重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为（18.0±0.42）%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

脂质体介导人骨形态发生蛋白2基因转染对兔脂肪干细胞生长增殖的影响

背景:脂质体对细胞具有毒副作用,而外源性基因的胞内导入亦在细胞的代谢方面有所影响,因此脂质体介导人骨形态发生蛋白2基因转染脂肪干细胞对其在生长、增殖方面有无显著影响值得探讨.目的:观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白2基因转染对兔脂肪干细胞生长、增殖的影响.方法:从兔脂肪组织中提取脂肪干细胞,体外培养传代,取第4代细胞分别转染人骨形态发生蛋白2基因和增强型绿色荧光蛋白基因,倒置显微镜下连续观察转染后的细胞形态变化及生长情况.荧光显微镜下计数转染后48 h可发绿色荧光细胞的个数估算瞬时转染效率,MTT法绘制染后细胞的生长曲线,并计算群体倍增时间.结果与结论:转染后48 h,细胞体积变大,胞浆丰富,部分呈圆形或椭圆形改变.荧光显微镜下计数瞬时转染率为(18.0±0.42)%.MTT法绘制细胞生长曲线发现:转染后细胞较未转染的细胞生长速率略慢,但转染与未转染组细胞的生长曲线大致一样,均呈"S"形,且两者的总体趋势变化不大.转染后人骨形态发生蛋白2组的细胞群体倍增时间为55.51 h,EGFP组群体倍增时间约为53.58 h,未转染组的群体倍增时间46.10 h,差异无显著意义(P > 0.05).提示脂质体可以介导人骨形态发生蛋白2基因和绿色荧光蛋白基因转染兔脂肪干细胞,并对细胞的生长、增殖无明显影响.     

阳离子脂质体介导重组人骨形态发生蛋白-2基因转染的兔骨骼肌干细胞体外成骨分化的实验研究

目的初步探讨阳离子脂质体介导的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)基因对兔骨骼肌干细胞(SMSCs)体外成骨活性的影响。方法pEGFP-rhBMP-2的扩增、浓度及纯度鉴定。脂质体包裹质粒DNA，转染SMSCs后测定转染率。检测rhBMP-2、碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原的表达。结果脂质体介导pEGFP-rhBMP-2SMSCs转染后最大转染率为14．18％，rhBMP-2、ALP和Ⅰ型胶原的表达呈阳性，而pEGFP转染的细胞和未染细胞rhBMP-2、ALP和Ⅰ型胶原的表达弱阳性。结论SMSCs是一种较理想的骨组织工程种子细胞。脂质体介导质粒rhBMP-2的基因转移安全性好，但转染率相对较低。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞的定向分化

背景:在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有最著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果.骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想.目的:观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供.腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增.方法:胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组.各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100.主要观察指标:转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达.结果:与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明最增高(P<0.01),且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著.Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达.Westernblotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达.结论:大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞.     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景:在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚.目的:课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力.设计、时间及地点:细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成.材料:人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意.健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供.方法:从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组:pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组.转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染.主要观察指标:使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况.结果:转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性.pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P<0.05或0.01).结论:实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力.     

