苦参碱联合环孢素A减轻小鼠急性移植物抗宿主病

背景：苦参碱具有降低白细胞介素2浓度的作用,作为化疗辅助用药已用于临床。目的：探讨苦参碱联合环孢素A对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病发生发展的影响,及苦参碱可能的作用机制。方法：C57BL/6小鼠作为供鼠,BABL/C小鼠为受鼠,建立小鼠同种异基因骨髓移植模型。BALB/C受鼠随机分为7组：空白对照组、单纯照射组、骨髓移植组及足量环孢素A、半量环孢素A、足量苦参碱组、足量苦参碱联合半量环孢素A组。结果与结论：足量苦参碱联合半量环孢素A组小鼠生存时间明显长于其他组。进行骨髓移植的小鼠均出现不同程度病理改变,越早程度越重。移植后7d,与骨髓移植组比较,其他移植组小鼠血清γ-干扰素质量浓度下降,白细胞介素4质量浓度差异无显著性意义。提示,苦参碱能够减轻小鼠异基因骨髓移植后致死性急性移植物抗宿主病的发生,生存时间延长。苦参碱与环孢素A作用相似,二者联用,有协同作用。     

口服耐受与免疫抑制药物对移植后移植物抗宿主病抑制作用比较

背景:移植物抗宿主病是导致异基因外周血造血干细胞移植失败的主要原因,口服耐受是研究治疗移植物抗宿主病的新模式.目的:探讨骨髓移植前供鼠经口服受鼠脾淋巴细胞诱导耐受是否能增加异基因骨髓移植后受鼠对供者移植物的免疫耐受,从而减轻移植物抗宿主病,并与目前常用于预防移植物抗宿主病的免疫抑制药物比较作用效果.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在东南大学医学院中心实验室完成.材料:供鼠为雄性纯种近交系小鼠C57BL/6J(H-2~b),受鼠为雌性纯种近交系小鼠BALB/c(H-2~b).方法:用主要组织相容性抗原完全不合的纯种近交系小鼠建立异基因骨髓移植,移植物抗宿主病动物模型,小鼠共分5组,分别给予不同的急性移植物抗宿主病预防方案:①口服耐受组:移植前口服受鼠脾淋巴细胞相当于10 μg蛋白,隔天1次,共3次.②雷帕霉素组:1.5 mg/(kg·d)灌胃,从移植后第1天(+1 d)开始用药.③环孢索Al+甲氨蝶呤组:环孢素A 1.5 mg/(kg·d)腹腔注射,从移植后+1 d开始用药,当小鼠的胃肠功能逐渐恢复后,改为环孢素A 5 mg/(kg·d)灌胃,甲氨蝶呤0.4 mg/(kg·d)腹腔注射,移植后+1,+3,+6,+11 d用药.④空白对照组:移植后未用药.⑤辐照不移植组:照射后未予骨髓移植.主要观察指标:各组小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病的出现情况及免疫耐受指标差异.结果:移植后小鼠出现典型的移植物抗宿主病症状,空白对照组小鼠死亡高峰在移植后第14-18天,死亡率接近100%.口服耐受组、雷帕霉素组和环孢素A+甲氨蝶呤组小鼠急性移植物抗宿主病症状明显减轻,平均生存时间较空白对照组显著延长(P<0.05);小鼠急性移植物抗宿主病病理表现减轻,口服耐受组病理变化少于其他各组;流式细胞仪监测CD4~+/CD8~+比值增加,CD4~+CD25~+细胞增加,口服耐受组增加明显;ELISA检测移植物抗宿主病产生相应细胞因子减低,且口服耐受组明显减轻.MTT结果显示,口服耐受组免疫耐受显著增强,淋巴细胞增殖明显降低.结论:口服耐受可以显著抑制体外T淋巴细胞增殖效应,增强小鼠对骨髓移植的免疫耐受,减轻移植物抗宿主病症状和病理损害程度,延长平均生存时间;与目前常用于预防移植物抗宿主病的免疫抑制药物比较,减轻移植物抗宿主病的作用更强.     

