兔膀胱移行上皮细胞的体外培养

目的:对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,探索用于泌尿系统组织工程的膀胱移行上皮种子细胞的最佳培养方法。方法:实验于2005-09/2006-01在吉林大学药学院生物工程实验室完成。①取1月龄新西兰大耳白兔,耳缘静脉行空气栓塞处死,超净台内无菌取膀胱。②采用中性蛋白酶分离膀胱各层组织。③胰蛋白酶消化获得膀胱移行上皮细胞。④将获取的膀胱移行上皮细胞分别接种到含体积分数为0.01,0.05,0.1血清的DMEM-F12培养液进行培养。④每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况;分别在第1,3,5,7,9天以四甲基偶氮唑盐法作细胞生长曲线。结果:①原代移行上皮细胞于接种后34～48h贴壁,培养六七天时可达80%融合,呈典型铺路石状。②传代后的细胞生长稳定快速,24～36h贴壁,五六天可达80%融合。③应用四甲基偶氮唑盐法检测不同体积分数血清对移行上皮细胞增殖的影响,显示膀胱移行上皮细胞在含有体积分数为0.05血清的DMEM-F12培养中生长状态最佳。结论:采用中性蛋白酶与胰蛋白酶联合消化法,对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,是一种稳定、快速的膀胱移行上皮细胞的培养方法。     

人绒毛膜滋养层细胞的体外培养

目的 培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法 胰蛋白酶、胶原酶消化绒毛组织，进行原代培养，胰蛋白酶消化法传代培养，光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果 原代培养滋养层细胞3h后开始贴壁，18h后全部贴壁，3天可传代，角蛋白、波形蛋白染色细胞纯度达95％以上。结论 胰蛋白酶、胶原酶消化法简便易行，可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞，建立了稳定的人类绒毛膜滋养层细胞体外培养体系。     

大鼠胰腺间质细胞体外培养过程及其形态学特征

目的:对胰腺间质细胞进行原代及传代培养,观察其形态学的变化。以探索一种简单稳定的获取及培养胰腺间质细胞的方法。方法:用机械剪切加胰蛋白酶消化的方法制备SD大鼠胰腺单细胞悬液,取新生SD大鼠1只麻醉断髓处死,体积分数0.75的乙醇浸泡消毒,无菌条件下取出胰腺组织,去除红细胞,剪切,加入胰蛋白酶消化,消化终止后细胞筛过滤,收集滤过的细胞悬液离心,弃上清液,重复1次。收集获得的单个胰腺间质细胞。接种于含体积分数0.1的胎牛血清、0.05g/L的亚胺培南的DMEM/F-12(1∶1)培养基,培养48h后换液,弃上清及悬浮细胞,继续培养48h后,换用含1×10-5mol/L阿糖胞苷的完全培养基培养24h,再换正常培养基继续培养,在培养细胞达到80%～90%的细胞汇合时,按1∶3进行传代培养。测定细胞生长曲线及贴壁率,原代细胞及传代细胞用双硫腙染色,鉴定有无胰腺β细胞。结果:①原代细胞及传代细胞形态学观察:原代培养换液前,显微镜下可见细胞大小不等,悬浮,有较多细胞碎片。48h首次全量换液后,悬浮细胞减少,经3次换液可基本去除。加用阿糖胞苷培养24h,大量细胞相继死亡。至第10-14天,培养细胞明显增加,基本铺满瓶底,以星形、梭形为主,细胞呈放射状或漩涡状生长,部分区域呈灶状。传至第5代细胞出现老化。②细胞生长曲线:细胞从传代后第2天,数量即开始增加,第4天增加幅度最大,至第6天细胞数量最大,以后数量略有下降。传代培养对数增殖期为2-4d,对数增殖期结束后,第6天细胞生长缓慢,进入平台期。③细胞的贴壁率:传代细胞培养2h已有部分细胞贴壁;培养4h贴壁细胞接近50%;培养10h贴壁达79%;培养12h细胞全部贴壁,而且部分细胞开始分裂增殖,细胞形态与原代细胞基本相似。④胰腺β细胞的化学鉴定:对胰腺组织分离所得单个细胞、原代培养细胞及传代培养细胞分别用双硫腙染色。培养前细胞染色,可见少量腥红色细胞,随着培养时间延长腥红色细胞逐渐减少,在原代培养10～14d,腥红色细胞消失,传代培养细胞染色未见腥红色细胞。结论:细胞培养12h全部贴壁,传代培养对数增殖期为2-4d,第6天细胞进入平台期。原代培养胰腺间质细胞形态多样,主要呈梭形,少数呈三角形或星形,贴壁爬行生长,第1周增殖较慢,随后增殖加速,细胞团块多见,偶可见大的圆形细胞生长,核大,胞浆内颗粒多。传代培养,细胞能迅速贴壁生长,细胞形态逐渐均一,主要为梭形、三角形细胞,呈集落样生长,双硫腙染色阴性;但细胞培养至第5代,胞浆颗粒增多,细胞增殖减慢,大部分细胞逐渐老化死亡。     