AdrhBMP-2转染兔骨骼肌干细胞体外诱导成骨修复骨缺损的实验

目的：评价腺病毒介导的重组人骨形态发生蛋白(AdrhBMP-2)基因对兔骨骼肌干细胞(skeletal muscle stem cells，SMSCs)体外成骨活性的影响．为临床应用于修复骨缺损提供实验依据方法：实验于2002-04／07在解放军总医院骨科研究所完成。腺病毒介导的基因转染和检测：在293细胞内扩增AdrhBMP-2及AdGFP，并用空斑形成实验测定滴度，实验分为3组：AdrhBMP-2转染细胞组，AdGFP转染细胞组，未转染细胞组从兔后肢股部骨骼肌内分离培养的干细胞经腺病毒转染后(MOI=50)观察转染率和转染后细胞牛物学的变化。腺病毒编码的rhBMP-2基因转染SMSCs后检测重组人骨形态发生蛋白(rhBMP)-2、碱性磷酸酶(atkaline phosphatanse，ALP)、Ⅰ型胶原和骨钙素的表达及钙结节的形成。结果：①腺病毒基因转染率为79％；SMSCs转染基因后3d增殖减慢，然后缓慢上升，7d进入增殖平缓期。②转染后第5天，免疫组化染色显示．AdrhBMP-2转染细胞组rhBMP-2阳性、ALP阳件、Ⅰ型胶原阳性，细胞转染AdGFP组和未转染细胞组上述指标染色呈弱阳性。③ArhBMP-2转染细胞后1-3d即开始表达rbBMP-2，13～15d达高峰，19—21d表达量明显减少。④AdrhBMP-2转染后第5天，ALP分泌量及骨钙素含量明显高于其他两组，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。⑤AtdrhBMP-2转染后第21天染色显示钙结节，其他两组未见钙结节形成。结论：①SMSCs取材易、来源广、增殖迅速。②AdrhBMP-2基因转染率较高，经其转染SMSCs有较强的诱导成骨能力，可成为一种新颖的修复大范围骨缺损的治疗方法。     

AdrhBMP-2转染兔骨骼肌干细胞体外诱导成骨修复骨缺损的实验

目的:评价腺病毒介导的重组人骨形态发生蛋白(AdrhBMP-2)基因对兔骨骼肌干细胞(skeletalmusclestemcells,SMSCs)体外成骨活性的影响,为临床应用于修复骨缺损提供实验依据。方法:实验于2002-04/07在解放军总医院骨科研究所完成。腺病毒介导的基因转染和检测:在293细胞内扩增AdrhBMP-2及AdGFP,并用空斑形成实验测定滴度。实验分为3组:AdrhBMP-2转染细胞组,AdGFP转染细胞组,未转染细胞组。从兔后肢股部骨骼肌内分离培养的干细胞经腺病毒转染后(MOI=50)观察转染率和转染后细胞生物学的变化。腺病毒编码的rhBMP-2基因转染SMSCs后检测重组人骨形态发生蛋白(rhBMP)-2、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原和骨钙素的表达及钙结节的形成。结果:①腺病毒基因转染率为79%;SMSCs转染基因后3d增殖减慢,然后缓慢上升,7d进入增殖平缓期。②转染后第5天,免疫组化染色显示AdrhBMP-2转染细胞组rhBMP-2阳性、ALP阳性、Ⅰ型胶原阳性,细胞转染AdGFP组和未转染细胞组上述指标染色呈弱阳性。③AdrhBMP-2转染细胞后1-3d即开始表达rhBMP-2,13～15d达高峰,19～21d表达量明显减少。④AdrhBMP-2转染后第5天,ALP分泌量及骨钙素含量明显高于其他两组,差异有显著性意义(P<0.05)。⑤AdrhBMP-2转染后第21天染色显示钙结节,其     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用，能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨，并最终导致新骨生成；碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质于细胞的软骨与骨的分化。目的：观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响，以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计：随机对照实验。单位：解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料：培养的兔骨髓间充质干细胞。方法：实验于2004-06／12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子（100μg／L人重组骨形态发生蛋白2，100μg／L碱性成纤维生长因子，100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子）和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法，碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节Von Kossa染色观察。主要观察指标：通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果：①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化，特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖，与对照组相比，细胞增值率提高近100％；虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响，但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论：碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子，两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成，可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