小鼠移植物抗宿主病模型的建立

背景:小鼠移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植的主要并发症,表现为多系统损害(皮肤、食管、胃肠、肝脏等)的全身性疾病,是造成异基因造血干细胞移植后死亡的重要原因之一。目的:探讨建立小鼠移植物抗宿主病模型的方法,为实验性研究药物防治移植物抗宿主病提供有效的动物模型。方法:选择C57BL/6(H-2b)→BALB/C(H-2d)作为完全异基因移植供、受体。通过注射移植供鼠脾脏淋巴细胞及骨髓细胞数以建立移植物抗宿主病模型。根据临床表现、病理检查等判断移植物抗宿主病模型是否建立。结果与结论:给予5×106个以上的供鼠脾细胞的小鼠都发生了急性移植物抗宿主病,但小鼠移植物抗宿主病出现的时间、存活期不同。提示,输入5×106个供鼠脾细胞可有效建立移植物抗宿主病模型,小鼠异基因骨髓移植动物模型是可靠的,可用于移植物抗宿主病防治的实验性研究。     

小鼠移植物抗宿主病模型的建立

背景：小鼠移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植的主要并发症,表现为多系统损害（皮肤、食管、胃肠、肝脏等）的全身性疾病,是造成异基因造血干细胞移植后死亡的重要原因之一。目的：探讨建立小鼠移植物抗宿主病模型的方法,为实验性研究药物防治移植物抗宿主病提供有效的动物模型。方法：选择C57BL/6（H-2b）→BALB/C（H-2d）作为完全异基因移植供、受体。通过注射移植供鼠脾脏淋巴细胞及骨髓细胞数以建立移植物抗宿主病模型。根据临床表现、病理检查等判断移植物抗宿主病模型是否建立。结果与结论：给予5×106个以上的供鼠脾细胞的小鼠都发生了急性移植物抗宿主病,但小鼠移植物抗宿主病出现的时间、存活期不同。提示,输入5×106个供鼠脾细胞可有效建立移植物抗宿主病模型,小鼠异基因骨髓移植动物模型是可靠的,可用于移植物抗宿主病防治的实验性研究。     

TGF-β减轻异基因骨髓移植小鼠急性移植物抗宿主病

为了探讨转化生长因子β(TGF-β)对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病发生发展的影响,用C57BL/6小鼠作为供鼠,BABL/c小鼠为受鼠,建立小鼠同种异基因骨髓移植模型。BABL/c受鼠随机分为4组:空白对照组、单纯照射组、移植对照组和TGF-β实验组。TGF-β实验组于移植前2天至移植后7天每日皮下注射TGF-β1(1μg/kg)。结果显示:TGF-β实验组小鼠生存时间明显长于移植对照组(p<0.01),TGF-β实验组小鼠小肠、皮肤及肝脏GVHD病理改变明显轻于移植对照组。移植后7天TGF-β实验组小鼠血清IL-2浓度较空白对照组高,但远低于移植对照组;TGF-β实验组血清IL-10浓度明显高于移植对照组。结论:TGF-β能够减轻或抑制小鼠allo-BMT后致死性的aGVHD发生,提高移植后存活率。TGF-β可能使Th1细胞向Th2细胞偏移,抑制IL-2等Th1类细胞因子的分泌,同时促进了Th2类细胞因子IL-10的表达,降低aGVHD的发生。     

