重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为（18.0±0.42）%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性

背景:脂肪间充质干细胞在转化生长因子β_1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞.然而,外源性转化生长因子β_1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷.因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β_1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义.目的:探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性.方法:利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β_1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率.结果与结论:重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β_1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β_1 mRNA和蛋白的表达上调.提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒.     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景:基因工程是目前软骨修复的主要方法,脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞.目的:探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学基因转染体外观察,于2006-03/2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成.材料:成年新西兰大白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供.含有全长人胰岛素样生长因子1 cDNA片段的质粒pcDNA3.1-hIGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠.方法:取兔颈后皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞.取传至第2代细胞,以0.5× 106/孔密度接种于6孔板,细胞融合至90%～95%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA3.1组、转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组,采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3.1-IGF-1转染,经G418筛选后培养4周.主要观察指标:采用RT-PCR及Western blot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况.结果:转染pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白表达,未转染组及转染空载体pcDNA3.1组无表达.细胞增殖曲线显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快.流式细胞仪检测显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加(P<0.05),G1期比例显著下降(P＜0.05).结论:质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖.     

真核表达载体pcDNA3.1/VEGF-B-EGFP的构建及在骨髓间质干细胞中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子B（vascular endothelial cell growth factor-B,VEGF-B）转染人骨髓间质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）的表达情况。方法将VEGF-B及编码增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,cDNA）序列通过扩增、酶切、插入pcDNA 3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP真核表达质粒,应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入MSCs（pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组）;应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应、蛋白印迹法检测VEGF-B的表达情况。结果 pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组重组质粒转染MSCs 24h后,荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,MSCs出现590bp目的基因;Western blot检测显示,在转染后MSCs中有VEGF-B表达。结论构建的VEGF-B真核表达质粒成功转染MSCs,为联合应用MSCs细胞移植和VEGF-B基因治疗心肌缺血的研究奠定了基础。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

脂质体介导人骨形态发生蛋白2基因转染对兔脂肪干细胞生长增殖的影响

背景:脂质体对细胞具有毒副作用,而外源性基因的胞内导入亦在细胞的代谢方面有所影响,因此脂质体介导人骨形态发生蛋白2基因转染脂肪干细胞对其在生长、增殖方面有无显著影响值得探讨.目的:观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白2基因转染对兔脂肪干细胞生长、增殖的影响.方法:从兔脂肪组织中提取脂肪干细胞,体外培养传代,取第4代细胞分别转染人骨形态发生蛋白2基因和增强型绿色荧光蛋白基因,倒置显微镜下连续观察转染后的细胞形态变化及生长情况.荧光显微镜下计数转染后48 h可发绿色荧光细胞的个数估算瞬时转染效率,MTT法绘制染后细胞的生长曲线,并计算群体倍增时间.结果与结论:转染后48 h,细胞体积变大,胞浆丰富,部分呈圆形或椭圆形改变.荧光显微镜下计数瞬时转染率为(18.0±0.42)%.MTT法绘制细胞生长曲线发现:转染后细胞较未转染的细胞生长速率略慢,但转染与未转染组细胞的生长曲线大致一样,均呈"S"形,且两者的总体趋势变化不大.转染后人骨形态发生蛋白2组的细胞群体倍增时间为55.51 h,EGFP组群体倍增时间约为53.58 h,未转染组的群体倍增时间46.10 h,差异无显著意义(P > 0.05).提示脂质体可以介导人骨形态发生蛋白2基因和绿色荧光蛋白基因转染兔脂肪干细胞,并对细胞的生长、增殖无明显影响.     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景:在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚.目的:课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力.设计、时间及地点:细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成.材料:人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意.健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供.方法:从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组:pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组.转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染.主要观察指标:使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况.结果:转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性.pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P<0.05或0.01).结论:实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力.     

重组pcDNA3．1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达

目的：将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中，观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。 方法：实验于2003-08／2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只，兔膝关节软骨切碎后取2．0-2．5kg软骨组织，进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物，复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418的正常培养液筛选转pcDNA3.1-BMP7质粒μg400mg／L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞，显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d，分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。 结果：①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况：家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶／Ⅱ型胶原酶进行消化，能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h，部分细胞开始贴壁生长，72h后分裂增殖，7d时细胞融合率为90％～100％。贴壁初期细胞呈圆形或三角形，以三角形为主，每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况：转染后的软骨细胞用G418筛选，4d转染效率约15％，阳性克隆细胞七八天融合率约为90％。G418连续筛选28d，阳性克隆细胞仍然存活，细胞融合率为100％。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞，G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果：聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，结果在1．3kb处可见DNA条带，作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果：在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Western blot检测结果：可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果：转染7，28d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光，未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达。⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果：转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7，28d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色，未转染的软骨细胞未见BMP7表达。 结论：用脂质体将pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒转染至兔关节软骨细胞。BMP7在关节软骨细胞中获得表达，为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础。     

