血红素氧合酶1提高骨髓间充质干细胞在梗死后心脏的存活

背景：移植骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）修复梗死后心功能受到围移植期移植细胞大量死亡的限制。因此寻找一种保护因子对移植细胞提供保护至关重要。目的：观察血红素氧合酶1（heme oxygenase,HO-1）对BMSCs在梗死后心脏生存的影响。方法：体外分离扩增培养大鼠BMSCs,Adv-hHO-1、Adv-GFP分别转染,移植前DAPI标记。结扎左前降支1h后,分别将DAPI-hHO-1-BMSCs、DAPI-GFP-BMSCs多点注射到大鼠心脏梗死区周边,对照组注射等量PBS。结果与结论：Adv-hHO-1转染BMSCs后获稳定表达。仅hHO-1-BMSCs组稳定表达hHO-1 mRNA;hHO-1-BMSCs组血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子表达均高于其他两组（P〈0.01）;存活BMSCs数量在第3,7天均明显高于GFP-BMSCs组（P〈0.05）;大鼠心功能各项参数明显优于其他两组（P〈0.01）。移植4周后,HO-1-BMSCs组梗死区周边毛细血管密度明显高于GFP-BMSCs组和对照组（P〈0.01）,且胶原蛋白沉积减少,心室壁变厚,梗死面积较其他两组明显缩小（P〈0.01）。提示HO-1提高移植到梗死心脏BMSCs的存活,HO-1协同BMSCs抑制心室重构,改善心功能。     

血红素氧合酶1修饰骨髓间充质干细胞多点注射梗死灶周围对梗死后心肌结构重塑的影响

背景：研究表明血红素氧合酶1的过表达有抗炎症反应的作用,将血红素氧合酶1修饰的骨髓间充质干细胞（HO-1-BMSCs）移植入梗死心脏周围是否可调节基质金属蛋白酶/组织金属蛋白酶抑制剂的比例而明显改善梗死心肌重构呢？目的：观察血红素氧合酶1修饰的骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后心肌胶原的调节及心肌重塑的逆转作用。方法：利用血红素氧合酶1腺病毒转染体外培养扩增的骨髓间充质干细胞。结扎大鼠左前降支动脉制造心肌梗死模型,1h后,分别将HO-1-BMSCs、BMSCs多点注射到大鼠心脏梗死区四周,对照组注射等量磷酸盐缓冲液。结果与结论：Adv-hHO-1转染BMSCs后获稳定表达;hHO-1-mRNA仅在HO-1-BMSCs移植组表达;与对照组相比,HO-1-BMSCs移植组基质金属蛋白酶2/9的表达显著减少（P〈0.05）,Null-BMSCs组基质金属蛋白酶2/9的表达虽然减少,但差异无显著性意义（P〉0.05）;与对照组相比,细胞移植组金属蛋白酶组织抑制剂2/3的表达显著增加,尤以HO-1-BMSCs组明显（P〈0.05）;但金属蛋白酶组织抑制剂1无明显变化（P〉0.05）。金属蛋白酶组织抑制剂2/基质金属蛋白酶2和金属蛋白酶组织抑制剂3/基质金属蛋白酶9的比例在细胞移植的心脏中明显上升。与对照组比较,细胞移植组心室中的胶原蛋白沉积减少,心室腔内径显著缩小。结果表明血红素氧合酶1修饰的骨髓间充质干细胞移植可使基质金属蛋白酶/组织金属蛋白酶抑制剂的比例正常化,并逆转心肌细胞外基质的重构。     