滋养层细胞的分离培养与鉴定

目的：培养符合实验要求的人绒毛滋养层细胞。方法：胰蛋白酶、胶原酶消化绒毛组织,进行原代培养,用胰蛋白酶消化法进行传代培养并纯化。观察其形态学特征并绘制生长曲线,计算倍增时间。应用光镜、免疫荧光进行细胞鉴定。Tran-swell小室法检测其体外侵袭能力。结果：原代培养滋养层细胞24h贴壁,7~10d首次传代,倍增时间3.42d,细胞表达细胞角蛋白7而不表达波形蛋白。结论：胰蛋白酶、胶原酶消化法可获得符合实验要求的人绒毛滋养层细胞,能建立稳定的人绒毛滋养层细胞体外培养体系。     

大鼠胰腺间质细胞体外培养过程及其形态学特征

目的：对胰腺间质细胞进行原代及传代培养，观察其形态学的变化。以探索一种简单稳定的获取及培养胰腺间质细胞的方法。方法：用机械剪切加胰蛋白酶消化的方法制备SD大鼠胰腺单细胞悬液，取新生SD大鼠1只麻醉断髓处死，体积分数0．75的乙醇浸泡消毒，无菌条件下取出胰腺组织，去除红细胞，剪切，加入胰蛋白酶消化，消化终止后细胞筛过滤，收集滤过的细胞悬液离心，弃上清液，重复1次。收集获得的单个胰腺间质细胞。接种丁含体积分数0．1的胎牛血清、0．05g/L的砸胺培南的DMEM／F—12（1：1）培养基，培养48h后换液，弃上清及悬浮细胞，继续培养48h后，换用含1&;#215;10^-5mol／L阿糖胞苷的完全培养基培养24h，再换正常培养基继续培养，在培养细胞达到80％～90％的细胞汇合时，按1：3进行传代培养。测定细胞生长曲线及贴壁率，原代细胞及传代细胞用双硫腙染色，鉴定有无胰腺β细胞。结果：①原代细胞及传代细胞形态学观察：原代培养换液前，显微镜下可见细胞大小不等，悬浮，有较多细胞碎片。48h首次全量换液后，悬浮细胞减少，经3次换液可基本去除。加用阿糖胞苷培养24h，大量细胞相继死亡。至第10—14天，培养细胞明显增加，基本铺满瓶底，以星形、梭形为主，细胞呈放射状或漩涡状生长，部分区域呈灶状。传至第5代细胞出现老化。②细胞生长曲线：细胞从传代后第2天，数量即开始增加，第4天增加幅度最大，至第6天细胞数茸最大，以后数量略有下降。传代培养对数增殖期为2—4d，对数增殖期结束后，第6天细胞生长缓慢，进入平台期。③细胞的贴壁率：传代细胞培养2h已有部分细胞贴壁；培养4h贴壁细胞接近50％；培养10h贴壁达79％；培养12h细胞全部贴壁，而且部分细胞开始分裂增殖，细胞形态与原代细胞基本相似。④胰腺β细胞的化学鉴定：对胰腺组织分离所得单个细胞、原代培养细胞及传代培养细胞分别用双硫腙染色，培养前细胞染色，可见少量腥红色细胞，随着培养时间延长腥红色细胞逐渐减少，在原代培养10～14d，腥红色细胞消失，传代培养细胞染色未见腥红色细胞。结论：细胞培养12h全部贴壁，传代培养对数增殖期为2—4d，第6天细胞进入平台期。原代培养胰腺间质细胞形态多样，主要呈梭形，少数呈三角形或星形，贴壁爬行生长，第1周增殖较慢，随后增殖加速，细胞团块多见，偶可见大的圆形细胞生长，核大，胞浆内颗粒多。传代培养，细胞能迅速贴壁生长，细胞形态逐渐均一，主要为梭形、三角形细胞，呈集落样生长，双硫腙染色阴性；但细胞培养至第5代，胞浆颗粒增多，细胞增殖减慢，大部分细胞逐渐老化死亡。     