小鼠异基因骨髓移植继发急性移植物抗宿主病细胞因子的表达

背景:急性移植物抗宿主病仍然是限制异基因造血干细胞移植临床应用的主要障碍之一,已证实造成发病的首要因素是转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α、干扰素γ等分泌异常.目的:拟通过建立小鼠异基因骨髓移植模型诱导急性移植物抗宿主病反应,检测外周血血清中Th1及Th2型代表因子干扰素γ、白细胞介素4的表达水平,分析其与急性移植物抗宿主病严重程度的关系.设计、时间及地点:随机对照体内移植实验,于2005-08110在北京口腔医院动物部及首都医科大学附属北京友谊医院完成.材料:清洁级C57BL/6(H-2b)雄鼠20只作为供鼠用于制备骨髓细胞及脾脏淋巴细胞,BALB/c(H-2d)雌鼠50只作为受鼠,随机分为正常对照组10只、骨髓细胞移植组20只、混合移植组20只.方法:骨髓细胞移植组、混合移植组均给予总剂量9.0Gy的6MV-X射线照射,前者经尾静脉单纯输入异基因骨髓细胞2.0×107个,后者混合输入异基因骨髓细胞、脾脏淋巴细胞各2.0×107个.主要观察指标:记录小鼠生存时间,计数外周血白细胞,ELISA法测定移植后不同时间外周血血清中细胞因子水平,苏木精-伊红染色观察组织病理学变化.结果:骨髓细胞移植组从第8天开始出现死亡,混合移植组从第4天开始出现死亡.前者平均生存时间明显长于后者,Kaplan-Meier法检验P<0.05.移植后第7天,骨髓细胞移植组白细胞数明显低于混合移植组(P<0.05),第14,21天两组白细胞数比较差异无显著性意义(P>0.05).与骨髓细胞移植组比较,移植后第7,14天混合移植组白细胞介素4水平明显降低(P<0.05,P<0.01),干扰素γ水平明显升高(P<0.05).骨髓细胞移植组镜下可见肝细胞轻度变性,小肠有少量淋巴细胞浸润,病理分级为Ⅰ、Ⅱ级.混合移植组肝细胞呈不同程度的变性或坏死,小肠绒毛坏死脱落,黏膜下层大量淋巴细胞浸润,病理分级为Ⅲ-Ⅴ级.结论:随着急性移植物抗宿主病程度的加重,血清白细胞介素4水平明显下降,干扰素y水平显著升高,尤其在发病早期两种细胞因子变化更为明显.     

混合骨髓移植的实验研究

目的：探讨在异基因骨髓移植治疗白血病中既控制移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）又同时保留移植物抗白血病（ＧＶＬ）作用的移植方案。方法：采用近交系小鼠移植模型，在异基因骨髓、脾细胞移植物中混合一定比例的同基因脾细胞，观察移植后受鼠ＧＶＨＤ死亡率、脾结节数、移植后不同时间骨髓造血重建细胞来源以及受鼠脾脏淋巴细胞对供、受鼠双方来源的刺激细胞增殖反应；采用Ｌ６１５小鼠白血病模型观察混合移植对荷瘤小鼠生存时间及死亡原因的影响。结果：混合移植可以有效减轻ＧＶＨＤ，异基因造血免疫细胞在受鼠体内一过性存留并发挥移植物抗宿主反应，使荷瘤小鼠生存时间明显延长。结论：异基因骨髓、脾细胞移植物中混合一定比例的同基因脾细胞使移植受鼠体内既具有主要组织相容性抗原复合物（ＭＨＣ）不合的免疫活性细胞发挥一过性ＧＶＬ作用，同时减轻了异基因骨髓移植的严重ＧＶＨＤ。     

同基因造血干细胞移植免疫重建诱导小鼠皮肤移植耐受

背景：器官移植耐受的最佳效果是能够诱导对移植抗原的特异性免疫耐受。目的：探讨小鼠异基因皮肤移植后,通过受体同基因造血干细胞移植重建免疫系统诱导移植皮肤免疫耐受的可行性。方法：取BALB/c小鼠骨髓。以C57BL/6小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体,进行异基因皮肤移植;32只受体鼠随机均分为4组：移植对照组、环孢素A组、照射组和骨髓移植组。结果与结论：照射组小鼠10d内全部死亡,外周血白细胞数呈持续性降低;而骨髓移植组小鼠长期存活,白细胞数全身照射后6d降到最低,之后持续性增高,照射后21d与环孢素A组比较差异无显著性意义（P〉0.05）,移植皮肤存活时间显著长于其他各组（P〈0.01）,其淋巴细胞浸润及组织结构破坏明显减少,小鼠脾细胞对供体小鼠脾细胞增殖反应显著降低。说明同基因骨髓细胞移植重建免疫系统可显著延长小鼠移植皮肤存活时间,可诱导供者特异性免疫耐受。     