血红素氧合酶1修饰骨髓间充质干细胞多点注射梗死灶周围对梗死后心肌结构重塑的影响

背景:研究表明血红素氧合酶1的过表达有抗炎症反应的作用,将血红素氧合酶1修饰的骨髓间充质干细胞(HO-1-BMSCs)移植入梗死心脏周围是否可调节基质金属蛋白酶/组织金属蛋白酶抑制剂的比例而明显改善梗死心肌重构呢?目的:观察血红素氧合酶1修饰的骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后心肌胶原的调节及心肌重塑的逆转作用。方法:利用血红素氧合酶1腺病毒转染体外培养扩增的骨髓间充质干细胞。结扎大鼠左前降支动脉制造心肌梗死模型,1h后,分别将HO-1-BMSCs、BMSCs多点注射到大鼠心脏梗死区四周,对照组注射等量磷酸盐缓冲液。结果与结论:Adv-hHO-1转染BMSCs后获稳定表达;hHO-1-mRNA仅在HO-1-BMSCs移植组表达;与对照组相比,HO-1-BMSCs移植组基质金属蛋白酶2/9的表达显著减少(P<0.05),Null-BMSCs组基质金属蛋白酶2/9的表达虽然减少,但差异无显著性意义(P>0.05);与对照组相比,细胞移植组金属蛋白酶组织抑制剂2/3的表达显著增加,尤以HO-1-BMSCs组明显(P<0.05);但金属蛋白酶组织抑制剂1无明显变化(P>0.05)。金属蛋白酶组织抑制剂2/基质金属蛋白酶2和金属蛋白酶组织抑制剂3/基质金属蛋白酶9的比例在细胞移植的心脏中明显上升。与对照组比较,细胞移植组心室中的胶原蛋白沉积减少,心室腔内径显著缩小。结果表明血红素氧合酶1修饰的骨髓间充质干细胞移植可使基质金属蛋白酶/组织金属蛋白酶抑制剂的比例正常化,并逆转心肌细胞外基质的重构。     

血红素氧合酶-1修饰骨髓间充质干细胞对大鼠梗死心肌炎症细胞因子及心室重构的影响

目的 探讨移植血红素氧合酶-1(Heme Oxygenase,HO-1)修饰的骨髓间充质干细胞(mes-enchymal stem cells,MSCs)对大鼠梗死心肌炎症细胞因子及心室重构的影响.方法 取大鼠骨髓,扩增培养MSCs;HO-1或GFP腺病毒转染、DAPI标记MSCs.结扎大鼠左前降支制造心肌梗死模型1 h后,分别将HO-1-MSCe、GFP-MSCs、PBS注射到大鼠心脏梗死区边缘,移植后第4天,Western Blot检测HO-1蛋白在梗死区边缘的表达,ELISA检测VEGF、bFGF、HGF的表达,RT-PCR检测炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA的表达.超声心动图检测大鼠心功能变化.移植4周后,梗死区心肌HE,Masson染色检测左室重构.结果 HO-1-MSCs移植组与GFP-MSCs、PBS移植组相比,HO-1蛋白在梗死区边缘稳定高效表达;细胞因子VEGF、bFGF、HGF表达增加(P<0.05);炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达减少(P<0.05),而IL-10 mRNA表达增加(P<0.05);左室舒张末期和收缩末期内径缩短,左室前壁增厚,心室腔减小,梗死区血管密度上调,胶原形成明显减少.结论 HO-1-MSCS分泌多种生物活性细胞因子,协同HO-1蛋白改善炎症微环境,促进血管生成,减少胶原形成,从而延缓梗死区心窒重构,有效改善心功能.     

骨髓基质细胞静脉移植治疗大鼠大脑中动脉梗死模型的研究

目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)静脉移植对脑缺血梗死大鼠的治疗作用和机制.方法 ①分离、培养、扩增、纯化雄性SD大鼠骨髓基质细胞,取第4代细胞进行Brdu标记,收集、调整浓度后备用.②采用Longa改良线栓法建立SD大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型.成模大鼠52只随机分为对照组和BMSCs治疗组,每组26只.③造模24 h后BMSCs治疗组经尾静脉注射3×106/ml的BMSCs,对照组则尾静脉注射等量PBS.④各组大鼠移植前及移植后1、7、14、21 d进行mNSS评分;移植后7、21 d各组随机取5只大鼠脑组织制作石蜡切片,行HE染色;免疫组织化学方法 检测脑组织中Brdu阳性细胞、血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 BMSCs移植组22只,对照组20只进入结果 分析.①mNSS评分,2组大鼠在术后1 d神经功能缺损评分最高,但差异无统计学意义(P>0.05).静脉植入细胞7 d后,BMSCs治疗组评分明显低于对照组[(6.92±0.98)分与(9.86±1.02)分,t=4.60,P<0.01)].静脉植入细胞14、21 d,神经功能缺损评分显示,BMSCs治疗组大鼠的神经功能比同时间点的对照组也有明显的恢复(P均<0.05).②HE染色显示移植7、21 d两个时间点,对照组坏死中心神经元大量缺失,胶质细胞增生明显;BMSCs治疗组神经元缺失减少,少量胶质细胞增生,可见微血管增生.缺血性病理改变明显减轻.③BMSCs治疗组缺血半球缺血周边区观察到Brdu阳性细胞,随时间延长逐渐减少(P<0.05).④免疫组化结果 显示,BMSCs治疗组缺血半球VEGF表达较对照组均明显增多(P<0.01).结论 经静脉途径移植BMSCs可显著促进脑缺血梗死大鼠的神经功能恢复,并明显减轻脑缺血性病理改变.移植细胞定位于缺血半球缺血边缘区,但随时间延长存活减少;BMSCs在蛋白和基因水平上均可促进成血管因子VEGF的表达,这可能是BMSCs治疗作用的重要机制之一.     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后炎性细胞因子表达的调节

