋白微泡破裂后具有良好的心肌灌注显像效果。结论 超声介导的白蛋白微泡破裂是一种安全且有效的基因转染方法，在一定的超声条件下可明显提高外源性基因在体内和体外的转染和表达。     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N1转染小鼠角膜的实验研究

目的 探讨微泡造影剂声诺维联合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染小鼠角膜的转染效率和安全性.方法 小鼠眼前房分别注射生理盐水、质粒+生理盐水、质粒+造影剂、脂质体+质粒等,以50 Hz,2 W/cm2的脉冲波超声辐照质粒+生理盐水和质粒+造影剂眼10 min.术后第1 d、第3 d、第7 d、第14 d和第21 d荧光体视镜观察眼表EGFP表达出现情况,冰冻切片荧光显微镜观察阳性细胞的分布,病理切片观察组织有无损伤.结果 造影剂联合超声辐照组小鼠眼表出现绿色荧光蛋白的弥漫性表达,明显高于单纯超声辐照组和脂质体转染组,其余对照各组眼表均未见绿色荧光.第3 d时的病理切片各组均无异常.结论 声诺维联合超声辐照在体能安全、有效地介导基因转染眼组织.     

超声微泡介导pEGFP-N1质粒转染人牙周膜成纤维细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下,介导质粒pEGFP-N1转染人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的效率及安全性.方法 体外原代培养HPDLFs,以EGFP基因为报告基因,脂质微泡造影剂为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染HPDLFs.实验组超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成不同亚组,对照组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组和脂质体+质粒组.转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP表达.同时用MTT法检测HPDLFs的活力.结果 超声微泡介导的质粒对HPDLFs的转染效率与脂质体介导的质粒转染效率相似,明显高于其他对照组.超声+微泡+质粒组中HPDLFs的活力明显高于脂质体+质粒组.结论 在一定条件下,超声微泡能安全、有效地介导外源基因的转染与表达.     

Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances naked plasmid DNA transfection in rabbit Achilles tendons in vivo

The study was to investigate the probability of increasing the transfection of the gene in tendons by ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD), and to search for the most suitable transfection conditions. A mixture of microbubbles and enhanced green fluorescent protein (EGFP) plasmids was injected into rabbit Achilles tendons by different administration routes and the tendons were ultrasound pulse by different ultrasonic conditions in order to determine the most appropriate conditions. Then, the rabbits were divided into four groups: (1) ultrasound + microbubbles + plasmid; (2) ultrasound+ plasmid; (3) microbubble + plasmid; (4) plasmid only. EGFP expression in the tendons and other tissues, and the damage to tendon and paratenon were all observed. The results showed that EGFP expression in the tendon was higher by ultrasound pulse with 2 W cm(-2) of output intensity and a 20% duty cycle for 10 min. Local injection was determined to be the better administration route. Among the four groups, EGFP expression in Group 1 was higher than that in other groups. EGFP expression was highest on seventh day, then it gradually decrease over time, and lasted more than 56 days. EGFP expression was not found in other tissues. There was no obvious injury caused by UTMD. Under suitable conditions, it is feasible to use UTMD as a safe and effective gene transfection therapy for tendon injuries.     

超声微泡转染前列腺癌细胞的参数筛选

目的观察不同辐照参数下超声微泡对前列腺癌细胞生长及基因转染效率的影响。方法采用噻唑兰比色法检测单纯超声、单纯微泡、超声辐照微泡对前列腺癌细胞生存率的影响。荧光显微镜观察超声微泡介导的质粒为EGFP基因与HSV l-TK基因共表达载体。观察它对前列腺癌细胞PC-3转染后荧光表达情况,Westernblot检测EGFP蛋白的表达情况。结果 MTT显示超声强度为1.0W/cm2,频率为1MHz,辐照时间30s时超声辐照对细胞无明显的抑制作用;采用不同浓度的微泡对前列腺癌细胞PC-3作用24h后,各实验组细胞存活率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);当采用最适的超声辐照时间辐照微泡浓度为10、20、40、80μL时,超声+微泡(80μL)组细胞存活率低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),而10、20、40μL组中细胞生长良好;转染EGFP后48h,在荧光显微镜观察对照组未见荧光表达,其他各组中均有荧光表达,并随着微泡剂量的增加,荧光表达量增多;Western blot检测显示各处理组中均有EGFP蛋白的表达,超声+微泡(20μL)+TK(1μg)组、超声+微泡(40μL)+TK(1μg)组的EGFP蛋白表达明显高于其他各组。结论在最适辐照参数下,超声微泡造影剂能够有效地促进TK基因的转染。     