混合骨髓移植后过继免疫治疗小鼠白血病

背景:急性白血病自体造血干细胞移植后复发率高,异基因造血干细胞移植后移植相关病死率高,混合造血干细胞移植及移植后过继免疫治疗有可能取长补短,提高疗效.目的:观察自体骨髓混合H-2半相合异体骨髓移植后供体淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗对小鼠白血病的疗效.方法:将Balb/c小鼠经直线加速器照射3 Gy后分为白血病模型组、白血病模型照射组、混合移植组、自体骨髓移植组,均尾静脉注射5×105 K562(GFP+/NeoR+)或K562(GFP-/NeoR-)细胞.7 d后6 Gy照射,自体骨髓移植组移植自体骨髓细胞或联合白细胞介素2治疗;混合移植组移植小鼠自体骨髓细胞混合1/10的H-2半相合异体骨髓细胞后应用白细胞介素2或联合供体淋巴细胞输注治疗.4周后行小鼠外周血及骨髓细胞形态检查,外周血细胞亚群、GFP及NeoR基因测定,肝、脾匀浆细胞GFP和NeoR基因测定.结果与结论:白血病模型组小鼠因骨髓造血功能衰竭于20 d内全部死亡,白血病模型照射组小鼠因造血功能衰竭于14 d内全部死亡;自体骨髓移植组、混合移植组均有多少不等小鼠无白血病存活超过28 d,且混合骨髓移植后及自体骨髓移植后应用白细胞介素2治疗可提高白血病小鼠长期无病生存率,在此基础上联合供体淋巴细胞输注可更进一步提高白血病小鼠长期无病生存率.     

干细胞的生物学特性：异基因骨髓细胞防治小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病

目的:研究可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰的粒-巨噬细胞集落刺激因子短期培养的异基因骨髓细胞,对小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病的防治及与移植物抗白血病的关系.方法:实验于2002-06/2003-03在第二军医大学免疫研究所完成.选择纯种近交系C57BL/6小鼠作为供,BALB/c小鼠作为受,用^60Coγ射线照射后,随机分为5组,每组10只.①未处理组:接受照射后,尾静脉注射磷酸盐缓冲液.②移植物抗宿主病组:照射后移植骨髓细胞和脾细胞.③粒-巨噬细胞集落刺激因子组:照射后移植粒-巨噬细胞集落刺激因子培养的骨髓细胞和脾细胞.④LacZ基因修饰组:照射后移植粒-巨噬细胞集落刺激因子培养后LacZ基因修饰的骨髓细胞和脾细胞.⑤可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组:照射后移植粒-巨噬细胞集落刺激因子培养后可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰的骨髓细胞和脾细胞.经上述处理后主要观察:①各组小鼠生存期.②隔3日鼠尾静脉采血检测各组小鼠外周血白细胞的变化,以观察不同方法对造血功能恢复的影响.③各组小鼠脾脏淋巴细胞杀伤活性的改变.结果:纳入BALB/c小鼠50只,均进入结果分析.①小鼠生存期:可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组平均存活期较移植物抗宿主病组明显延长(35 d,12.5 d,P＜0.05).②小鼠脾脏淋巴细胞杀伤活性的改变:可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组小鼠脾脏淋巴细胞杀伤同种肿瘤细胞的活性明显高于LacZ基因修饰组和粒-巨噬细胞集落刺激因子组.③对造血功能恢复的影响:处理后各组小鼠外周血白细胞计数均明显降低.6 d白细胞开始逐渐回升,尤以移植粒-巨噬细胞集落刺激因子组、LacZ基因修饰组和可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组小鼠白细胞回升明显.结论:可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰的骨髓细胞能有效地抑制移植物抗宿主病的产生,有利于骨髓移植小鼠恢复造血功能.骨髓细胞异基因移植是一种有效防治移植物抗宿主病的新方法.     