目的:近来研究表明,骨髓间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,实验拟观察骨髓间充质干细胞移植对梗死心脏炎性细胞因子表达的影响,以进一步认识干细胞治疗心肌梗死的可能机制.方法:实验于2006-11/2007-08在中南大学湘雅二医院心内科实验室和实验动物中心完成.①实验材料:清洁级SD大鼠由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:提取体质量120～150 g SD大鼠骨髓间充质干细胞,以溴脱氧尿嘧啶核苷标记.取体质量180～200 g 雄性SD大鼠,结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型,将模型随机分为3组:假手术组:仅穿线不接扎血管;PBS溶液注射组:模型制作成功即刻心外膜注射PBS液;干细胞移植组:模型制作成功即刻心外膜注射溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞,每组8只.③实验评估:于术后1 ,28 d行心脏超声检测,测量大鼠射血分数、左室短轴缩短率和左室舒张末期直径以评价心脏功能,并进行免疫组织化学和western blot检测,分析移植细胞存活和炎性细胞因子的表达情况.结果:24只建模成功大鼠均进入结果分析.①术后28 d,心脏超声检测显示与注射PBS溶液相比,移植骨髓间充质干细胞可以延缓心室重构,改善心功能[射血分数:(30.76±3.39)%,(24.06±4.71)%,P < 0.05;左室短轴缩短率:(29.33±4.87)%,(23.05±3.94)%,P < 0.05;左室舒张末期直径:(6.45±0.47)mm,(7.81±0.31)mm,P < 0.05] .②免疫组织化学检测显示,心肌梗死后即刻心外膜移植的骨髓间充质干细胞可以在宿主体内存活.③与注射PBS溶液相比,骨髓间充质干细胞移植可以明显降低肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达(P < 0.05) ,同时增加白细胞介素10表达(P < 0.05) .western blot检测与免疫组织化学结果一致.结论:骨髓间充质干细胞移植可以延缓心肌梗死大鼠心室重构,同时下调大鼠梗死心脏促炎细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达,上调抗炎细胞因子白细胞介素10表达.     

大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌HCN2及HCN4基因的表达

背景:研究表明在多种心脏疾病后的心室肌中HCN2和HCN4表达异常,且与室性心律失常密切相关.骨髓间充质干细胞移植可修复受损心肌,但对梗死后心室离子通道重构的影响仍不清楚.目的:检测大鼠骨髓间充质干细胞移植入梗死心肌后左心室HCN2和HCN4的表达变化.方法:取3周龄SD大鼠5只,Percoll法分离培养骨髓间充质干细胞.成年健康雄性SD大鼠30只,随机分为4组:DMEM组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎,正常对照组不进行任何干预.造模后4周,DMEM组在梗死边缘区和中心区分5点注入DMEM培养液,细胞移植组同法注入第3代骨髓间充质干细胞悬液200 μL,细胞数5×10~6个.采用RT-PCR及Western-blot法检测左心室HCN2,HCN4在mRNA及蛋白水平的表达.结果与结论:正常心肌区:各组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达基本相似(P > 0.05).梗死边缘区:DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显多于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于DMEM组(P < 0.05).梗死中心区:DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达与DMEM组基本相似(P > 0.05).提示急性心肌梗死后梗死边缘区HCN2,HCN4基因在mRNA和蛋白水平的表达升高,骨髓间充质干细胞移植可能通过下调梗死边缘区HCN2,HCN4的表达来降低心律失常.     