Augmentation of AAV-mediated cardiac gene transfer after systemic administration in adult rats

Adeno-associated virus (AAV)-6 or -9-pseudotyped vectors are suitable for efficient cardiac gene transfer after intravenous injection in mice. However, a systemic application in larger animals or humans would require very high doses of viral particles. Therefore, the aim of our study was to test if ultrasound-targeted microbubble destruction could augment cardiac transduction of AAV vectors after intravenous administration in rats. To analyze efficiency and specificity of gene transfer, microbubbles loaded with AAV-6 or -9 harboring a luciferase or enhanced green fluorescent protein (EGFP) reporter gene were infused into the jugular vein of adult Sprague-Dawley rats. During the infusion, high mechanical index ultrasound was administered to the heart. Control rats received the same amount of virus without microbubbles, but with ultrasound. After 4 weeks, organs were harvested and analyzed for reporter gene expression. In contrast to low cardiac expression after systemic transfer of the vector solution without microbubbles, ultrasound-targeted destruction of microbubbles significantly increased cardiac reporter activities between 6- and 20-fold. Analysis of spatial distribution of transgene expression using an AAV-9 vector encoding for EGFP revealed transmural expression predominantly in the left ventricular anterior wall. In conclusion, ultrasound targeted microbubble destruction augments cardiac transduction of AAV vectors in rats. This approach may be suitable for efficient, specific and noninvasive AAV-mediated gene transfer in larger animals or humans.     

超声靶向微泡破裂联合PEI增强小鼠EGFP基因心肌转染

目的探讨超声靶向微泡破裂(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)增强BALB/c小鼠心肌绿色荧光蛋白基因(EG-FP)转染的可行性和应用价值。方法实验分为7组:PBS组、裸质粒组、质粒 超声辐照组(P US)、质粒 SonoVue 超声辐照组(P UTMD)、质粒 PEI组(P PEI)、质粒 PEI 超声辐照组(P PEI US)、质粒 PEI SonoVue 超声辐照组(P PEI UTMD)。由BALB/c小鼠尾静脉注入EGFP质粒和SonoVue微泡或PEI的复合物,处理4d后检测心肌基因表达效率及HE染色,并对超声辐照后的质粒完整性进行分析。结果电泳显示超声辐照不会损坏DNA或PEI/DNA复合物。非超声辐照时,EGFP只在心内膜下层表达;而超声辐照时,表达最强的位置为靠近探头的左室前壁;超声联合PEI时,EGFP的分布差异不明显。P PEI UTMD组的转染率最高,荧光强度最强。结论UTMD联合PEI可高效、靶向地将质粒DNA输送至心肌,这种非侵入性的技术在心脏基因治疗上很有前景,有望应用于迅速发展的心脏病基因疗法。     

超声靶向微泡破坏技术介导基因转染的研究进展

基因转染技术的高速发展不仅革新了生物学和医学许多基本问题的研究,也推动了诊断和治疗的进步。基因作为核酸类生物活性大分子,极易在体内降解,因此传递基因的载体尤为重要。超声靶向微泡破坏(UTMD)技术利用超声波和微泡之间的相互作用,以及其产生的生物学效应,使微泡携基因进行转染,并与多种载体联合应用,为疾病的治疗提供了有效手段。本文就UTMD技术介导基因转染的研究进展进行综述。     

新型白蛋白微泡经超声介导破裂促进EGFP基因在Cos-7细胞的表达

目的：根据超声介导白蛋白微泡破裂空化效应可以增加真核细胞膜对大分子(如DNA)通透性的原理，探讨一种新的转基因方法，以便安全有效和定向地转移目的基因。方法：实验中选择绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因，以自制的白蛋白微泡为载体，用超声介导微泡破裂的方法在体外进行Cos—7细胞的基因转化，同时以脂质体为对照，激光共聚焦显微镜和流式细胞计数仪分别定性和定量观察细胞转化效率。锥虫蓝染色观察细胞的活性。结果：体外试验发现0．8MHz、1．0W／cm^2、10％占空比(dutycycle)、60s超声介导10％白蛋白微泡破裂可以有效稳定地转化EGFP基因在Cos—7细胞表达，且对细胞无毒副作用。结论：自制白蛋白微泡是一种安全、有效的新型基因载体，在一定超声条件控制下，能增强基因的转导与表达，有良好的靶向性，提示该技术有应用于临床基因治疗的广阔前景。