关于阿尔茨海默病的机制研究: Mint2基因在 PC12细胞中的表达功能及其作用的初步研究

目的获得高表达 Mint2蛋白的 PC12稳定表达株,观察 Mint2蛋白对 PC12细胞形态的影响,深入研究阿尔茨海默病的发病机制. 方法用 PCR方法将 Mint2基因亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1A,构建真核表达载体 pcDNA3.1-AMint2;采用脂质体 lipofectamine2000介导,将重组载体转染入 PC12细胞, G418筛选稳定克隆;用 RT-PCR和 Westernblot检测外源基因 Mint2在 PC12细胞中的转录及表达,并观察 Mint2蛋白对 PC12细胞形态的影响. 结果成功构建了真核表达载体 pcDNA3.1-Mint2;并获得了稳定表达 Mint2蛋白的 PC12- Mint2基因工程细胞株; Mint2对 PC12细胞具有明显的促分化和促胞体增大的神经营养作用. 结论Mint2可在 PC12细胞中有效表达,目对 PC12细胞形态有明显影响,这为进一步研究 Mint2生物学功能及其作用机制奠定了基础.     

pcDNA3.1-bFGF真核表达载体的构建及其在犬骨髓基质干细胞中的表达

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。     

重组pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的构建与鉴定

背景:腺病毒临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的:将人骨形态发生蛋白9的cDNA构建于pcDNA4 His/Max,得到重组真核表达载体pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9。方法:将已有的Padtrack-cmv-人骨形态发生蛋白9进行PCR扩增,电泳回收人骨形态发生蛋白9片段,将pcDNA4 His/Max用NotⅠ和KpnⅠ双酶切,得到pcDNA4His/Max酶切片段,连接人骨形态发生蛋白9和pcDNA4 His/Max片段得到重组质粒pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9,将该载体用DH5α转化,阳性克隆扩增及纯化、序列分析鉴定。结果与结论:通过PCR及序列分析证明pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的人骨形态发生蛋白9基因长度为1.3kb,与报道的人骨形态发生蛋白9全长序列一致,无突变。结果证实,实验成功构建了pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体。     

HBV preS2真核载体的构建及其表达

【目的】扩增乙型肝炎病毒（HBV）前S2基因（preS2）,并构建其真核表达载体,为研究HBV树突状细胞疫苗奠定实验基础。【方法】从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBVDNA,用聚合酶链反应技术扩增全长preS2基因,将其克隆到真核载体pcDNA3．1（＋）上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定筛选阳性克隆,构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）preS2,并将其转染巨噬细胞48h后,ELISA检测细胞裂解液中preS2的表达。【结果】从慢性乙型肝炎患者血清抽提的DNA中扩增得到约860bp大小的目的片段,preS2基因片段正确插入pcDNA3．1（＋）载体,得到HBVpreS2真核表达载体pcDNA3．1（＋）-pre2。【结论】成功地构建了舍preS2基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-preS2,并能在巨噬细胞中表达目的蛋白HBVpreS2。     

大鼠骨髓间质干细胞可以成为PEX基因稳定转染的载体细胞吗?

背景:PEX基因能够干预恶性胶质瘤的侵袭行为,而骨髓间质干细胞是一种靶向肿瘤治疗的新型细胞载体.目的:建立稳定表达PEX基因的大鼠骨髓间质干细胞.方法:采用分子克隆技术构建PEX基因真核表达载体,酶切测序鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-PEX,并转染大鼠骨髓间质干细胞,免疫细胞化学法验证真核表达载体在骨髓间质干细胞中的表达.通过G418筛选建立稳定表达PEX基因的骨髓间质干细胞,并用RT-PCR法检测PEX基因的表达.结果与结论:实验成功构建稳定表达PEX基因的大鼠骨髓间质干细胞,基因水平和蛋白水平检测结果表明,PEX在转染的骨髓间质干细胞中呈高表达.     