人增生性瘢痕成纤维细胞的改良培养和鉴定

目的:探讨并建立一种简便易行、培养周期短的成纤维细胞改良培养方法.方法:采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离培养人增生性瘢痕成纤维细胞.倒置相差显微镜下观察培养的成纤维细胞形态,进行细胞鉴定,作生长曲线观察细胞增殖能力.结果:采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离人增生性瘢痕成纤维细胞,细胞培养周期短.分离培养的成纤维细胞波形蛋白呈阳性表达.传代培养的成纤维细胞增殖能力强.结论:采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离培养法可以较快、较好地获得稳定培养的增生性瘢痕成纤维细胞,为其形成机制及防治研究提供实验基础.     

体外修复血管平滑肌细胞的方法学研究

目的:采用不同方法体外培养人脐动脉平滑肌细胞,选择以获得体外修复受损平滑肌细胞的最佳方法。方法:实验于2004-12/2005-10在哈尔滨医科大学附属第一医院实验中心卫生部细胞移植重点实验室进行。①取新生儿脐带约5cm长(家属志愿提供)原代分离血管平滑肌细胞;分别用贴块法和胰酶/胶原酶酶解法分离、培养血管平滑肌细胞。②贴块法:将血管平滑肌细胞组织块20%M199完全培养基(200mL/L胎牛血清 10mL/L双抗 5mL/LL-谷氨酰胺)贴壁24h后,补足完全培养基培养;胰酶/胶原酶酶解法:第1步胰酶消化:将脐动脉剪成1mm×1mm大小。装入含2.5g/L胰酶培养瓶中,消化15～30min,加入20%M199完全培养基终止消化。第2步胶原酶消化:将上述处理过的组织块放入含1g/LⅠ型胶原酶的无血清M199培养基中,过夜,离心,收集细胞,以1×104个细胞/cm2密度接种培养皿中,补足20%M199完全培养基培养。③对两种方法培养的细胞生长形态、数量及平滑肌а-肌动蛋白表达情况进行观察和检测。结果:①贴块法:组织块种植后2周时,多数细胞已贴壁伸展。4～6周细胞达80%融合时,镜下成“峰与谷”样,可传代培养,传代间隔期一般是两三周;胰酶/胶原酶酶解法:细胞多为伴有胞质突起的多角形大细胞,达到生长融合时细胞密度低。2周左右细胞融合,可传代培养。传代间隔期一般是一两周。②贴块法获得的细胞初期生长速度慢,但达到融合前细胞数量多,细胞得率高;胰酶/胶原酶酶解法获得的细胞初期生长速度快,群体倍增时间短,但达到融合前细胞数量少于贴块法,细胞得率低。③胰酶/胶原酶法α-肌动蛋白阳性细胞率高于贴块法(93.1%,71.4%,χ2=4.626,P<0.05)。结论:两种方法均可成功培养人血管平滑肌细胞;贴块法合成表型细胞比例大,胰酶/胶原酶酶解法收缩表型细胞比例大,后者所获得的细胞更适合用作修复血管平滑肌细胞的种子细胞。     

腰痛患者肌卫星细胞生物学特性及其鉴定

目的：观察腰痛患者肌卫星细胞体外培养的生物学特性,探讨其在慢性腰痛中肌纤维损伤的修复作用。 方法：取腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致腰痛患者活体竖脊肌组织块,采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法及差速贴壁法纯化肌卫星细胞,进行原代培养及传代培养,观察细胞形态及其传代能力,绘制生长曲线,结蛋白免疫组化染色鉴定肌卫星细胞。 结果： 纯化后肌卫星细胞生长良好,传代培养后增殖速度较原代培养快,6代以前形态较规则,8代以后逐渐老化,结蛋白鉴定呈阳性。 结论：慢性腰痛患者肌卫星细胞体外培养形态与正常人基本相同,但传代能力减弱,可能与修复受损肌纤维有关。     