骨髓基质细胞静脉移植对局灶性缺血再灌注损伤脑组织转化生长因子β1的影响

背景:骨髓基质细胞能透过血脑屏障在脑中存活并迁移至脑梗死区,而在脑梗死区转化生长因子β1的增加将有助于减轻神经元的损害.目的:观察静脉移植骨髓基质细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元转化生长因子β1的影响.设计、时间及地点:随机对照设计,于2005-09/2006-03在中国医科大学实验动物中心完成.材料:清洁级成年Wistar大鼠36只,随机分为模型对照组、盐水组、细胞移植组,12只/组.另取2月龄Wistar大鼠2只用于制备骨髓基质细胞.方法:贴壁法 胰蛋白酶消化分离培养骨髓基质细胞,传至3～5代用于实验,移植前24 h向培养基中加入BrdU进行体外标记.采用改良线栓法建立左侧大脑中动脉梗死大鼠模型,造模后24 h,细胞移植组于尾静脉输入浓度为3×109 L-1骨髓基质细胞悬液1 mL,盐水组尾静脉注射1 mL生理盐水,模型对照组不给予任何处理.主要观察指标:免疫组化染色检测BrdU阳性细胞及转化生长因子β1的表达,原位TUNEL法检测神经细胞凋亡情况.结果:造模后3 d,细胞移植组脑梗死灶周围可见大量BrdU阳性细胞,盐水组及模型对照组未见BrdU阳性细胞;细胞移植组转化生长因子β1的表达明显高于盐水组及模型对照组(P < 0.01);细胞移植组纹状体梗死区神经细胞凋亡数明显低于盐水组及模型对照组(P < 0.01).结论:经静脉移植的骨髓基质细胞可选择性进入脑缺血区,增强脑损伤区转化生长因子β1的表达,从而减少神经细胞的凋亡.     

静脉移植骨髓间质干细胞改善大鼠梗死心脏功能

目的:探讨经外周静脉途径移植骨髓间质干细胞治疗急性心肌梗死的有效性和可能的机制。方法:采用左前降支冠状动脉结扎术制备大鼠心肌梗死模型,24h后经尾静脉注入同种异体骨髓间质干细胞或磷酸缓冲液;分别于移植后3d和1个月取材,应用ELISA和免疫组化技术分析细胞移植对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,通过免疫组化染色观察移植细胞的分化情况并计数血管;超声心动图连续检测大鼠心功能在术后各时间点的变化。结果:细胞移植术后3d,移植组VEGF蛋白的表达量明显高于对照组(P<0.01),免疫组化显示移植组心脏的梗死区及其周边区域的细胞内VEGF阳性着色明显强于对照组,1个月时明显减弱。移植术后1个月,在部分移植细胞中检测到心肌细胞或血管内皮细胞特异性蛋白的表达,血管计数显示移植组血管数量较同期对照组增加1.4倍(P<0.01);同时移植组心功能较对照组明显改善(P<0.01)。结论:通过促进梗死周边缺血心肌的血管新生和移植细胞分化,骨髓间质干细胞经外周静脉移植可作为急性心肌梗死治疗的另一条有效路径。     

依贝沙坦对心肌梗死后大鼠心肌Smad表达及心室重构的影响

目的研究依贝沙坦对心肌梗死后大鼠心肌Smad表达及心室重构的影响.方法冠状动脉结扎建立大鼠心肌梗死(MI)模型,24 h后存活大鼠随机分为安慰剂组和依贝沙坦组,另设假手术组.8周后,测量心室重量/体重(HW/BW),非梗死区胶原含量,梗死区、非梗死区心肌转化生长因子(TGF)β1mRNA、Smad3 mRNA的表达,多普勒超声评价心脏功能.结果安慰剂组与假手术组比较HW/BW、左心室舒张末期内径(LVDd)、E/A比值、非梗死区胶原含量、梗死区及非梗死区FGFβ1 mRNA、Smad3 mBNA的表达均增加;射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、后壁(PW)增厚率均降低.依贝沙坦组与安慰剂组比较,上述指标显著改善.结论TGF-β-Smad传导通路可能参与MI后的心室重构,依贝沙坦可抑制Smad表达并减轻MI后左室重构.     