LIF真核表达载体的构建及其在MSCs中的稳定表达

目的在人骨髓间充质干细胞内大量稳定的表达人白血病抑制因子（human Leukemia Inhibitory Factor,hLIF）。方法应用RT-PCR方法从人蜕膜组织中扩增出白血病抑制因子,并将其构建于pcDNA3．1真核表达载体上。利用脂质体进行基因骨髓间充质干细胞的转染。利用G418进行基因的稳定表达筛选。通过RT-PCR和Westernblot方法进行基因表达的检测。结果成功扩增出人白血病抑制因子基因,成功构建hLIF-pcDNA3．1真核表达载体。转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞经G418筛选,存活十代以上。经RT-PCR及Westernblot方法检测发现转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞表达白血病抑制因子明显高于未转染的骨髓间充质干细胞。结论成功构建LIF-pcDNA3．1的真核表达载体并使其在骨髓间充质干细胞得到稳定表达。     

人多形上皮黏蛋白与巨噬细胞集落刺激因子基因融合构建双基因多表位抗原的真核共表达质粒

背景：一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体，可提高转染和表达效率。目的：利用多形上皮黏蛋白（polymorphic epithelial mucin，MUC1）多肽骨架中含有许多连续重复系列，构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte macrophagehage colony stimulating factor，GM-CSF）基因重组的真核共表达质粒pcDNA3．1（＋）．MUC1-GM-CSF，并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。设计、时间及地点：基因重组体设计实验，于2005—09，2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成。材料：真核表达载体pcDNA3．1（＋）由英国Taylor-Papadimitriou教授惠赠，pGEM-3zf（-）-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及E．coli DH5α为自备，雌性BALB／c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体，酶叨鉴定及序列分析后，与GM—CSF基因克隆入pcDNA3．1（＋）真核表达载体中，构建真核共表达质粒pcDNA3．1（＋）-MUC1-GM—CSF。以重组质粒转染COS-7细胞。主要观察指标：通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果：酶切鉴定及序列分析表明，重绍质粒含育人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因，在COS-7细胞中可检测到MUC1表达，重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM—CSF抗体。结论：成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM—CSF基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒。     

酸敏感离子通道蛋白与组织型激肽释放酶相互作用的研究

目的：观察酸敏感离子通道蛋白（ASIC1a、ASIC2a）与组织型激肽释放酶（TK）之间是否存在相互作用。方法：RTPCR分别获得小鼠TK、ASIC1a、ASIC2a全长cDNA,将其克隆人真核表达载体pcDNA3．1／Myc—his中,脂质体法分别将pcDNA3．1-TK和pcDNA3．1-ASIC1a、pcDNA3．1-TK和pcDNA3．1-ASIC2a共转染至人胚胎肾细胞（HEK293T）,免疫共沉淀分别用抗Myc及抗TK抗体观察两者间有无相互作用。将ASICs融合蛋白与TK（100μg／mL）共孵育,SDS—PAGE分别用抗Myc及抗TK抗体检测蛋白表达。结果：pcDNA3．1TK和pcD—NA3．1-ASIC1a、pcDNA3．1-TK和pcDNA3．1-ASIC2a共转染后,SDS—PAGE显示抗TK抗体检测后在转染细胞内见有56kDa的TK条带出现,但抗Myc抗体作用未见ASICs目的条带出现。纯化的ASIC1a、ASIC2a融合蛋白与TK共孵育后,SDS—PAGE显示抗Myc抗体检测后在约66kDa处有融合蛋白表达条带,但抗TK抗体检测后在56kDa处无条带出现。结论：TK与ASIC1a、TK与ASIC2a之间无相互作用。     

构建含双顺反子绿色荧光蛋白标记人骨诱导形成蛋白2真核表达载体

背景:腺病毒虽可携带骨诱导形成蛋白2基因转染靶细胞促进其分泌诱导形成蛋白2,但容易出现一些免疫应答反应,以质粒为载体的转染实验应具有良好的前景.目的:验证构建绿色荧光蛋白标记的人骨诱导形成蛋白2真核表达载体的可行性.设计:单一样本观察.单位:天津医院.材料:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室(国家级)完成.含完整hBMP2基因片段的pcDNA3.1/CT-人骨诱导形成蛋白2质粒由李曦铭博士惠赠.双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS为Invivogen公司产品,Zeo购自Invivogen公司.pTA2(R)-T Easy为鼎国生物技术有限公司产品,限制性内切酶BamHI和NheI、T4 DNA连接酶(晶美生物工程有限公司),PCR上下游引物合成及测序(北京奧科生物技术有限责任公司).方法:以重组质粒pcDNA3.1/CT-人骨诱导形成蛋白2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法亚克隆出人骨诱导形成蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-人骨诱导形成蛋白2.主要观察指标:采用PCR法鉴定人骨诱导形成蛋白2序列,同时进行酶切及测序鉴定人骨诱导形成蛋白2是否克隆入pTA2-人骨诱导形成蛋白2重组质粒及真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS中.结果:PCR获得长度约1216bp的目的片段,经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的BMP2cDNA序列(NM-001200)100%匹配.结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白标记人骨诱导形成蛋白2真核表达载体.