人脐带Wharton's jelly源间充质干细胞培养中碱性成纤维细胞生长因子的作用

背景;培养脐带源间充质干细胞过程中,细胞形态常易变得宽大不规则,传代不易贴壁,死亡率高,找到一个维持细胞稳定的方法是有必要的.目的:拟采用组织块培养法从人脐带Wharton'sjelly中分离培养问充质干细胞,观察碱性成纤维细胞生长因子对其生物学特性的影响.方法:采用组织块法分离培养和扩增脐带组织间充质于细胞,对照组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清培养,实验组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清+20 pg/L碱性成纤维细胞牛长因子培养.观察组织块游出细胞的时间和细胞形态,每隔3 d或4 d更抉培养液,待细胞达到80%～90%融合时,用0.25%胰酶消化后,按1:2或1:3的比例传代.结果与结论:倒置显微镜下观察对照组中从8～10 d开始有细胞从组织块四周游出贴壁,实验组中从6～8 d开始有细胞从组织块四周游出贴壁.1周后可见多数呈长梭形或扁平形的成纤维样细胞,围绕组织块成旋涡状,前3代细胞形态及传代间隔时间两组基本相同; 3代以后实验组细胞较对照组易于贴壁,传代死亡率低,生长曲线提示增殖能力强.流式细胞术分析两组细胞周期显示第3,6代70%以上的细胞处于G0/G1期,且第3,6代细胞均阳性表达CD29,CD44,弱表达HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA-DR.结果提示采用组织块培养法可从人脐带Wharton'sjelly中分离出具有间充质干细胞特性的细胞,且碱性成纤维细胞生长因子能使细胞从组织块游出时间提前和有助于促使细胞贴壁,一定程度上维持细胞形态稳定性,提高增值能力,并且不改变细胞的表面标志物表达.     

猪膀胱移行上皮细胞培养及其在纤维蛋白凝胶表面生长的评价

目的:探讨猪正常尿路上皮细胞分离、培养、扩增技术;观察利用纤维蛋白胶作为组织工程支架的可行性。方法:实验于2005-04/07在广东省人民医院医学研究中心完成。①采用酶消化法及无血清培养系统体外原代培养膀胱移行上皮细胞。②将体外扩增的膀胱上皮细胞以相同密度分别接种于普通培养板(对照组)和纤维蛋白凝胶包被的培养板(实验组),于接种后4d比较两组细胞克隆形成情况。③再将膀胱移行上皮细胞接种于纤维蛋白凝胶包被的培养板,在不同融合度(70%,100%)时将细胞消化传代,以相同的密度再次接种于纤维蛋白包被的培养板,比较生长于纤维蛋白凝胶表面的、不同融合度的细胞传代后的克隆形成情况。④取对数生长期膀胱移行上皮细胞,以相同密度接种于96孔板,以含不同浓度抑肽酶(0,37.5,75,150,300kIU/mL)的keratinocyte-SFM培养,4d后以四甲基偶氮唑盐法观察比较移行上皮细胞生长情况(不含抑肽酶者为对照组)。结果:①移行上皮细胞生长良好,多次传代后仍扩增迅速。②膀胱移行上皮细胞在培养板和纤维蛋白凝胶表面均生长良好,4d后细胞克隆形成率在纤维蛋白凝胶表面和培普通培养板无明显差异[(8.67±1.45)%,(9.33±1.76)%,P>0.05]。③生长于纤维蛋白凝胶表面的细胞传代后仍有较强的增殖能力,且70%融合组传代细胞克隆形成率显著高于100%组[(18.2±1.08)%,(12.8±1.35)%,P<0.05]。④抑肽酶在300kIU/mL时对细胞生长有显著抑制作用;而在其他浓度时则不明显。结论:①该法培养猪膀胱上皮细胞迅速可靠,多次传代后仍有较强的增殖能力。②细胞在纤维蛋白凝胶表面生长良好,传代后仍然有较强的增殖能力。③纤维蛋白凝胶具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值。     

种子细胞在膀胱重建中的研究进展

膀胱组织工程包括三大要素,即细胞支架、种子细胞和讯息因子,而种子细胞在构建组织工程化器官中有着不可替代的作用,是构建组织器官的基本原材料,选择一种既有良好组织相容性又容易获得的种子细胞成为器官重建工作成败的关键所在.目前常用的种子细胞有膀胱移行上皮细胞、膀胱平滑肌细胞、膀胱移行上皮和平滑肌混合细胞、骨髓间充质干细胞,其中后两种细胞较其他细胞更有优势.种子细胞目前存在的问题:①已分化完全的成熟细胞的来源有限和免疫排斥.②已分化完全的成熟细胞在分化培养过程中只能进行有限的分裂传代,如果达到传代的极限,细胞将衰老并死亡;此外还存在去分化问题.③如何将膀胱移行上皮和平滑肌混合细胞、骨髓间充质干细胞培养成正常膀胱仍需进一步分析.     