基质金属蛋白酶抑制剂对小鼠急性移植物抗宿主病的预防作用

目的探讨基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)对小鼠异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的预防作用。方法用主要组织相容性复合物完全不相合的纯种近交系小鼠[供鼠为雌性 C57B/L6(H-2~b)鼠;受鼠为雄性 BALB/c(H-2~d)鼠]建立 allo-HSCT 后 aGVHD 动物模型。将小鼠随机分3组,给予 TIMP(A 组)、环孢菌素 A(CsA)(B 组)作为 GVHD 的预防方案。结果移植小鼠出现典型的 aGVHD 症状,未用 aGVHD 预防方案的移植小鼠(C 组)死亡高峰在移植后第5天～第7天,全部死亡。用 aGVHD 预防方案的 A 组和 B 组小鼠 aGVHD 症状明显减轻,平均生存时间较 C 组显著延长[分别延长(4.8±1.4) d 和(4.3±0.9)d,p<0.05]。不同 aGVHD 预防方案的移植小鼠之间,移植后外周血常规变化差异无统计学意义。应用预防方案后,移植小鼠 aGVHD 病理表现减轻。结论 TIMP 能有效预防小鼠 allo-HSCT 后 aGVHD,减轻其症状和病理损害程度,显著延长平均生存时间。TIMP 对造血干细胞植入和造血恢复无显著影响。     

TLR5激动剂鞭毛蛋白预防小鼠异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的初步研究

本研究旨在探讨Toll样受体(TLR5)激动剂鞭毛蛋白(flagellin)对小鼠异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的预防作用和可能作用机制。用主要组织相容性抗原完全不合的纯种近交系小鼠〔供体鼠:雄性C57BL∕6鼠;受体鼠:雌性BALB∕c鼠〕建立allo-HSCT的aGVHD动物模型。受鼠随机分为3组:鞭毛蛋白组,于移植前后2次尾静脉注射高纯度(纯度≥95%)的鞭毛蛋白50μl〔5μg∕(只.次)〕预防aGVHD;单纯移植组,移植后仅给予等容量PBS;单纯照射组,仅照射不移植,亦给予等容量PBS。观察比较移植后aGVHD的表现。结果表明,移植小鼠均出现典型的aGVHD症状,单纯移植组小鼠死亡高峰在移植后第4-5天。用鞭毛蛋白作为aGVHD预防方案小鼠的aGVHD症状明显减轻,平均生存时间较单纯移植组显著延长(P<0.05)。三组小鼠移植前外周血白细胞数比较均无显著性差异,但在照射后第14、21天,鞭毛蛋白组较单纯移植组外周血白细胞数显著性升高(P<0.05)。鞭毛蛋白预防组移植小鼠aGVHD病理表现较单纯移植组明显减轻。流式细胞仪检测鞭毛蛋白组与单纯移植组移植前后不同时间点Treg细胞/CD4+T细胞含量结果也表明,移植后2-4周鞭毛蛋白组小鼠的Treg细胞数较单纯移植组明显增加(P<0.05)。结论:鞭毛蛋白对小鼠allo-HSCT后发生aGVHD有预防作用,能减轻其症状和病理损害程度,显著延长其平均生存时间,其机制有可能通过增加移植后小鼠的Treg细胞含量,从而有效改善并减轻移植后小鼠aGVHD。     

TGF-β减轻异基因骨髓移植小鼠急性移植物抗宿主病

为了探讨转化生长因子β（TGF—β）对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病发生发展的影响，用C57BL／6小鼠作为供鼠，BABL/c小鼠为受鼠，建立小鼠同种异基因骨髓移植模型。BABL／c受鼠随机分为4组：空白对照组、单纯照射组、移植对照组和TGF—β实验组。TGF—β实验组于移植前2天至移植后7天每日皮下注射TGF—β1（1μg/kg）。结果显示：TGF-β实验组小鼠生存时间明显长于移植对照组（P〈0．01），TGF—β实验组小鼠小肠、皮肤及肝脏GVHD病理改变明显轻于移植对照组。移植后7天TGF—β实验组小鼠血清IL-2浓度较空白对照组高，但远低于移植对照组；TGF—β实验组血清IL—10浓度明显高于移植对照组。结论：TGF—β能够减轻或抑制小鼠allo—BMT后致死性的aGVHD发生，提高移植后存活率。TGF—β可能使Th1细胞向Th2细胞偏移，抑制IL-2等Th1类细胞因子的分泌，同时促进了Th2类细胞因子IL—10的表达，降低aGVHD的发生。     