腺病毒介导骨形态蛋白9基因转染免脂肪干细胞

背景:已证实骨形态蛋白9是骨形态蛋白家族最具潜力的促骨分化生长的因子之一,目前国内在成骨方面对骨形态蛋白9的报道非常少.目的:探讨腺病毒介导的人骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞的可行性,及其转染后的成骨作用.设计、时间及地点:细胞摹因学体外观察,于2007-08/2008-08在重庆医科大学附属儿童医院儿研所外科研究室完成.材料:新西兰大白兔5只,由重庆医科大学实验动物中心提供.携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒载体由重庆医科大学附属儿童医院罗庆研究员构建并惠赠.方法:取兔颁后部脂肪组织,体外分离纯化脂肪干细胞.取生长良好的第3代细胞,以1×108 L-1密度接种于6孔板,转染组经感染复数为100的载有人骨形态蛋白9基因的腺病毒转染脂肪于细胞,并设立未转染对照组.主要观察指标:细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT-PCR检测转染后人骨形态蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜索红染色测定转染后成骨活性.结果:转染1周后细胞汇合呈铺路石状,2周后形成钙化结节:未转染对照组细胞形态较前无明显变化,无明显的钙化结节形成.与未转染对照组比较,转染组细胞停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长.脂肪干细胞转染骨形态蛋白9基因后12 h后即有荧光表达,转染3,6,9,12 d后人骨形态蛋白9 mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性.转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,钙茜素红染色可见钙化结节;未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达.结论:携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒可成功转染兔脂肪干细胞,转染后脂肪干细胞高表达骨形态蛋白9,且具有明显的成骨作用.     

骨形态发生蛋白2复合脂肪源性干细胞修复兔缺血性股骨头坏死

背景:骨形态发生蛋白2和脂肪源性干细胞都有很强的成骨能力,对于缺血性股骨头坏死的修复有重要意义.目的:观察骨形态发生蛋白2体内复合脂肪源性干细胞成骨治疗兔股骨头缺血坏死的疗效.方法:48只新西兰大白兔采用液氮冷冻法造模,随机分为对照组,髓芯减压组,脂肪源性干细胞组,骨形态发生蛋白2复合脂肪源性干细胞组.结果与结论:脂肪源性干细胞组与骨形态发生蛋白2复合脂肪源性干细胞组兔股骨头坏死区域的组织修复旺盛,新生骨小梁较多且逐步强化,X射线未见明显的囊性变和股骨头塌陷发生.在8周时骨形态发生蛋白2复合脂肪源性干细胞组骨小梁及骨髓组织生长较单纯脂肪源性干细胞组更旺盛.表明骨形态发生蛋白2因子复合脂肪源性干细胞植入股骨头坏死模型后成骨较多,修复坏死区域功能较强.     

家兔脂肪基质干细胞的分离培养及多向分化诱导

背景:脂肪基质干细胞在人体皮下脂肪中储备充足,体外能快速增殖,具有多向分化潜能,是目前组织工程种子细胞的研究热点.目的:体外分离培养家兔脂肪血管基质部分细胞,并验证其具有多分化潜能.方法:体外分离家兔脂肪血管基质部分细胞,在标准条件下培养,流式细胞仪检测第3代血管基质部分细胞表面标记物CD44,CD29,CD45,取第3代血管基质部分细胞进行成脂、成骨、成软骨诱导,油红O染色鉴定成脂诱导,碱性磷酸酶染色、茜索红染色,Von kossa染色鉴定成骨诱导,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Ⅱ型胶原mRNA RT-PCR检测鉴定成软骨诱导.结果与结论:原代血管基质部分细胞为短梭形和多角形,第3代血管基质部分细胞为长梭形,流式细胞仪检测提示CD44+,CD29+,CD45,成脂诱导组,染色油红O阳性,成骨诱导组,碱性磷酸酶染色、Vonkossa染色、茜素红染色阳性,成软骨诱导组,诱导14 d Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阿利新蓝染色阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA显示产物条带较未诱导前信号明显增强.提示体外分离培养的家兔血管基质部分细胞具有干细胞表型,具有向成骨、软骨、脂肪细胞分化的能力,初步鉴定为脂肪基质干细胞.     