组织块法培养成体人牙髓细胞的增殖及分化状态水

背景:人牙髓组织较少,对酶解消化的耐受性较差,经胰蛋白酶和胶原酶分步消化处理后,细胞贴壁数量少,生长缓慢,难以成功传代,组织块酶解法获得的牙髓细胞种类少,活性差.目的:探索组织块培养法在人牙髓细胞体外培养中的应用.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2005/2007年在吉林大学和平校区及口腔医学院进行.材料:健康人正畸或阻生拔除的牙齿.方法:选取第三磨牙,取出牙髓,在少量DMEM培养液浸润下,将牙髓组织剪碎至1.0 mm×1.0 mm×0.5 mm组织块,将牙髓组织块移入含培养液的6孔板中.调整组织块密度至3～6块每孔,间距0.5cm均匀摆置.将6孔板倒置放入37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件的培养箱中,3h后翻转培养板,保持组织块贴壁生长,加培养液至2 mL后继续培养.4～6 d换液1次.细胞6～15 d从组织块边缘游出,在组织块周围形成生长晕.细胞渐进汇合时,以用0.25%的胰蛋白酶、0.02%EDTA的混合液消化2.0～3.0 min,按1:(2～3)的比例传代培养至25 mL培养瓶.原代培养细胞通过反复消化传代的方式逐渐获得纯化的成纤维样细胞.主要观察指标:采用免疫组织化学方法鉴定细胞形态,碱性磷酸酶值测定牙髓细胞分泌.MTT法绘制牙髓组织细胞生长曲线.结果:相差显微镜下,获得的牙髓细胞主要是典型成纤维细胞,形态多呈星形、长梭形,胞体丰满,胞浆均匀,核圆形或卵圆,核仁清晰.免疫组织化学检测显示,细胞表面波丝蛋白阳性、角蛋白阴性,碱性磷酸酶阳性.在接种于96孔平底培养板1 d后,细胞数量有所下降,但在接种2 d后数量又有所增加.此时细胞增加不很明显.4 d开始进入对数生长期,细胞增加显著,8 d进入平台期,9 d开始减少,整个细胞曲线呈"S"形.结论:采用组织块培养法从成体人牙髓组织中可以分离培养出细胞,在体外能有效增殖并保持低分化状态.     

胶原海绵支架体外构建组织工程膀胱黏膜

背景:组织工程膀胱黏膜层的构建在组织工程膀胱修复中占有重要的地位,但目前并没有最合理的构建方法。目的:探讨胶原海绵支架复合猪膀胱尿路上皮细胞体外构建膀胱黏膜结构的可行性。方法:刮取猪膀胱黏膜层后用酶消化方式进行猪膀胱尿路上皮细胞原代培养,并进行尿路上皮细胞标志物免疫荧光和RT-PCR鉴定。制备疏松多孔的胶原海绵支架材料,将第3代尿路上皮细胞接种在胶原海绵支架上,体外培养4～8d后观察尿路上皮细胞和胶原海绵材料的复合情况。结果与结论:原代培养的猪膀胱尿路上皮细胞呈"多角形"、"铺路石"样,以克隆团形式生长。免疫荧光鉴定AE1/AE3阳性,RT-RCR检测uroplakin-ⅠA、uroplakin-Ⅱ阳性。胶原海绵复合尿路上皮细胞体外培养4～8d后,细胞在胶原海绵支架上生长良好,覆盖胶原材料的表面并长入材料内部,保持了尿路上皮细胞的特性。体外培养6d时,尿路上皮细胞与胶原支架复合效果最好,同时细胞数量也最多。结果初步表明了胶原海绵复合膀胱尿路上皮细胞可以构建组织工程膀胱黏膜,且体外培养6d为最佳时间点。     

膀胱上皮细胞的体外原代培养方法

背景:国内外获得原代人正常膀胱上皮细胞的方法包括酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法,这些方法各有优缺点,培养基中成分多不易把握,效率不高。目的:分析人膀胱上皮细胞原代培养的最佳方法。方法:在同一实验条件下,采用酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法3种不同的原代细胞培养方法培养人正常膀胱黏膜膀胱上皮细胞。结果与结论:酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法各组膀胱上皮细胞培养成功率分别为13.3%,26.7%,86.7%,3组间比较差异有非常显著性意义(P<0.001)。3组培养的人膀胱上皮细胞角蛋白AE1/AE3荧光染色均呈阳性。说明组织块培养法是一种简单,短期内可扩增出较多纯净的膀胱上皮细胞的原代培养方法。     