超声检测骨髓干细胞水凝胶制剂对实验兔心肌梗死后左心室功能恢复的研究

目的 应用超声检测家兔急性心肌梗死(AMI)模型骨髓干细胞水凝胶复合物注射前后心功能,评价该方法治疗心肌梗死的疗效.方法 56只兔建立左室前壁AMI模型,制备BrdU标记骨髓干细胞(BMSCs)水凝胶复合物.AMI后1周存活兔52只分为4组行梗死区心外膜注射:①处理组(A组),BrdU标记BMSCs水凝胶复合物;②阳性对照组(B组),BrdU标记BMSCs;③材料组(C组),BrdU标记后水凝胶;④空白组(D组),等量胎牛血清.分别于AMI造模前、AMI造模后1周及心外膜注射处理后4周对4组兔进行超声检查.常规超声心动图测定左室舒张末期内径(LVDd)、左室前壁舒张末期厚度(AW)、左室射血分数(LVEF),定量组织速度成像(QTVI)分析左室前壁、前室间隔基底段、中段收缩期峰值运动速度(Vs)及舒张早期峰值运动速度(VE).结果 与AMI造模前比较,AMI造模后1周4组AMI模型兔LVDd显著增大,AM厚度显著变薄,LVEF显著减低,梗死局部Vs、VE均显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).与AMI造模后1周比较,心外膜注射后4周材料组与空白组LVDd、AM厚度、LVEF及梗死局部Vs、VE无显著变化;处理组与阳性对照组LVDd显著减小,AM厚度显著增厚,LVEF及梗死局部Vs、VE显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05),以处理组变化更显著(P＜0.05).结论 骨髓干细胞水凝胶复合物可有效治疗心肌梗死,改善心肌梗死后左室重构及梗死局部收缩、舒张功能.     

心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存存怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用.设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成.材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300 g 6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用.取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组.主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平.结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后.部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞旱节律性跳动,晕心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性.对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变.其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性.结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟.     

人骨髓干细胞异体内诱导分化为肝细胞的实验

背景:如何获取来源丰富的高质量人源性肝细胞是生物人工肝和肝细胞移植共同面临的问题。骨髓干细胞在适当条件下可分化为肝细胞,为获取肝细胞提供了新的思路。目的:探讨人骨髓干细胞在大鼠体内诱导分化为肝细胞的方法,为解决临床肝脏移植和生物人工肝来源提供新的思路。设计:随机对照实验。单位:南方医科大学珠江医院普通外科。材料:实验于2004-05/2005-02在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。选取雄性清洁级SD大鼠40只,随机分为5组:单纯模型组、造模 人骨髓干细胞移植14d组、造模 人骨髓干细胞移植28d组、造模 CL-1细胞(人肝细胞系)移植14d组、造模 CL-1细胞(人肝细胞系)移植28d组,8只/组。方法:①5组均建立2-乙酰氨基芴 四氯化碳 环磷酰胺肝损伤模型。②利用治疗性肝再生策略,将人骨髓干细胞移植到大鼠肝脏内诱导分化为肝细胞。造模 人骨髓干细胞移植14d组移植人骨髓干细胞后观察14d,造模 人骨髓干细胞移植28d组移植人骨髓干细胞后观察28d,造模 CL-1细胞移植14d组移植CL-1细胞后观察14d,造模 CL-1细胞移植28d组移植CL-1细胞后观察28d,单纯模型组未进行细胞移植。③各组在正常状态下以及移植前后进行血清标本的采集与肝功能检测。应用免疫组化、聚合酶链反应法、实时荧光定量反转录聚合酶链反应技术检测各组大鼠肝脏内人白蛋白的mRNA的表达。主要观察指标:①人骨髓干细胞移植对大鼠肝功能转氨酶及总胆红素含量的影响。②各组大鼠病理切片肝细胞形态检查结果。③各组大鼠肝脏中人主要组织相容性抗原-Ⅰ类阳性率。④各组大鼠肝脏中大鼠Sox11序列、人Alu-sx序列、人白蛋白mRNA基因的表达。结果:实验选用40只大鼠,全部进入结果分析。①人骨髓干细胞移植对大鼠肝功能转氨酶及总胆红素含量的影响:各细胞移植组在正常状态以及细胞移植前与单纯模型组基本相似(P>0.05);与正常状态比较,细胞移植前各组均显著增高(P<0.01);与细胞移植前比较,各细胞移植组在细胞移植后均显著降低(P<0.01),但仍高于正常状态下的转氨酶、总胆红素含量(P<0.01)。②各组大鼠病理切片肝细胞形态检查结果:正常情况下肝脏病理切片显示肝细胞排列成条索状,围绕中央静脉成放射状排列,汇管区无炎性细胞浸润;单纯模型组呈大片状坏死表现;人骨髓干细胞移植组可见一些坏死后增生性改变;CL-1细胞移植组可见卵圆细胞以及小胆管增生。③各组大鼠肝脏中人主要组织相容性抗原-Ⅰ类阳性率:单纯模型组为0,造模 人骨髓干细胞移植14d组为(13.03±0.18)%,造模 人骨髓干细胞移植28d组为(9.47±0.46)%,造模 CL-1细胞移植14d组为(10.27±0.50)%,造模 CL-1细胞移植28d组为(9.84±0.23)%。④各组大鼠肝脏中基因序列聚合酶链反应检测结果:单纯模型组大鼠肝脏中只检测到大鼠Sox11序列;而人骨髓干细胞移植、CL-1细胞移植各时间组均可检测到人Alu-sx序列和大鼠Sox11序列。⑤各组大鼠肝脏组织实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测结果:单纯模型组大鼠肝脏组织中未检测到人白蛋白mRNA基因表达,人骨髓干细胞移植、CL-1细胞移植各时间组以及阳性对照均可检测到人白蛋白mRNA基因表达。结论:人骨髓干细胞移植能促进肝损伤大鼠的肝功能恢复,人源性细胞在肝损伤大鼠肝脏中的替代率约10%,提示人骨髓干细胞在异体内均可转化为肝细胞并可实现部分替代。     