环孢菌素A联合霉酚酸酯预防小鼠H-2半相合非清髓性骨髓移植后GVHD的发生

为探讨环孢菌素A(CSA)联合霉酚酸酯 (MMF)方案对小鼠主要组织相容性抗原 (H 2 )半相合非清髓性骨髓移植后急性移植物抗宿主病 (aGVHD)的预防作用 ,建立了H 2半相合小鼠 (供鼠为C5 7BL/6J,受鼠为C5 7BL/6J×BALB/C杂交F1代小鼠 )的非清髓性骨髓移植模型。采用CSA +MMF或CSA +MTX作为aGVHD预防方案 ,观察 5 0天 ,记录受鼠发生aGVHD情况。结果显示 ,未做aGVHD预防的小鼠在移植后 2 2 - 2 5天出现典型的aGVHD症状 ,aGVHD发生率为 75 % (15 /2 0 ) ,致死率为 10 0 % (15 /15 )。接受aGVHD预防的小鼠 ,aGVHD症状和病理表现均明显减轻 ,CSA +MTX方案组aGVHD发生率为 4 0 % (8/2 0 ) ,致死率为 6 2 .5 % (5 /8) ,CSA +MMF方案组aGVHD发生率为 30 % (6 /2 0 ) ,致死率为 5 0 % (3/6 ) ,均显著低于未预防组 (P <0 .0 5 ) ,但两预防组之间无显著性差异。结论 :CSA +MTX预防方案能有效降低H 2半相合非清髓性骨髓移植小鼠aGVHD的发生率和致死率 ,而CSA +MMF方案能进一步减轻aGVHD的症状及病理损害程度。     

Th17细胞在小鼠移植物抗宿主病发病早期中的作用

目的 探讨Th17细胞在急性移植物抗宿主病(aGVHD)发病早期的作用及机制.方法 以C57/B6为供鼠,BABL/c为受鼠,致死性全身照射(TBI)后输注供鼠骨髓细胞和脾细胞混合细胞悬液,建立小鼠aGVHD模型.实验分为4组:正常对照组;单纯照射组(IRD);异基因骨髓移植(alloBMT)+二甲基亚砜(DMSO)组;allo-BMT+常山酮(HF)组.从-1 d开始到+10 d,观察小鼠弓背、翘毛、体质量变化等aGVHD的表现并进行临床评分.动态观察小鼠aGVHD发生及存活情况.取小鼠的肝、小肠和皮肤进行病理学分析.用流式细胞术检测移植后小鼠Th1/Th17亚群的变化.结果 移植后实验组小鼠均发生aGVHD,allo-BMT+HF组小鼠aGVHD表现较allo-BMT+DMSO组小鼠严重.病理学分析示allo-BMT+HF组小鼠皮肤损伤较轻,而肝脏和小肠损伤较重,与allo-BMT+DMSO组比较,+6 d allo-BMT+HF组Th17细胞比例明显下降(分别为1.04%和0.71%),Th1比例明显升高(分别为5.35%和12.81%),Th1/Th17比值显著升高(P<0.05).结论 异基因造血干细胞移植早期阻断Th17导致Th1比例明显升高(5.31和18.07),加重aGVHD.

Abstract：

Objective To explore the role of Th17 cells in early onset of acute graft-versus-host disease(aGVHD) and its mechanism. Methods Mice aGVHD model was established by irradiated BABL/c mice inoculated with mixed suspension of C57BL/6 bone marrow cells and splenocytes. The mice were divided into 4 groups:①normal control,②irradiated group, ③allo-BMT + DMSO group,④allo-BMT + halofugine (HF) group. HF was given intraperitoneally at 5 μg per mouse from -1 d to + 10 d after allogeneic bone marrow transplantation(allo-BMT). Mice aGVHD symptoms and survival were observed. Th1/Th17 cells ratio was evaluated by flow cytometry. Results All the experimental groups ③ and ④developed aGVHD after transplantation. More severe aGVHD was observed in group ④than in group ③. HF prevented cutaneous aGVHD in all the mice, but augmented hepatic and small intestine GVHD. The percentage of Th17 cells and the ratio of Th1/Th17 were significantly higher while the percentage of Th1 cells was significantly lower in group ④ at day+6(P<0.05). Conclusion Early blockage of Th17 cell results in increase of Th1 cell percentage, which exacerbates aGVHD.     