大鼠肌源性干细胞的培养与鉴定

背景:肌源性干细胞是一种成体多能干细胞,已成为基因治疗和细胞介导的组织工程领域内的研究热点,临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁具有广泛前景。目的:探讨大鼠肌源性干细胞体外原代培养的方法,为临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁提供实验依据。设计:重复观察测量。单位:武汉大学人民医院生殖中心与泌尿外科。材料:实验于2003-12/2004-05在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。选取4～6周龄雌性SD大鼠20只,XI型胶原酶、胰酶、多聚赖氨酸(Sigma公司),dispase酶(Gibco公司),鸡胚提取液(自制)。方法:①将大鼠以质量浓度为10g/L的戊巴比妥钠30g/kg腹腔麻醉后,无菌条件下取腓肠肌,置入冷DMEM培养基中,D-Hank’s液洗涤组织块,除去筋膜、肌腱、神经和血管,剪成1.0～3.0mm3小块,移入离心管。向组织中加入0.2%XI型胶原酶及0.1%的胰酶,采用胶原酶分离大鼠骨骼肌细胞。②应用差速贴壁法大鼠骨骼肌细胞进行纯化。细胞筛网过滤后接种至多聚赖氨酸包被的培养瓶中,37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育1h,未贴壁细胞移入新的培养瓶中,加入新的培养基37℃培养1h后,未贴壁细胞再次转瓶换液,37℃培养过夜,如此反复,每次间隔24h转瓶换液,培养第5～6天贴壁的细胞即肌源性干细胞。③细胞生长到70%融合后,胰蛋白酶消化,以1∶2的比例进行传代。传代细胞消化后接种于放有盖玻片的6孔培养板中,加入生长培养基,24h后制备细胞爬片,采用免疫组织化学方法鉴定所培养细胞上特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1的表达。主要观察指标:肌源性干细胞的形态及其鉴定结果。结果:①肌源性干细胞的形态观察:从骨骼肌组织中分离出来的肌源性干细胞呈球形,折光性强。培养12h后开始贴壁仍为圆形,48h后贴壁完全并开始增生,细胞逐渐延展成梭形或纺锤形,有两极,体积小。随培养时间的延长,细胞相互融合形成成熟的多核肌管。②肌源性干细胞的鉴定结果:细胞特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1染色呈阳性,荧光显微镜可见细胞浆发出红色荧光,阳性率达90%。结论:肌原性干细胞属于成体干细胞,具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点。高纯度的肌原性干细胞可通过体外原代培养获取,免疫组化技术可鉴定其肌源性和干细胞特性,在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。     

骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质上的生长及分化

背景:传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱,并进行支架材料的双面种植,但由于平滑肌细胞取材培养困难,且体外传代有限,双面种植较为困难.目的:实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性.设计:基础实验研究.单位:中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心.材料:实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成.实验室级别为卫生部部属医院开放实验室.1月龄SD大鼠,雌雄不限,体质量80～100g,由中山大学实验动物中心提供.新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心.方法:采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,并应用流式细胞仪检测其表面抗原.采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质,并测定其纯度及特性.将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上,以添加25 ng/L血管内皮生长因子(VEGF165)的培养液进行体外、体内复合培养,检测其相容性.体内实验以细胞单独培养为对照,体外实验以未植入细胞的材料为对照,并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化,分别在4,8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查,并进行免疫组织化学角蛋白染色,检测上皮细胞再生情况.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性.结果:①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞,行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%.②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性,镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维.体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性,细胞生长状态良好.③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长,8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长.结论:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性,并且在体内与周围组织有良好的生物相容性,可以作为构建组织工程膀胱的材料.     