人骨髓间充质干细胞移植促进脑梗死大鼠神经细胞再生和神经功能恢复

背景:有研究表明,骨髓间充质干细胞或神经干细胞同种移植可改善脑梗死模型鼠神经功能.目的:观察人骨髓间充质干细胞在移植大鼠脑神经功能梗死局部的内存活、迁移情况及神经细胞再生.方法:将人骨髓间充质干细胞经静脉注入免疫抑制的大脑中动脉闭塞模型大鼠,每周观察、记录移植大鼠的行为和神经功能状况(NSS评分、转棒实验);于移植后1~8周处死大鼠,采用免疫组织化学染色,免疫荧光染色和RT-PCR检测检测移植大鼠大脑人细胞核抗原、神经干细胞标志物(巢蛋白)及神经细胞标志物(神经元核心抗原、脑型微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白)的表达.结果与结论:骨髓间充质干细胞移植后2周,脑梗死模型鼠NSS评分明显降低(P < 0.05)、转棒实验停留时间明显延长(P < 0.01),神经功能得到改善(P < 0.05).人骨髓间充质干细胞移植后1~8周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回、梗死灶周围均可检测到人细胞核抗原阳性细胞.移植后一二周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回(CA1,CA3区)、梗死灶周围可见部分巢蛋白阳性细胞和mRNA表达,存续至8周.移植后2周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回、梗死灶周围可见部分神经元核心抗原、脑型微管蛋白阳性细胞和mRNA的表达.移植后4~8周,在海马、梗死灶周围可见少量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞和少量mRNA的表达.结果证实,静脉移植人骨髓间充质干细胞能在脑梗死模型大鼠脑内存活、并迁移至病变部位,继而分化为神经细胞,促进新生神经细胞的形成,改善移植大鼠的神经功能.     

miR-22修饰的骨髓间充质干细胞外泌体抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡

目的探讨miR-22修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌细胞凋亡的作用及其机制。方法扩增培养从SD大鼠骨髓中分离的BMSCs,将携带miR-22重组慢病毒载体及其阴性对照(miR-NC)载体分别转染至BMSCs,并提取转染后BMSCs的外泌体。将60只SD大鼠随机分为Sham组、AMI组、Exo BMSCs组、Exo BMSCs/miR-NC组和Exo BMSCs/miR-22组,每组12只。采用冠状动脉左前降支结扎术构建AMI大鼠模型,于心肌梗死区原位注射外泌体进行干预。干预72 h后,采用超声心动图监测大鼠心脏功能;TTC染色观察大鼠心肌梗死情况;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡水平;qRT-PCR检测心肌组织中miR-22及p53 mRNA表达水平;Western blot检测心肌组织中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶剪切体(Cleaved-caspase-3)及p53蛋白表达水平。结果与Sham组比较,AMI组大鼠心脏功能明显降低(P <0.05),心肌梗死面积(%:1.16±0.84 vs.38.68±5.31)和心肌细胞凋亡率(%:9.04±1.95 vs.66.70±5.92)明显增加(P <0.05),心肌组织中miR-22和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P <0.05),而p53、Bax和Cleavedcaspase-3等蛋白表达水平明显升高(P <0.05);与AMI组比较,各外泌体干预组大鼠心功能明显改善(P <0.05),心肌梗死面积(%:38.68±5.31 vs.23.54±3.94,22.33±4.12,13.79±2.25)和心肌细胞凋亡率(66.70±5.92 vs.43.73±3.39,42.67±2.87,30.73±2.97)明显降低(P <0.05),心肌组织中miR-22以及Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P <0.05),而p53、Bax和Cleaved-caspase-3等蛋白表达水平明显降低(P <0.05),其中Exo BMSCs/miR-22组大鼠各指标改善情况均优于Exo BMSCs组和Exo BMSCs/miR-NC组。结论 miR-22修饰的BMSCs外泌体可有效抑制p53介导的心肌细胞凋亡,从而改善AMI大鼠的心功能。     