昆明山海棠预防小鼠急性移植物抗宿主病的实验研究

目的观察昆明山海棠（THH）对急性移植物抗宿主病（aGVHD）小鼠血浆IFN-y、IL-4、IL-10浓度的影响，探讨THH预防aGVHD的可能机制。方法BALB／c受鼠清髓性预处理后输注C57BL／6供鼠的骨髓细胞和脾细胞混合液，建立aGVHD模型。实验分为4组：对照组（A组）、环孢素（CsA）预防组（B组）、THH预防组（C组）、THH和CsA联合预防组（D组）。观察aGVHD发生情况和受鼠嵌合体植入情况，ELISA法检测各组受鼠血浆IFN-y、IL-4、IL-10浓度。结果①B、c、D组受鼠血浆IFN-y的浓度明显低于A组（P〈0、05），D组下降最明显；IL-4浓度无明显变化；IL-10浓度均高于A组（P〈0．05），D组上升最明显；②A组受鼠移植后中位生存时间为9d，B、C、D组移植后中位生存时间均〉30d，较A组明显延长（P〈0．05）；③A组受鼠均有典型翘毛、弓背、腹泻、体重减轻表现，20d内全部死于GVHD；B、C、D组仅有翘毛、弓背表现，腹泻、体重减轻不明显；B、C组病理改变皮肤无异常，仅肝脏或小肠有少量淋巴细胞浸润；D组存活小鼠病理检查未见明显异常，均比A组轻；④B、C、D组受鼠＋30天骨髓细胞表面H-2^b分子百分率分别为（99．18±0．58）％、（97．68±0．59）％、（99、15±0．11）％。结论THH可以调节aGVHD小鼠细胞因子分泌，可用于aGVHD的预防，小剂量THH与CsA联合应用有协同作用，能减少CsA的用量。     

补体过度活化对急性移植物抗宿主病病理过程的影响

本研究通过建立小鼠急性移植物抗宿主病（aGVHD）模型,研究aGVHD发病过程中补体系统的活化对病理过程的影响。选用近交系C57BL/6（H-2Kb）小鼠和BALB/c（H-2Kd）小鼠作为实验动物。模型组以前者作为供鼠,后者作为受鼠,给予受鼠8Gy60Coγ线全身照射后4-6小时进行骨髓细胞＋脾细胞移植;对照组为同基因移植组。通过观察小鼠的体表特征、生存期以及体重变化跟踪模型组动物aGVHD的发生发展。采用流式细胞术鉴定移植后模型小鼠的基因型;运用酶联免疫吸附试验（ELISA）从蛋白水平检测整个发病过程中器官组织C3a、C5a等补体相关成分的分泌表达,同时运用荧光定量PCR技术从基因水平检测补体相关基因的表达变化;通过苏木精伊红（HE）染色对aGVHD所导致的组织损伤进行病理学分析,同时利用免疫荧光（IF）等实验技术检测补体相关成分在发病小鼠相应器官组织中的沉积,初步探讨其与组织病理损伤的内在联系。结果表明：模型组小鼠表现出典型的aGVHD特征：食欲下降、体重减轻、皱毛、弓背、活动减少、脱毛等;与对照组相比,模型组小鼠靶器官（肝脏）组织中补体相关成分的表达无论从蛋白水平还是基因水平上均有明显升高（p〈0.05）;组织病理学分析结果显示,模型组小鼠的靶器官组织中（肝脏的中央静脉和门管区）有显著的炎性细胞浸润,并且在浸润部位有明显的补体成分C3的沉积。结论：在小鼠aGVHD发病过程中,肝组织中的补体系统持续性地过度活化,产生的补体相关成分沉积于受损的肝组织内,沉积部位有明显的炎性细胞浸润,这说明补体系统的过度活化可能与aGVHD所导致的病理损伤有密切联系。     