退变椎间盘的细胞培养

背景:目前尚未见成熟的成年人退行性变椎间盘的细胞培养模型报道,而此模型为建立椎间盘组织工程的细胞学基础.目的:建立成人椎间盘细胞培养模型,奠定椎间盘组织工程研究的细胞学基础.设计及地点:对比观察的细胞学实验,在山东省创伤骨科研究所完成.材料:标本来源于青岛大学附属医院骨科5例确诊为退行性椎间盘病变患者.L2..椎间盘1例,L4～5椎间盘3例,L5～S1椎间盘1例.方法:对5例取自腰椎间盘突出症退变椎间盘的手术标本,采用系列酶消化法细胞培养和组织块细胞培养两种方法,应用HAMF12培养基加体积分数为10%和20%的胎牛血清分别进行了细胞培养,均获得了传代,并对培养细胞进行了光镜和电镜的形态学观察.主要观察指标:①细胞生长状况.②光镜下细胞形态观察.③透射电镜超微结构观察.结果:酶消化法和组织块法均能获得大量的退变椎间盘细胞,并成功地进行细胞传代.培养细胞的分泌物质可能对细胞的生长起一定的限制作用,去除该物质后细胞可迅速增生.但在细胞生长及增殖过程中,体积分数为20%胎牛血清下细胞增殖速度明显高于体积分数为10%胎牛血清时的速度.全部退变椎间盘标本中均发现了脊索细胞.结论:成人退变椎间盘可以用来获得椎间盘组织工程所需的细胞.     

人脐带间充质干细胞高效分离的方法

背景：目前利用传统分离提取细胞的方法所获取的人脐带来源的间充质干细胞与脐带组织中所含人脐带来源的问充质干细胞的理论值相差甚远,造成脐带组织的极大浪费,阻碍了间充质干细胞的规模化制备培养。目的：建立一套高效分离人脐带间充质干细胞的方法,为间充质干细胞应用于临床提供技术方案。方法：实验分为4组,以传统酶法（胰酶与Ⅱ型胶原酶）为对照组,在此基础上,针对脐带结构分别逐一加入Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶、DNase来对脐带组织进行消化,各实验组设不同作用时间组,比较不同分离方法、不同作用时间所获得细胞数量、细胞活性、原代细胞贴壁出现时间、融合时间及所获得人脐带来源的间充质干细胞第3代细胞在增殖能力、表面标记与多向分化能力方面的差别。结果与结论：经Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase联合作用于脐带组织,4h细胞计数达到最高（12．47±0．16）×10^6/cm（P〈0．01）;活力为（75．00±5．07）％（P〈0.01）：收获的混合细胞中CD105阳性率及CD29阳性率均高于对照组;细胞贴壁及细胞团融合时间均较对照组缩短（P〈0．01）;伴随细胞的传代,形态逐渐均一,第3代细胞形态基本达到统一,呈梭形漩涡状生长;实验组P3人脐带来源的间充质干细胞特异性标记CD44,CD105,CD29阳性率阳性率均高于对照组,CD34阳性率低于对照组。向脂肪细胞诱导4周后,油红O染色鉴定可见细胞内大量脂滴：向成骨细胞诱导后,茜素红染色鉴定,大体观察可见阳性钙沉积。实验证明了Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase四酶联合消化脐带组织作用4h的方法缩短了分离细胞用时并显著提高了细胞产量、细胞活力以及细胞增殖能力,同时缩短原代细胞贴壁时间、融合时间。提取得到的原代细胞中间充质干细胞比例,第3代间充质干细胞细胞纯度较传统方法均有提高。     

膀胱微环境与膀胱癌腔内种植的关系

目的对膀胱癌腔内种植与膀胱黏膜微环境变化的关系进行初步研究。方法采用胰蛋白酶灌注膀胱的方法对Balb/c雌小鼠的膀胱黏膜进行损伤处理,并对损伤及未损伤组膀胱进行病理检查;ELISA法检测膀胱黏膜损伤与未损伤时小鼠膀胱CXCL12（SDF-1）含量的变化。通过观察Balb/c、nu/nu裸小鼠膀胱灌注肿瘤细胞后成瘤率对膀胱黏膜损伤与种植转移的关系进行评价。结果经0.25%胰蛋白酶损伤后饲养24h的小鼠的膀胱出现明显充血、水肿和炎症细胞浸润;胰蛋白酶损伤后的膀胱CXCL12（SDF-1）含量明显增加（P〈0.05）。出现膀胱黏膜损伤和炎症的裸小鼠膀胱腔内种植的发生率更高。结论膀胱黏膜损伤、炎症及趋化因子CXCL12（SDF-1）的高表达与膀胱癌腔内种植关系密切。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较(英文)

背景:通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的:对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法:①预损伤法:预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法:直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论:预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P>0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。