脂肪干细胞体外诱导分化为平滑肌细胞的研究进展

脂肪干细胞是从脂肪组织中提取得到的一种干细胞,具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等多种细胞分化的潜能。将脂肪干细胞在一定的条件下诱导分化成为有功能的平滑肌细胞,为组织工程技术提供了理想的种子细胞。现就脂肪干细胞在体外诱导分化成为平滑肌细胞的研究进展进行综述。     

人脐血间充质干细胞的体外成骨

背景：用免疫细胞阴性筛选法可以排除造血干细胞对于间充质干细胞生长的影响,较快的获得具有表达间充质干细胞的细胞群。目的：探讨人脐静脉血间充质干细胞向成骨样细胞分化的能力。方法：用免疫磁珠阳性筛选法分离脐血间充质干细胞后进行培养。取P2代细胞行成骨诱导分化。结果与结论：人脐血间充质干细胞贴壁生长,长梭形,3周长满瓶底,传代后细胞增殖迅速。细胞表型为高表达CD44＋,CD29＋和CD166＋。在成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,Von-Kossa染色提示钙化结节形成。提示脐血间充质干细胞能够在体外分化为成骨样细胞。     

人脐血间充质干细胞的体外成骨

背景:用免疫细胞阴性筛选法可以排除造血干细胞对于间充质干细胞生长的影响,较快的获得具有表达间充质干细胞的细胞群。目的:探讨人脐静脉血间充质干细胞向成骨样细胞分化的能力。方法:用免疫磁珠阳性筛选法分离脐血间充质干细胞后进行培养。取P2代细胞行成骨诱导分化。结果与结论:人脐血间充质干细胞贴壁生长,长梭形,3周长满瓶底,传代后细胞增殖迅速。细胞表型为高表达CD44+,CD29+和CD166+。在成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,Von-Kossa染色提示钙化结节形成。提示脐血间充质干细胞能够在体外分化为成骨样细胞。     

转染癌基因的骨髓基质干细胞体外分化特征

目的:观察转染癌基因的骨髓基质干细胞在体外分化情况,为肝细胞癌的细胞源研究提供实验依据。方法:实验于2003-05/2004-06在南方医科大学药理教研室实验室完成。①两步法获取大鼠肝细胞,梯度离心法分离大鼠骨髓基质干细胞。②单基因转染是单独将c-myc或K-ras癌基因瞬时转染大鼠骨髓基质干细胞,6孔培养板中培养,24h后荧光显微镜下观察骨髓基质干细胞转染结果。双基因转染步骤相同,只是将c-myc和K-ras癌基因同时转染大鼠骨髓基质干细胞。③c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组常规培养,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱培养,每24h半量更换培养液。④c-myc癌基因转染 肝细胞组、K-ras癌基因转染 肝细胞组、双癌基因转染 肝细胞组将已转染癌基因的骨髓基质干细胞,置于叠加的培养板半透膜的上方(细胞密度均为1×105个/cm2),再将肝细胞置于半透膜的下方(每孔细胞密度为3×105/cm2)进行共培养,其余步骤同常规培养。⑤通过反转录聚合酶式反应和细胞免疫组化检测骨髓基质干细胞分化情况。结果:①癌基因转染24h骨髓基质干细胞检测结果:单独转染c-myc或K-ras癌基因的细胞,其绿色荧光蛋白呈均匀一致分布;双基因转染的细胞,绿色荧光蛋白呈点片状分布。②各组骨髓基质干细胞向肿瘤细胞分化检测结果:c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组的骨髓基质干细胞,均未向肿瘤细胞分化;c-myc癌基因转染 肝细胞组、K-ras癌基因转染 肝细胞组、双癌基因转染 肝细胞组的骨髓基质干细胞,均向肝细胞癌发展;空白对照组骨髓基质干细胞细胞均为阴性。此外,双癌基因转染 肝细胞组的骨髓基质干细胞分化增殖迅速,反转录聚合酶式反应和免疫组化检测发现,培养第7天出现甲胎蛋白表达,并迅速增加,而第7天出现的白蛋白和细胞角蛋白18表达迅速减弱,第14天消失。结论:转染癌基因的骨髓基质干细胞,在向肝细胞诱导的条件下,部分癌基因可以使干细胞分化为肝癌细胞;多癌基因转染时,更易于使干细胞分化为肝癌细胞。     