不同途径骨髓间充质干细胞移植对颅脑损伤大鼠海马的作用

背景:近年来骨髓间充质干细胞移植在中枢神经系统中的应用越来越广泛,研究其最佳的移植方式具有重要意义。目的:观察不同途径移植骨髓间充质干细胞对创伤性脑损伤大鼠海马神经元的影响。方法:分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,以PKH26标记第3代骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察并流式细胞仪检测标记率;采用改进Feeney法制作脑损伤致海马神经元损伤模型。60只Wistar大鼠随机分为3组,脑损伤区移植组:造模后注射含骨髓间充质干细胞的生理盐水10μL;尾静脉移植组:自尾静脉注入含骨髓间充质干细胞的生理盐水1mL;创伤性脑损伤组:不给予任何处理。结果与结论:荧光显微镜观察PKH26标记的BMSCs呈球形,呈现均匀分布的红色荧光;PKH26标记BMSCs的阳性率>99%。脑损伤区移植组大鼠学习记忆功能明显好于其他两组,PKH26阳性细胞和苏木精-伊红染色切片中的神经元数量脑损伤区移植组多于尾静脉移植组,尾静脉移植组多于创伤性脑损伤组(P<0.05)。GAP-43mRNA的表达脑损伤区移植组高于尾静脉移植组,尾静脉移植组高于创伤性脑损伤组(P<0.05)。提示移植骨髓间充质干细胞对创伤性脑损伤大鼠海马神经元有保护作用,脑损伤区移植优于尾静脉移植。     

侧脑室移植骨髓基质细胞对脑缺血再灌注大鼠运动及认知功能的影响

背景:将骨髓基质细胞经侧脑室移植治疗大脑中动脉阻断缺血所致脑梗死模型鼠已取得一定效果,但尚未见对其认知功能的影响。目的:观察骨髓基质细胞侧脑室移植对大脑中动脉阻断缺血模型大鼠行为认知功能的影响,并观察脑梗死灶大小的变化和植入骨髓基质细胞的迁移路径。方法:制作SD大鼠大脑中动脉阻断缺血2h再灌注模型后随机分为3组,骨髓基质细胞组及磷酸缓冲液组分别于梗死侧侧脑室注射骨髓基质细胞悬液5μL(含约1.0×106个细胞)或等量的磷酸缓冲液,模型组和不造模的正常组不作任何处理。应用平衡木实验观察大鼠运动协调能力,水迷宫实验观察其游泳速度及空间学习记忆能力;苏木精-伊红染色观察梗死灶大小的变化,免疫组化观察BrdU阳性细胞的迁移路径。结果与结论:骨髓基质细胞组在移植后第3,7,14天平衡木评分均有显著改善(P<0.05)。移植后第7~10天,骨髓基质细胞组大鼠的游泳速度均快于磷酸缓冲液组(P<0.05)。骨髓基质细胞组大鼠寻找平台潜伏期的时间明显缩短(P<0.05),在原平台象限所占时间百分比和路程百分比及穿越平台次数明显增加(P<0.05)。移植后7,14d,各模型组大鼠苏木精伊红染色均可见典型的脑缺血梗死病灶,梗死面积百分比无明显差异。BrdU染色显示,移植后第1天,阳性细胞都聚集在移植侧侧脑室,以紧密排列的细胞团形式存在于脑室壁;第3天大部分细胞穿越脑室壁以单个细胞形式向周围缺血区迁移;第14天移植细胞在梗死的纹状体、皮质可见。提示大脑中动脉阻断缺血后24h侧脑室移植骨髓基质细胞可明显改善运动协调能力及空间学习记忆能力;移植骨髓基质细胞未能减小梗死灶大小,但侧脑室移植的骨髓基质细胞可存活并定向性地迁移至缺血的纹状体和皮质。     