硼替佐米对小鼠急性移植物抗宿主病作用及其机制研究

目的 探讨硼替佐米(Bortezomib)对小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)的预防作用及其机制.方法 建立小鼠aGVHD动物模型,将小鼠随机分3组,A:移植对照组;B:移植+早期输注硼替佐米组;C:移植+延期输注硼替佐米组.比较各组受鼠aGVHD临床及病理改变、生存率,流式细胞术检测移植后供鼠来源细胞(H-2b+)率.体外建立单向混合淋巴细胞培养(MLC)体系,植物血凝素刺激后,分别用0、2、4、8 nmol/L的硼替佐米作用于反应体系,在不同的时间点收集细胞,采用CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,ELISA法检测培养上清IL-2、IFN-γ、TNF-α含量.结果 移植对照组小鼠出现典型的aGVHD症状,3周内死于aGVHD,平均存活时间为16.1 d,移植加早期输注硼替佐米组小鼠aGVHD症状明显减轻,平均生存时间较移植对照组显著延长,60 d时生存率为70%,高于其他组(P<0.05),60 d时H-2b+细胞的百分率为(98.1±1.1)%.移植加延期输注硼替佐米组小鼠aGVHD症状明显较移植对照组加重,平均存活时间较A组缩短.硼替佐米对MLC体系细胞活性的抑制作用表现为剂量依赖关系,8 nmol/L硼替佐米作用24 h后细胞活性抑制率为(41.4±6.0)%;硼替佐米作用于细胞后12、24、36 h的凋亡率逐渐增加,8 nmol/L硼替佐米作用36 h后细胞凋亡率为(62.8±7.0)%;硼替佐米作用24 h后上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α浓度减少.结论 移植后早期输注硼替佐米可显著减轻小鼠异基因移植后的aGVHD、提高生存率,同时不影响骨髓植入;而移植后延期给予硼替佐米则加重aGVHD,导致受鼠死亡率增加.其机制可能是通过抑制淋巴细胞活性,诱导淋巴细胞凋亡,抑制同种反应性细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α.     

延迟连续骨髓移植对主要H-2不合小鼠移植后急性移植物抗宿主病的影响

目的 研究延迟连续骨髓移植对主要H-2不合小鼠移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响.方法 以近交系C57BL/6(H-2b)小鼠为供鼠、BALB/c(H-2d)小鼠为受鼠,受鼠接受总剂量为8.0 Gy 60Co γ射线全身照射(TBI)后,实验分为5组:①空白对照组(只输注0.4 ml RPMI 1640);②经典移植组(TBI后4 h输注);③连续移植组(TBI后4 h,1、2、3 d连续输注);④延迟移植组(TBI后4 d输注);⑤延迟连续移植组(TBI后4、5、6、7 d连续输注).移植后用流式细胞术检测各组受鼠H-2b细胞植入水平,ELISA法测定IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ的血浆浓度,比较各组的生存率、aGVHD发生情况及造血重建情况.结果 经典移植组出现典型aGVHD表现,均于3周内死亡,连续移植组、延迟移植组60 d生存率分别为30%、50%,延迟连续移植组出现aGVHD的小鼠数量少、程度轻,60 d存活率70%,高于其他组(P＜0.05).延迟移植组和延迟连续移植组血浆IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10分泌高峰较经典移植组延迟5～10 d,IL-4、IL-10的表达高于经典移植组(P＜0.05),IL-2、IFN-γ的表达低于经典移植组(P＜0.05).各组血浆IL-6浓度均于TBI后5～10 d达高峰,且经典移植组的表达高于其他组(P＜0.05).延迟连续移植组60 d时H-2b细胞的百分率为(98.1±1.1)%,20d时外周血白细胞计数恢复正常.结论 延迟连续骨髓移植可减轻小鼠异基因移植后的aGVHD,提高生存率,不影响骨髓植入和造血重建,是合适的移植方式,其减轻aGVHD机制可能与减少T细胞Ⅰ类细胞因子分泌,促进Ⅱ类细胞因子分泌有关.