体外培养大鼠脂肪干细胞诱导分化为神经细胞

背景：脂肪间充质干细胞是一组具有多向分化潜能的干细胞,在不同诱导条件下可以向软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞分化,在一定条件下也可分化为神经干细胞。目的：研究大鼠脂肪间充质干细胞的体外培养及细胞表型,探讨其向神经细胞方向分化的能力。方法：取 SD 大鼠的腹股沟、附睾垫和腹膜后脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞,形态观察并进行传代。流式细胞仪检测第三四代细胞表型 CD29、CD44、CD45。利用碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子模拟神经细胞生长环境,使脂肪间充质干细胞向神经细胞方向分化,免疫荧光法检测诱导分化后神经细胞 nestin、NF-200、GFAP 的表达情况。结果与结论：从大鼠的脂肪组织中成功提取脂肪间充质干细胞,并能连续传代,稳定增殖,高表达 CD29（99.00±0.12）%,CD44（95.62±0.68）%,低表达 CD45（0.13±0.12）%。经无血清的神经因子诱导后,脂肪间充质干细胞可表达 nestin,加入血清后可表达 NF-200、GFAP。提示脂肪间充质干细胞具有强大的体外扩增能力,体外建立神经诱导环境后可定向分化为神经细胞的生物学特性,可为神经系统损伤、退行性疾病提供种子细胞。     

体外培养大鼠脂肪干细胞诱导分化为神经细胞

背景:脂肪间充质干细胞是一组具有多向分化潜能的干细胞,在不同诱导条件下可以向软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞分化,在一定条件下也可分化为神经干细胞。目的:研究大鼠脂肪间充质干细胞的体外培养及细胞表型,探讨其向神经细胞方向分化的能力。方法:取 SD 大鼠的腹股沟、附睾垫和腹膜后脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞,形态观察并进行传代。流式细胞仪检测第三四代细胞表型 CD29、CD44、CD45。利用碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子模拟神经细胞生长环境,使脂肪间充质干细胞向神经细胞方向分化,免疫荧光法检测诱导分化后神经细胞 nestin、NF-200、GFAP 的表达情况。结果与结论:从大鼠的脂肪组织中成功提取脂肪间充质干细胞,并能连续传代,稳定增殖,高表达 CD29(99.00±0.12)%,CD44(95.62±0.68)%,低表达 CD45(0.13±0.12)%。经无血清的神经因子诱导后,脂肪间充质干细胞可表达 nestin,加入血清后可表达 NF-200、GFAP。提示脂肪间充质干细胞具有强大的体外扩增能力,体外建立神经诱导环境后可定向分化为神经细胞的生物学特性,可为神经系统损伤、退行性疾病提供种子细胞。     

重组pcDNA3.1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达

目的:将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中,观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。方法:实验于2003-08/2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只,兔膝关节软骨切碎后取2.0～2.5kg软骨组织,进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物,复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418400mg/L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞,显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d,分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westernblot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。结果:①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况:家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶/Ⅱ型胶原酶进行消化,能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h,部分细胞开始贴壁生长,72h后分裂增殖,7d时细胞融合率为90%～100%。贴壁初期细胞呈圆形或三角形,以三角形为主,每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况:转染后的软骨细胞用G418筛选,4d转染效率约15%,阳性克隆细胞七八天融合率约为90%。G418连续筛选28d,阳性克隆细胞仍然存活,细胞融合率为100%。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞,G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果:聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,结果在1.3kb处可见DNA条带,作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果:在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Westernblot检测结果:可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果:转染7,28d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光,未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达。⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果:转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7,28d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色,未转染的软骨细胞未见BMP7表达。结论:用脂质体将pcDNA3.1-BMP7DNA质粒转染至兔关节软骨细胞,BMP7在关节软骨细胞中获得表达,为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础。