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠坐骨神经挤压伤

背景:骨髓间充质干细胞体外分离培养方便,细胞免疫原性低,更适合于细胞移植,已有证实其在神经缺损修复方面具有较大的应用潜力.目的:明确体外培养的骨髓间充质干细胞体内移植后,促进大鼠周围神经损伤修复的可行性,并初步探讨其可能的作用机制.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/2007-03在吉林大学公共卫生学院毒理教研室完成.材料:选取健康雌性Wistar大鼠50只,鼠龄2个月;另选取出生1周的雌性Wistar大鼠6只用于制备骨髓间充质干细胞;实验用兔抗NGF单克隆抗体为Santa Cruz公司产品.方法:①采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,传至第3代,于移植前48 h加入BrdU进行标记.②取50只健康Wistar大鼠,利用钳夹法建立坐骨神经挤压伤模型后随机分为细胞移植组和对照组,每组25只,移植组将BrdU标记的骨髓间充质干细胞移植到神经损伤处,而对照组注入等量的DMEM.主要观察指标:①术后1,2,4,6周取移植组损伤段神经进行抗BrdU染色.②术后1,2,4,6周对两组损伤远端神经进行神经生长因子免疫组化染色,图像分析软件分析阳性表达的积分吸光度.③术后每周进行步态分析测量坐骨神经功能指数,术后6周测量再生神经传导速度、坚牢蓝染色后计数有髓神经纤维数目和内径、测量大鼠实验侧腓肠肌湿重和肌纤维横截面积.结果:全部50只实验大鼠均进入结果分析.①术后1,2,4周在细胞移植组神经损伤处可以检测到BrdU阳性细胞.②术后1和2周细胞移植组神经生长因子蛋白表达积分吸光度值均高于对照组,差异有显著性意义(P<0.01);而术后4,6周差异则无显著性意义(P>0.05).⑨术后3～6周细胞移植组坐各神经功能指数的恢复要优于对照组:术后6周细胞移植组大鼠的神经传导速度、有髓神经纤维计数和直径、腓肠肌湿重和横截面积均高于/大于对照组,差异有显著性意义(P<0.05～0.01).结论:体外培养的骨髓间充质干细胞可进行体内移植,移植后能在局部损伤微环境中发挥作用,促进周围神经损伤修复,提高早期神经生长因子表达是其机制之一.     

CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外体内的示踪观察

目的建立骨髓间充质干细胞（BMSCs）的一个简单、有效的标记和示踪方法并对BMSCs移植治疗心肌梗死作初步观察，为进一步的研究提供依据。方法应用CM—DiI细胞标记液标记第三代大鼠BMSCs，应用荧光显微镜对标记的细胞进行体外示踪观察；8只SD大鼠，制作急性心肌梗死模型，将已标记CM—DiI的BMSCs经心肌注射途径移植给急性心肌梗死模型大鼠，在移植后1周、2周、3周、4周分别取心肌组织行冰冻切片，并在荧光显微镜下观察移植细胞；于移植后4周应用免疫组织化学法检测移植细胞心肌缝隙连接蛋白43（connexin 43）的表达。结果CM-DiI标记大鼠BMSCs效率达100％，标记后BMSCs生长和增殖特性未受影响，形态无改变，经过传代培养14d仍然保持较清晰的红色荧光。已标记细胞在大鼠心梗模型心肌内移植后1周、2周、3周、4周，心肌组织冰冻切片可找到移植细胞，CM—DiI与BMSCs结合稳定，荧光标记效果维持一个月无明显衰退，免疫组化切片显示移植细胞少量表达connexin43。结论CM—DiI细胞标记液标记BMSCs，对细胞生长特性无影响，操作简单，标记效果好，BMSCs移植到梗死心肌4周后仍存活，并少量表达心肌特异性蛋白connexin43。CM—DiI标记细胞法可用于进一步的BMSCs移植治疗心肌梗死的研究。